血涂片的制备24.pdf

实验二 血涂片的制备 Preparation of Blood Smear 实验原理 使用推片将血液在载玻片制成血膜。试剂器材 载玻片（清洁、干燥、无尘、无油脂、25cm75cm，厚度 0.8mm1.2mm）、推片。操作步骤（1）采血 静脉采血后，使用玻璃棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一端 1cm 处加 1 滴（约 0.05ml）抗凝血，如果使用手指采血则直接用洁净玻片蘸 1 滴血。（2）推片 左手平执载玻片，或放在类似桌子等平坦地方，右手持推片从后方或前方接近血滴，使血液沿推片边缘展开成适当的宽度，立即将推片与载玻片呈 30。45。角，轻压推片边缘将血液推制成厚薄适宜的血涂片（图 1-6），血涂片应呈舌状，头、体、尾清晰可见。（3）干燥 将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。天气寒冷或潮湿时，应于 37 温箱中保温促干，以免细胞变形缩小。（4）标记 在载玻片的一端用记号笔编号。注意事项 1要制备良好的血细胞涂片，玻片必须干净。新购置的载玻片常带有游离碱质，必须用约 1mol/L HCl 浸泡 24h 后，再用清水彻底冲洗，擦干后备用。用过的载玻片可放入含适量肥皂或其他洗涤剂的清水中煮沸 20min，洗净，再用清水反复冲洗，蒸馏水最后浸洗后擦干备用。边缘破碎、玻面有划痕的玻片不能再用。使用玻片时，只能手持玻片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。2最好使用非抗凝血制备血涂片，也可用 EDTA 抗凝血制备。使用抗凝血标本时，应充分混匀后再涂片。抗凝血标本应在采集后 4h 内制备血涂片，时间过长可引起中性粒细胞和单核细胞的形态学改变。制片前标本不宜冷藏。涂片的厚度、长度与血滴的大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及红细胞比容有关。一般认为血滴大、血粘度高、推片角度大、速度快则血膜厚，反之则血膜薄。故针对不同病人应有的放矢，对血细胞比容高、血粘度高的病人应采用小血滴、小角度、慢推；而贫血患者则应采用大血滴、大角度、快推。3血膜应厚薄均匀适度，头尾及两侧有一定的空隙。如血膜面积太小，可观察的部分会受到局限，故应以在离开载玻片另一端 2cm 的地方结束涂抹为宜。一些体积特大的特殊细胞常在血膜的尾部出现，因此画线应注意保存血涂片尾部 细胞。4血涂片必须充分干燥后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色过程中容易脱落。实验评价 血涂片制备是血液学检查的重要基本技术之一。一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。血涂片制备时手工推片法用血量少、操作简单，是最广泛应用的方法。除可图 1-6 推片 获得满意的血涂片外，抗凝的血液病标本离心后取其灰白层涂片，可提高阳性检出率。此外，还可根据不同需要（如疟原虫、微丝蚴检查等）采用厚血涂片法。随着当今的自动化的发展，出现了自动血液涂片和染色装置。自动的血液涂抹装置主要有两类，一类是离心法，可以将少量细胞浓缩涂片；另一类是机械涂片法，其模拟手工涂片，适用于大量血涂片的制备。一般来说自动血液涂片装置可获得细胞分布均匀、形态完好的血片，但尚未普遍推广。思考题 从外观来判断，一张好的血涂片有哪些特征？血涂片的制备与染色 恒温箱保温促干,以免细胞变形缩小.3.涂片的厚薄、长度与血滴的大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及红细胞的比容有关.一般认为血滴大、角度大、速度快则血膜厚；反之则血膜薄.4.涂片应在 1h 内染色或在 1h 内用无水甲醇固定后染色.5.新购置的载玻片常带有游离碱质,必须用浓度约 1molLHCL 浸泡 24h 后,再用清水彻底冲洗.血涂片染色:瑞士染色法【原理】瑞士染色法使细胞既有化学亲和反应,有又物理吸附作用.各种细胞由于其化学成分不同,对酸性及碱性染料的结合力也不同,因此,染色后各种细胞呈现出各自的染色特点.【试剂】瑞士染液 液:瑞士染料 0.1g,甲醇 60.0ml 瑞士燃料有酸性燃料伊红和碱性染料美蓝的氧化物(天青)组成.将瑞士染料放入清洁干燥研钵里,先加少量的甲醇,充分研磨使燃染料溶解,将已溶解的染料倒入棕色试剂瓶中,未溶解的在加少量甲醇研磨,直至染料完全溶解,甲醇全部用完为止.配好后放入室温下,一周后即可使用.新配染液效果较差,放置时间延长,染色效果越好.久置应密封,以免甲醇挥发或氧化成甲酸.染液中也可加中性甘油 23ml,除可防止甲醇过早挥发外,也可使细胞着色清晰.步骤：采血，推片，干燥，标记，染色 1.采血准备工作：按摩，消毒，针刺，吸血，止血 2.推片:一张良好血涂片的要求：厚薄适宜，头体尾明显，细胞分布均匀，边缘整齐，两端和两边留有空隙 血涂片制备的注意事项：血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快，则血膜愈厚；反之，血涂片愈薄。针对不同患者应有的放矢，对血细胞比容高、血粘度高的患者宜采用小血滴、小角度、慢推；贫血患者则相反。引起血涂片分布不均的主要原因：推片边缘不整齐（毛刷状）用力不均匀（阶梯状）载片不清洁（有空泡）3.干燥：将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。天气寒冷或潮湿时，应于 37温箱中保温促干，以免细胞变形缩小 4.标记 5.染色：瑞氏染色法(Wrights stain)1.染液成分：美蓝（亚甲蓝）：M碱性染料 伊红（曙红）：E酸性染料 瑞氏染料：ME-ME（伊美中性物）甲醇：溶解染料；固定细胞形态；蛋白质呈颗粒或网状，增加细胞与染料的接触 2.染色原理：基本原理：物理吸附、化学亲和作用 碱性物质（Hb、嗜酸性颗粒）嗜酸性物质、染成粉红色（E）酸性物质（核蛋白、RNA）嗜碱性物质、染成蓝 或紫蓝色（M）中性颗粒（中性细胞胞浆）嗜中性物质、染成淡紫红色（ME）pH 的影响：H（pHPI）：蛋白质与酸性染料（E-）亲和力下降，增强美蓝着色，出现 蓝染 PBS 缓冲液：pH:6.46.8 以维持恒定的 pH 环境 3.染色方法 固定：滴加染液 3 5 滴，覆盖整个血膜固定细胞 0.51 min 染色：加 1 2 倍 PBS 缓冲液，混匀染 5 10min 冲洗：平衡摇动，于自来水龙头上平置冲洗（从一端开始），或加 PBS 缓冲液冲洗 4.染色结果 外观：淡紫红色 镜下：红细胞粉红色碟状白细胞胞核、胞浆及颗粒显示特有的染色特征 5.红细胞与中性粒细胞 红细胞:淡红色圆盘状，中央有生理性淡染区。中性粒细胞：细胞核染深紫红色，细胞质呈粉红色，含有许多细小的淡粉红色颗粒，淋巴细胞：细胞核染深紫红色，胞质少，仅在核的一侧见到少量淡蓝色胞质 注意事项：血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落；染色时间与染液浓度、室温及有核细胞多少有关，一般染液淡、室温低，有核细胞多，染色时间长。染液不能过少，以防蒸发沉淀；冲洗时不能先倒掉染液，应以细流水从一边开 始冲，防染料沉着，冲洗时间也不能长；染色过淡时可复染，复染时先将染料稀释好；染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色；分类最佳区域为体、尾交界处。第一节 流动的组织血液 血液 一、教学目标 1.描述血液的成分和主要功能。2.使用显微镜观察人血的永久涂片，尝试识别红细胞和白细胞。二、教学策略 血液对于每个学生来说既熟悉又陌生。说学生熟悉血液，是因为每个学生几乎都有流血、抽血和验血的经历，对血液的颜色等有一些感性的认识，还可以从报刊、杂志、电视和广播中获取到有关血液的信息。说学生对血液陌生，是因为学生大都不知道血液里到底含有哪些成分，以及每种成分各有什么功能。总之，学生对血液感到很新鲜，甚至有一些恐惧。因此，教师可以先让学生自由发言，交流各自对血液的认识，以激发学生的学习兴趣。然后，教师可以出示一张医院的血液化验单，让学生回忆和讨论血液化验的主要内容。教师可以将学生的回答记录在黑板上，为后面的教学做铺垫。当然，学生的回答往往不很全面，不很系统。这时，教师不要忙着补充，而是要及时评价学生从生活经验和课本外获取信息的能力，鼓励学生继续积极补充，再进行归纳，为下一步的教学打好基础。教师可以将课前准备好的血液分层演示装置(可以用鸡、鸭或家鸽的血，也可以用猪、牛或羊的血)演示给学生看，并让学生讨论资料分析中的 3 个问题。关于血浆，教师只需作简要的介绍。需要指出的是，水占了整个血浆的绝大部分，这可以为后面介绍无偿献血做铺垫。关于血细胞，教材的意图是让学生先通过显微镜观察人血的永久涂片，从感性上认识红细胞、白细胞的形态以及数量多少，然后从理性的角度进行学习，这样做可以激发学生自主学习、积极开动脑筋和主动求知的学习热情。在这一部分内容的教学中，教师介绍红细胞、白细胞和血小板的主要功能时，应该特别注意与生活实际中的一些问题相联系，如贫血、化脓和伤口处血液逐渐凝固等，这有助于调动学生的学习积极性，并加深学生对基础知识的理解和记忆。三、参考答案 资料分析 1.血液中含有不同的组成物，它们的质量不一样，所以，含有抗凝剂的血液离心或静置一段时间后，就会逐渐分成上下两层以及中间一薄层白色物质。2.血液是由上层的淡黄色半透明液体，下层深红色部分以及中间的很薄的一层白色物质组成的。红细胞和所含的血红蛋白在下层深红色的物质里，白细胞和血小板在中间很薄的一层白色物质中。3.血液中有大量的血细胞，这些细胞与血浆共同构成血液，完成物质运输等功能，因此，血液是一种组织，属于结缔组织。血液可以流动，因此称做“流动的组织”。实验 1.数量最多的是红细胞。2.红细胞呈两面凹的圆饼状，红色，数量多，不用染色就可以观察到；白细胞的个体比红细胞大，数量少，只有经过染色才能观察清楚。3.血小板比红细胞和白细胞小许多，并且需要进行特殊的染色，所以在光学显微镜下看不到血小板。练习 1.大量出汗时，血液主要丢失水分和一部分无机盐。通常采用喝水和适量补充无机盐的方法，来补充血液中丢失的这些成分。严重腹泻时，人体主要丢失水分、一部分无机盐和葡萄糖等营养物质。通常采用喝水、适量补充无机盐以及静脉滴注(或口服)葡萄糖溶液等方法来补充血液中丢失的这些成分。2.贫血患者的症状是：面色苍白并有头昏、乏力、心悸、气急等症状。血红蛋白是一种含铁的蛋白质，一般地说，贫血患者应当多吃一些含铁的食物和蛋白质丰富的食物。3.昆明属于高原地区，同平原地区相比，空气中氧的含量比较少。在这种环境下集训，可以增加足球运动员血液中血红蛋白的含量，从而增强足球运动员血液的供氧能力。4.白细胞吞噬了病菌和死亡的细胞后，自己也会死亡，所以白细胞的寿命比较短。四、背景资料 人血常规化验单说明表 下表是我国有关 RBC、WBC、Hb 和 PLT 的正常参考值和说明。检查项目 正常参考值 说明 英文缩写 中文名称 RBC 红细胞 计 数 男：(4.05.5)1012个/L 女：(3.55.0)1012个/L 人体在运动、饱食和缺氧等情况下，红细胞数会时增加。贫血时，红细胞数会明显减少。WBC 白细胞 计 数 (410)109个/L 人体在失血、剧痛、烧伤、炎症、白血病等，以女子月经、妊娠和分娩期时，白细胞数会明显增在药物中毒、骨髓造血机能损害等时，白细胞数明显减少。Hb 血红蛋白 男：120160 g/L 女：110150 g/L 贫血时，血红蛋白含量会明显减少。PLT 血小板 计 数 (100300)109个/L 血小板数过少，机体会异常出血。血小板数过多机体易形成血栓等。实验用血的采取 取血时必须注意两点：一是要取新鲜的血液；二是应该在取出的新鲜血液中立即加入一定量的抗凝剂，以免血液凝固。具体做法是：取一个试管，滴入几滴抗凝剂，如质量分数为 5%的柠檬酸钠溶液，再注入 35 mL(多注入数毫升，效果更明显)哺乳动物的血，轻轻震荡试管，使血与抗凝剂混合均匀。下面简单地介绍一下用心脏穿刺法从活家兔体内取血的方法。一个人用左手握住家兔的耳朵和前肢，用右手握住家兔的尾巴和后肢，将兔仰放在实验台上。另一个人用手摸出家兔心脏跳动最强的部位，剪去该处的兔毛，用酒精消毒，然后用消毒过的注射器(取血之前，要在注射器针管内注入一点儿抗凝剂，以免取出的兔血凝固)，刺入家兔的心脏抽取血液(约几毫升)。取血之后，家兔还可能正常活下去。取得的血待静置几小时以后，血细胞全部沉降下去，血浆浮在上面，血液就明显地分成血浆和血细胞两部分。红细胞、白细胞和血小板在人体内的种类、形态、大小、数目和作用 红细胞 成熟的红细胞没有细胞核，呈两面凹的圆饼状，平均直径只有 7.7 m，成年人每立方毫米血液里红细胞的数量，男子平均为 4.05.51012个L，女子平均为 3.55.01012个L。红细胞具有运输氧的功能，此外，红细胞还能运输一部分二氧化碳。白细胞 白细胞有多种，都有细胞核，比红细胞大，但数量少，每升血液里只有 410109个。有些白细胞可以吞噬病菌，对人体起着防御和保护的作用。人们根据白细胞里是否含有特殊染色颗粒，将白细胞分为粒细胞和无粒细胞两大类。粒细胞又可以根据所含的特殊颗粒染色性质的不同而分为嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。无粒细胞包括单核细胞和淋巴细胞。人体处在正常情况时，外周血液内各种白细胞的数量有一定的比例。人体发生炎症或其他疾病时，血液内白细胞的总数或白细胞分类百分比就会发生变化，所以白细胞的分类计数，常被用作诊断疾病的检查方法之一。现将正常人白细胞的分类计数和各种白细胞的主要功能列表(表 6)如下：表 6 正常人白细胞分类计数范围和各种白细胞的主要功能 名 称 百分比 主要功能 粒 细 胞 嗜中性粒细胞 5070 以变形运动方式，穿出小静脉壁，进入感染发炎的结缔组织中，吞噬和消化侵入人体的各种病菌，清除损伤和死亡的各种组织细胞。所以，急性感染时增多。嗜酸性粒细胞 35 与过敏反应有关，在过敏或有寄生虫病时增多。此外，它还与抗原抗体复合物有亲和力，并能吞噬抗原抗体复合物，消除复合物对组织的有害作用。嗜碱性粒01 能产生和贮存组织胺和肝素。与人体的过敏细胞 反应有关。无 粒 细 胞 淋巴细胞 2540 有变形运动的能力，在人体免疫过程中起重要作用。单核细胞 28 也有活跃的变形运动和吞噬活动，还能协助淋巴细胞在免疫中发挥作用。血小板 血小板比红细胞和白细胞都小得多，形状不规则，没有细胞核。每升血液中的含量为 100300103个，血小板有止血和加速凝血的作用。血红蛋白特性的观察(演示)取一试管加有抗凝剂的血液，待血细胞沉淀后，倒去上层的血浆和部分血细胞，观察留在试管内的红细胞呈暗红色。然后将试管倾斜放置，10 分钟以后，斜面的红细胞呈鲜红色，试管底部的红细胞仍为暗红色。说明血红蛋白与氧结合或分离的条件与周围环境中氧气的多少有关。斜面上的红细胞，在空气中已暴露了一段时间，红细胞中的血红蛋白与氧结合，形成了鲜红色的氧合血红蛋白，而试管底部的红细胞，接触空气少，仍呈暗红色。从上述现象来分析，血红蛋白的特性是：在氧浓度高的地方容易与氧结合；在氧浓度低的地方又容易与氧分离。贫血 贫血有缺铁性贫血和营养不良性贫血两种。缺铁性贫血 缺铁性贫血是由于人体内缺少铁元素，使红细胞中的血红蛋白含量减少而造成的一种贫血症。贫血时，患者表现出面色苍白，头晕，精神不振，身体消瘦，肌肉软弱无力，抗病能力差等症状。引起这类贫血有三方面原因：(1)生长快，对铁的需求量猛增。据估计，310 岁的儿童需铁 10 mg日，而到了青春期就高达 1518 mg日，比成人需要量高几倍。一旦铁的摄入量不足，就会引起缺铁；(2)因外伤而大量失血，或因钩虫病、肠息肉而慢性失血，以及女孩青春期出现月经初潮等，都会使体内贮铁量下降而缺铁；(3)因缺乏营养知识，膳食中铁的摄入量不足而缺铁。纠正缺铁性贫血除应及时彻底治愈造成失血的疾病以外，还应该增加铁的摄入量。增加铁的摄入量的关键在于饮食。贫血患者应该多吃一些含铁丰富的食物，如肝脏、动物血、瘦肉、豆腐、木耳、虾皮、海带等，这些食物都有助于治愈贫血症。营养不良性贫血 营养不良性贫血是由于体内缺乏维生素 B12和叶酸引起的。患者的血红蛋白浓度往往正常，但是红细胞的数量少，红细胞的体积比正常大。此病的主要症状是：口、唇、指甲等处明显苍白，皮肤蜡黄，颜面浮肿，精神状态差，反应迟钝，患者还常常合并缺铁性贫血。纠正营养不良性贫血的方法是：一旦确诊，可以在医生的指导下口服叶酸、维生素 C，并且肌肉注射维生素 B12，同时改善饮食，多吃牛肉、猪肝、绿叶蔬菜和水果等。还应该配合治疗缺铁性贫血，否则不会取得良好的疗效。血液凝固 血液由溶胶状态变为凝胶状态的血凝块，这一现象叫做血液凝固。血液流出人体血管就会发生凝固。血液凝固是一系列复杂的化学连锁反应的结果，其最后阶段是由原来溶解于血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白。纤维蛋白像细丝一样，在形成过程中相互交错重叠，并把血细胞网罗在内，使原来呈溶胶状态的血液逐渐变成凝胶状态的血凝块。血凝块形成以后，由于血小板收缩蛋白的收缩作用，使血凝块回缩变硬，同时析出淡黄色透明的液体血清。血管内循环着的血液一般不会发生凝固，主要原因是：(1)正常的心脏和血管的内膜光滑，不致发生血小板的破坏；(2)血液中有抗凝物质，如肝素是体内产生的一种较重要的抗凝物质。它可以抑制凝血酶原转变为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白；(3)血浆中还有使已形成的纤维蛋白溶解的物质，可以随时将血管内已形成的纤维蛋白溶解。人血涂片的制作 有条件的学校可以让学生制作人血涂片，以便认识红细胞和白细胞。所需材料和用具：脱脂棉，已消毒过的针和载玻片，体积分数为 75%的酒精。人血涂片的制作过程，可以按照下列各图(图 15)及对各图的说明进行。干细胞研究及其意义 分化后的细胞，往往由于高度分化而完全丧失了再分化的能力，这样的细胞最终将衰老和死亡。然而，动物体在发育的过程中，体内却始终保留了一部分未分化的细胞，这就是干细胞。干细胞又叫做起源细胞、万用细胞，是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。可以这样说，动物体就是通过干细胞的分裂来实现细胞的更新，从而保证动物体持续生长发育的。干细胞根据其分化潜能的大小，可以分为两类：全能干细胞和组织干细胞。前者可以分化、发育成完整的动物个体，后者则是一种或多种组织器官的起源细胞。人的胚胎干细胞可以发育成完整的人，所以属于全能干细胞。早在 19 世纪，发育生物学家就知道，卵细胞受精后很快就开始分裂，先是 1 个受精卵分裂成 2 个细胞，然后继续分裂，直至分裂成有 16 至 32 个细胞的细胞团，叫做桑椹胚。这时如果将组成桑椹胚的细胞一一分开，并分别植入到母体的子宫内，则每个细胞都可以发育成一个完整的胚胎。这种细胞就是胚胎干细胞，属于全能干细胞。骨髓、脐带、胎盘和脂肪中则可以获取组织干细胞。每个人的体内都有一些终生与自己相伴的干细胞。但是，人的年龄越大，干细胞就越少。为了弥补干细胞的不足，一些科学家建议从胚胎或胎儿以及其他动物身上获取干细胞。进行培养和研究。干细胞的用途非常广泛，涉及到医学的多个领域。目前，科学家已经能够在体外鉴别、分离、纯化、扩增和培养人体胚胎干细胞，并以这样的干细胞为“种子”，培育出一些人的组织器官。干细胞及其衍生组织器官的广泛临床应用，将产生一种全新的医疗技术，也就是再造人体正常的甚至年轻的组织器官，从而使人能够用上自己的或他人的干细胞或由干细胞所衍生出的新的组织器官，来替换自身病变的或衰老的组织器官。假如某位老年人能够使用上自己或他人婴幼儿时期或者青年时期保存起来的干细胞及其衍生组织器官，那么，这位老年人的寿命就可以得到明显的延长。美国科学杂志于 1999 年将干细胞研究列为世界十大科学成就的第一，排在人类基因组测序和克隆技术之前。新加坡国立大学医院和中央医院通过脐带血干细胞移植手术，根治了一名因家族遗传而患上严重的地中海贫血症的男童，这是世界上第一例移植非亲属的脐带血干细胞而使患者痊愈的手术。医生们认为，脐带血干细胞移植手术并不复杂，就像给患者输血一样。由于脐带血自身固有的特性，使得用脐带血干细胞进行移植比用骨髓进行移植更加有效。现在，利用造血干细胞移植技术已经逐渐成为治疗白血病、各种恶性肿瘤放化疗后引起的造血系统和免疫系统功能障碍等疾病的一种重要手段。科学家预言，用神经干细胞替代已被破坏的神经细胞，有望使因脊髓损伤而瘫痪的病人重新站立起来；不久的将来，失明、帕金森氏综合症、艾滋病、老年性痴呆、心肌梗塞和糖尿病等绝大多数疾病的患者，都可望借助干细胞移植手术获得康复。同胚胎干细胞相比，成人身体上的干细胞只能发育成 20 多种组织器官，而胚胎干细胞则能发育成几乎所有的组织器官。但是，如果从胚胎中提取干细胞，胚胎就会死亡。因此，伦理道理问题就成为当前胚胎干细胞研究的最大问题之一。美国政府明确反对破坏新的胚胎以获取胚胎干细胞，美国众议院甚至提出全面禁止胚胎干细胞克隆研究的法案。美国的一些科学家则对此提出了尖锐的批评，他们认为，将干细胞用于医学研究，在减轻患者痛苦方面很有潜力。如果浪费这样一个绝好的机会，结果将是悲剧性的。我国的干细胞研究和应用已经具备了一定的基础，早在 20 世纪 60 年代就开始了骨髓干细胞移植方面的研究，目前研究和应用得最多的是造血干细胞。1992 年，我国内地第一个骨髓移植非亲属供者登记组在北京成立，“中华骨髓库”也正式接受捐赠。2002 年，北京建立了脐带血干细胞库。关于胚胎干细胞的研究，我国目前还没有明确的法律规定。吉姆萨（Giemsa）染色法：吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞 胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。PH 对细胞染色有影响。细胞各种成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液 PH 而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色 偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。原文连接如下 a href=www.yeec/bbs/dispbbs.target=_blankwww.yeec/bbs/dispbbs./a.;ID=7459&page=3 一般性操作技术血涂片制备；细胞染色；显微检查；血液病诊断；染色不良；瑞特（Wright）染色法；酸性染料；伊红；碱性染料；亚甲蓝；吸附作用；PH 对细胞染色的影响；甲醇；吉姆（Giemsa）染色法春天要常用润肤剂，它含有松香油脂酸和丰富维生素 a，常用可加快皮肤血液循环，剌激面部细胞分泌，有效改善皮肤生理环境，减少气候对皮肤的危害。第二节 血涂片的制备和细胞染色 血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极为广泛，特别是对于各种血液病的诊断具有重要的价值，近年来血细胞分析仪的广泛应用，血涂片的观察也可作为判断仪器结果的简易方法。比台观察 10 个高倍视野血涂片中白细胞和血小板数大致估计血内这些细胞的数量，借以作为仪器结果分析后质控的参考。但积压涂片制备和染色不良，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论。例如，血膜过厚细胞重叠缩小，血膜太薄白细胞多集中于边缘，细胞分布不匀；染色偏酸或偏碱均可使细胞染色反应异常。因皮制备厚薄适宜，分布均匀，染色良好的血涂片是血液学检查的重要革本技术之一。血涂片制备方法及注意事项将在实习指导中详细介绍。1瑞特（Wright）染色法：为发观察细胞内部结构，识别各种细胞及其异常变化，血涂片必须嘲行染色。血涂片的各种染色方法大多是罗氏染色法衍变来的。目前常用瑞特染色法。（1）瑞特染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。即伊红和伊混合后，产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀，即瑞特染料。（2）细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞 胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。（3）PH 对细胞染色有影响。细胞各种成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液 PH 而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色 偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。新鲜配制的染料偏碱，须在室温或是 37下贮存一定时间，待染料成熟，主要是美蓝逐渐转变为天青 B 后才能使用，贮存时愈久，染色效果愈好。EAM GILLILAND 等采用吸光度比值作为顼特染液的质量规格。rA 测定方法如下：取瑞特染液 15-25l（视染液浓度而定），加甲醇 10ml 稀释，混匀后以甲醇为空折管，分别以波长 650nm 和 25nm 比色。Ra=a650/a525.因为美蓝吸收峰小组长为 650nm，伊红吸收峰波长为 525nm;天青 B 吸收峰也为 650nm 但吸光度 A 约为美蓝的一半。所以新配染料 rA 接近 2，随着美蓝逐渐氧化为天青 B，RA 也相应下降。RA 下降到 1.30.1 时即可使用。瑞特染液贮存过程中，必须塞严，以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。有人主张在配方中加入甘油 30ml，防止甲醇挥发，关可合细胞染色清晰。甲醇必须纯净，如甲醇中丙酮含量过多，染色偏酸，使白细胞着色不良。2吉姆萨（Giemsa）染色法：吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。但本法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更不清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。即以稀释吉姆萨液代替缓冲液，按瑞特染色法染 10min。或先用瑞特染色法染色后，再用稀释吉姆萨复染。血涂片的显微镜检查是血液细胞学血膜过厚细胞重叠缩小,血膜太薄白细胞多集中于边缘;染色良好的血片是血液学检查主要基本技术之一。瑞氏染色法原理 1.瑞氏染料是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。美蓝(又名亚甲蓝 mehyleneblue)为四甲基硫堇染料,有对醌型和邻醌型两种结构,通常为氯盐,即氯化美蓝，美蓝容易氧化为一,二,三甲基硫堇等次级染料(即天青)市售美蓝中部份已被氧化为天青.伊红(又名曙红 cosin)通常为钠盐即伊红化钠。美蓝和伊红水溶液混合后产生一种憎液性胶体伊红化美蓝中性沉淀,即瑞氏染料。瑞氏染料溶于甲醇后,又重新解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。细胞和细胞的各种成份化学性质不同对各种染色料的亲和力也不一样.因此用染色液染色后在同一血片上可以看到各种不同的色彩,例如血红蛋白嗜酸性颗粒为碱性蛋白质与酸性染料伊红结合染粉红色称为酸性物质,细胞核蛋白和淋巴细胞浆为酸性,与碱性染料美蓝或天青结合,染蓝色或紫色称为嗜碱性物质,中性颗粒成等电状态与伊红和美蓝均可结合,染紫红色称中性物质.实验材料、试剂 3.1 实验材料：医用采血针、酒精棉球、载玻片、血推片、消毒牙签 3.2 实验试剂：瑞氏染液、抗 B 血清、抗 A 血清、生理盐水、蒸馏水 3.3 仪器设备：Motic 光学显微镜 实验步骤 血清（抗 B）一滴加入左侧，用另一小滴管吸 B 型标准血清（抗 A）一滴加入右侧 15min后，观察有无凝集现象，并据此判断血型。新鲜蒸馏水,与染料混匀染色 5-10 分钟.白细胞分类计数。选择涂片的体尾交界处染色良好的区域,在油镜下计数 100 个红细胞,按其形态特征进行分类计数,求出各类细胞所占比值。1.瑞氏染液:瑞氏染料 1g 加甲醇(AR)600ML。将瑞氏染料放在清洁干燥乳钵中,加少量甲醇,充分研磨使染料溶解.将已完全溶解的部分倒入棕色试剂瓶中,未溶解部分再加少量甲醇研磨,直至染料完全溶解于甲醇为止。新配制的染料偏碱,须在室温和 37下一定时间待染料成熟,主要美蓝逐渐增多为天青 B 后才能使用.贮存时间越久染色效果越好,因此,Deamgilliland 等采用吸光度比值(rA)作为瑞氏染料的质量规格.rA 测定方法如下:取瑞氏染液 15-25ul(视染液浓度而定)加甲醇 10ml 稀释,混匀后以甲醇为空白管分别以波长650nm,525nm 比色,rA=A650/A525。因为美蓝吸收峰为波长 650nm,伊红吸收峰波长为 525nm,天青 B 吸收峰也为 650nm,但吸光度 A 约为美蓝的一半.所以新配制染料的 RA 接近 2,随着美蓝逐渐氧化为天青 B,RA 也相应下降,RA 下降达 1.3磷酸盐缓冲液(PH6.4-6.8)：磷酸二氢钾 0.3g 加磷酸氢二钠 0.2g 再加蒸馏水至 1000ml,配制成磷酸盐缓冲液调整 PH,如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。白细胞分类计数正常参考值 细胞类别成人 杆状核 0.01-0.05 分叶核 0.50-0.70 嗜酸性粒细胞 0.005-0.05 嗜碱性粒细胞 0-0.01 淋巴细胞 0.20-0.40 单核细胞 0.03-0.08 1 要避免重复计数,玻片应由血膜边缘向中央依次上下呈曲线移动.2白细胞总数超过20109/L,应分类计数200个细胞,白细胞数明显减少的血片,可检查多张血片。1)玻片的清洗：新玻片常有游离碱质,因此应用清洗液或 10%盐酸浸泡 24 小时,然后再彻底清洗。用过的玻片可放入适量肥皂水或合成洗涤剂的清水中煮沸 20 分钟,再用热水将肥皂和血膜洗去,用自来水反复冲洗,必要时再置 95%乙醇中浸泡 1 小时,然后擦干或烤干备用。使用玻片时只能手持玻片边缘,切勿触及玻片表面;,以保持玻片清洁,干燥,中性、无油腻。2)细胞染色对氢离子浓度十分敏感,在染色过程中玻片必须化学清洁,配制瑞氏染液必须用优质甲醇,稀释染液必须用缓冲液,冲洗用水应近中性,否则各种细胞染色反应异常,致使细胞的识别困难,甚至造成错误。3)一张良好的血片,要求厚薄适宜,头体尾分明,分布均匀,边缘整齐,两侧留有空隙。血片制好后最好立即固定染色,以免细胞溶解和发生退行性变。4)血膜未干透,细胞尚未牢固附在玻片上,在染色过程中容易脱落,因此血膜必需充分干燥.5)染色时间与染液浓度,室温高低,细胞多少有关.染液越淡,室温越低,细胞越多,所需染色时间越长或应适当增加染液量,因此染色时间应视具体情况而定.特别是更换新染料时必须经试染,摸索最佳染色条件.6)染液不可过少,以防蒸发干燥染料沉着于血片上难冲洗干净.7)冲洗时应用流水将染液冲去.不能先倒掉染液,以免染料沉着于血片上.8)染色过深可用甲醇或酒精适当脱色,最好不复染,必须复染时,可将染液先稀释好再复染.9)染色时应注意保护血膜尾部细胞,不能划掉.因为体积较大细胞常在此处出现.在正常情况下血膜外观为粉红色,在显微镜下红细胞呈肉红色；白细胞胞浆能显示各种细胞的特有色彩,细胞核染紫红色,染色质清楚,粗细松紧可辨。染色结果偏酸,则红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒偏红,白细胞核呈浅蓝色或不着色；染色结果偏碱,则所有细胞染成灰蓝色,颗粒深暗，嗜酸性颗粒可染成暗褐色,甚至紫黑色或蓝色。嗜中性颗粒偏粗,偏碱(紫黑色).血片原处呈绿色.