植物细胞器的分离3讲解.pdf

2 植物细胞器的分离 一、叶绿体的分离：1.实验原理：采用差速离心法，利用不同颗粒的大小形状不同导致沉降速率不同，把叶绿体的颗粒沉降出来。2.实验材料及试剂：成熟的猪笼草、山梨醇、Tris、EDTA 与-巯基乙醇均为 Amresco 产品、细胞器分离缓冲液:300 mmol/L 山梨醇,50mmol/L Tris-HCl(pH 为 8.0),5 mmol/L EDTA(pH 8.0),0.1%-巯基乙醇(临用前加入)。3.实验器材：SG350C 多功能食品料理机(上海天航电器有限公司),GL21M 高速冷冻离心机及配套的 2 号角转头(湘仪集团)表 1 叶绿体分离试剂配置 名称 使用浓度 配制体积 从母液吸取体积 母液浓度 称取 g 实际 g 母液体积 备注 山梨醇 0.3 mol/L 100ml 10ml 3mol/L 54.651 100mL Tris-HCl 0.05mol/L 0.05mol/L 100ml pH 8.0 EDTA 0.005 mol/L 100ml 1ml 0.5mol/L 14.6124 100mL pH 8.0-巯基乙醇 0.1%100ml 100ml 0.1%0.1 100ml 蔗糖 52%100ml 100ml 52%52 100ml 蔗糖 30%100ml 100ml 30%30 100ml EDTA 0.025 mol/L 100ml 100ml 2.5mol/L 73.062 100mL pH 8.8 EDTA 0.025 mol/L 100ml 100ml 2.5mol/L 73.062 100mL pH 8.0 计算过程：山梨醇：配制体积：100 mL，浓度：3 mol/L；分子量：182.17g/mol 需要称取质量 g:=100 mL*3 mol/L*182.17g/mol=0.1L*3 mol/L*182.17g/mol=54.651g EDTA:配置体积：100ml,浓度：0.5mol/lL,分子量：292.248g/mol m=0.5mol/L*100mL*292.248g/mol=14.6124 g LEDTA:配置体积:100ml 浓度：25mol/L,分子量：292.248g/mol m=2.5mol/L*100mL*292.248g/mol=73.062g 4.制备方法 4.1 叶绿体粗提物的制备（1）.取 25 g 叶片置于 100 mL 充分预冷的细胞器分离缓冲液中,用食品料理机匀浆 2 min(5000r/min),（2）.然后将匀浆液用 4 层纱布过滤于 500ml 烧杯,（3）.滤液于 4、700g 在 1000r/min 离心 10 min,（4）.弃去细胞核沉淀上清液再于 4、2 000 g 在 3000r/min 离心 10min,所得沉 2 淀即为叶绿体粗提物,（5）.将此粗提物悬浮于 7.5 mL 细胞器分离缓冲液中备用。4.2 密度梯度离心制备完整叶绿体（1）.用 50 mL 离心管制备蔗糖梯度,底部为 18 mL 含 52%(质量分数)的蔗糖,50 mmol/L Tris-HCl(pH 为 8.8),25 mmol/L EDTA(pH 为 8.8)的混合液,上面用 7 mL 含 30%蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl(pH 为 8.0)、25 mmol/L EDTA(pH为 8.0)的混合液覆盖。（2）.将上述所得叶绿体粗提取物小心覆盖于 30%的蔗糖上面,平衡后在 4、20 kr/min 离心 30 min。（3）.处于 52%蔗糖与 30%蔗糖界面上的绿色条带即为完整叶绿体。（4）.用加样枪小心吸出绿色的条带。5.叶绿体的显微鉴别：叶肉细胞中的叶绿体，散布于细胞质基质中，呈绿色，扁平的椭球形或球形可以在高倍显微镜（400600）下观察到它的形态和分布。二、线粒体的分离 1.实验原理：利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。2.实验材料及试剂：实验材料成熟的拟南芥，琼脂糖为杭州微生物试剂厂产品;牛血清蛋白(BSA)为上海试剂厂产品;DNase 和 RNase 为上海生物工程技术服务有限公司产品;溴化乙锭为 SerVa 公司产品;其余试剂均为国产分析纯.1TAE 电泳缓冲液(称取242 g Tris 溶于适量蒸馏水中,加入 57.1 mL 冰乙酸,100 mL 0.5molL1EDTA,pH=8.0,用蒸馏水定容至 1 L 即为 50TAE 转换为 1 TAE 稀 50 倍)缓冲液 A:蔗糖 0.5 molL-1,Tris-Cl 50mmol1,EDTA5mmolL-1,BSA 0.1%,PVP0.5%,0.1%-巯基乙醇,pH=7.5.缓冲液 B:蔗糖 0.5 molL-1,Tris-Cl 50mmolL-1,pH=7.5.缓冲液 C:蔗糖 0.6 molL-1,Tris-Cl 10mmolL-1,EDTA 20mmolL-1,pH=7.2.缓冲液 D:0.1 molL-1Tri-HCl(pH=8.0),0.05 molL-1EDTA(pH=8.0),0.1molL1NaCl,10%SDS,0.01molL-1-巯基乙醇.表 2 线粒体分离试剂配置 名称 使用浓度 配制体积 从母液吸取体积 母液浓度 称取 g 实际g 母液体积 备注 EDTA 0.5mol/L 100ml 100ml 0.5mol/L 14.6124 100mL Ph=8 缓冲液A 蔗糖 0.5 molL-1 100ml 100ml 0.5mol/L 17.115 100mL Tris-Cl 0.05mol1 100ml 10ml 0.5mol/L 6.057 100mL EDTA 0.005mol11L-1 100ml 1ml 0.5mol/L 14.6124 100mL BSA 0.1%100ml 100ml 0.1%0.1 100ml PVP 0.5%100ml 100ml 0.5%0.5 100ml -巯基乙醇 0.1%100ml 100ml 0.1%0.1 100ml pH=7.5 2 缓冲液B 蔗糖 0.5 molL-1 100ml 100ml 0.5mol/L 17.115 100ml Tris-Cl 0.05molL-1 100ml 10ml 0.5mol/L 6.057 100mL pH=7.5 缓冲液C 蔗糖 0.6 molL-1 100ml 100ml 0.6mol/L 20.538 100mL Tris-Cl 0.01molL-1 100ml 10ml 0.1mol/L 1.2114 100mL EDTA 0.02molL-1 100ml 10ml 0.2mol/L 5.845 100mL pH=7.2 缓冲液D Tri-HCl 0.1 molL-1 100ml 100ml 0.1mol/L 1.2114 100mL pH=8.0 EDTA 0.05molL-1 100ml 10ml 0.5mol/L 14.6124 100mL pH=8.0 NaCl 0.1 molL-1 100ml 100ml 0.1mol/L 0.5844 100mL SDS 10%100ml 100ml 10%10 100ml -巯基乙醇 0.01molL-1 100ml 10ml 0.1mol/L 0.7813 100mL 计算过程：EDTA：配置体积：100ml,浓度:0.5mol/L,分子量：292.248g/mol m=0.5mol/L*100mL/*292.248g/mol=14.6124g.蔗糖:配置体积：100ml,浓度：0.5mol/L,分子量:342.3g/mol m=0.5mol/L*100mL*342.3g/mol=17.115g.LTris-Cl:配置体积:100ml,浓度：0.5mol/L,分子量:121.14g/mol m=0.5mol/L*100ml*121.14g/mol=6.057g.蔗糖:配置体积：100ml,浓度：0.5mol/l,分子量:342.3g/mol m=0.5mol/L*100mL*342.3g/mol=17.115g.蔗糖:配置体积：100ml,浓度:0.6mol/L,分子量:342.3g/mol m=0.6mol/L*100mL*342.3g/mol=20.538g.Tris-Cl:配置体积：100ml,浓度：0.1mol/L,分子量:121.14g/mol m=0.1mol/L*100mL*121.14g/mol=1.2114g.EDTA:配置体积:100ml,浓度:0.2mol/l,分子量：292.248g/mol m=0.2mol/L*100mL*292.248g/mol=5.845g.NaCl:配置体积：100ml,浓度：0.1mol/L,分子量:58.44g/mol m=0.1mol/L*100mL*58.44g/mol=0.5844g.-巯基乙醇:配置体积：100ml,浓度：0.1mol/L,分子量：78.13g/mol m=0.1mol/L*100ml*78.13g/mol=0.7813g.3.实验仪器:超速冷冻离心机、制冰机、研钵(=15 cm)、无菌纱布、大离心管(50mL)、水浴锅、微量离心管(1.5 mL)、微量离心机(1.5mL 管)、-20冰箱、自动扩增仪、凝胶成像系统、紫外灯.4.实验方法:（1）.采集叶片 30 g 左右(采集前需暗培养2428 h,以减少叶片组织所含糖类的污染);(2).用蒸馏水洗涤 23 次,置研钵中(研钵提前预冷),加适量预冷缓冲液 A 和少量的石英砂在冰上研磨,直至缓冲液为深绿色;(3).用 6 层无菌纱布过滤匀浆组织(并用缓冲液 A 漂洗纱布),然后将磨碎组织放回研钵中重新研磨并过滤,2 次滤液合并,补加缓冲液 A 至 35mLg-1 试材,并将滤液分装于 4 个 50mL 无菌离心管中,1 000 g 离心 10m in,收集上清液;(4).将上清液 2 000 g 离心 10m in,再收集上清液于20 000 g离心 10m in 得到粗线 2 粒体沉淀,在粗线粒体沉淀中加入每管10mL 预冷的缓冲液 B 用软笔轻轻悬浮沉淀,注意应悬浮均匀后,将粗线粒体悬液 1 000 g 离心 10min;(5).收集上清液于同一 50mL 无菌离心管,加入 300L 1molL-1 的 MgCl2 至终浓度 0.01moL-1,和 5mgmL-1 的 DNase至终浓度 20gmL-1,冰浴放置 1.52 h,在冰浴液中加入1.5mL 0.5molL1 的 EDTA(pH=8.0)至终浓度 20mmolL-1;(6).将上述溶液小心铺于缓冲液 C 上(每管 25mL C 缓冲液),18 000 g 离心 20 m in;收集沉淀重新悬浮于装 20 mL 预冷缓冲液 C 的离心管中,18 000 g 离心 10m in,得到较纯的线粒体沉淀.以上操作均在 04条件下进行.5.显微鉴别:线粒体在光学显微镜一般呈短棒状或圆球状，但必须借助健那绿(Janus green B)染液,使得线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态.因此可以使活细胞中的线粒体呈现蓝绿色,而细胞质接近无色.线粒体能在健那绿染液中维持活性数小时,通过染色,可以在高倍显微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布.配制质量分数为 1%健那绿染液（将 0.5g 健那绿溶解于 50mL 生理盐水中,加温到 30-40摄氏度,使其充分溶解）.三、细胞核的分离:1.原生质体制备:（1）.取生长 34 d 的拟南芥悬浮系细胞 1 700 rpm 离心 3min.静置沉淀，（2）.用 0.4 mol L 甘露醇短暂洗涤后置于 20mL 酶解缓冲液(5mmol/LMES,6.8 mmol/LCaCl2,11 mmol/LKH2PO4,0.3mol/LMannitol,0.3mol/Lsorbitol,0.4%PVP-K30,2%cellulast,0.5%Macerozyme,pH5.7)酶解 4.5 h.名称 使用浓度 配制体积 从母液吸取体积 母液浓度 称取 g 实 际g 母液体积 备注 甘露醇 0.4mol/L 20ml 20ml 0.4mol/L 7.2868 100mL MES 2-(N-吗啡啉）乙磺酸 0.005 mol/L 20ml 0.2ml 0.5mol/L 10.6625 100mL CaCl2 0.0068 mol/L 20ml 0.2ml 0.68mol/L 7.54664 100mL KH2PO4 0.011 mol/L 20ml 2ml 0.11mol/L 1.497 100mL Mannitol 甘露醇 0.3mol/L 20ml 20ml 0.3mol/L 5.4651 100mL Sorbitol 山梨糖醇 0.3mol/L 20ml 20ml 0.3mol/L 5.4651 100mL PVP-K30 0.4%0.4%0.4 100ml Cellulast 纤维素酶 2%2%2 100ml Macerozyme 浸解酶 0.5%0.5%0.5 100ml Ph=5.7 计算过程：2 甘露醇:配制体积：100ml,浓度：0.4mol/l,分子量:182.17g/mol m=0.4mol/L*100ml*182.17g/mol=7.2868g.MES:配置体积：100ml,浓度:0.5mol/L,分子量:213.25g/mol m=0.5mol/L*100ml*213.25g/mol=10.6625g.CaCl2:配置体积:100ml,浓度：0.68mol/L,分子量：110.98g/mol m=0.68mol/L*100mL*110.98g/mol=7.54664g.KH2PO4:配置体积：100ml,浓度：0.11mol/L,分子量：136.09g/mol m=0.11mol/L*100mL*136.09g/mol=1.497g.Mannitol 甘露醇:配置体积：100ml,浓度：0.3mol/L,分子量:182.17g/mol m=0.3mol/L*100mL*182.17g/mol=5.4651g.Sorbitol 山梨糖醇:配制体积：100ml,浓度：0.3mol/L,分子量：182.17g/mol m=0.3mol/L*100ml*182.17g/mol=5.4651g.PVP-K30:m=(50g*0.4%)/(1-0.4%)=0.2008g.(3).摇床设定 70 rpm,28.三层纱布过滤一次,(4).滤液经 1 700 rpm 离心 3min,去上清，(5).用洗涤缓冲液(5 mmol/LMES,0.2mol/Lsorbitol,0.2mol/LManmitol(pH5.7)洗涤2 次即可得到分散均匀的原生质体.名称 使用浓度 配制体积 从母液吸取体积 母液浓度 称取 g 实际g 母液体积 备注 MES 0.005 mol/L 100ml 1ml 0.5mol/L 10.6625 100mL sorbitol 0.2mol/L 100ml 100ml 0.2mol/L 3.6434 100mL Manmitol 0.2mol/L 100ml 100ml 0.2mol/L 3.6434 100mL pH=5.7 计算过程：MES:配置体积：100ml,浓度：0.5mol/L，分子量：213.25 m=0.5mol/L*100mL*213.25g/mol=10.6625g.sorbitol:配制体积：100ml,浓度：0.2mol/L,分子量：182.17g/mol m=0.2mol/L*100mL*182.17g/mol=3.6434g.Manmitol:配置体积：100ml,浓度：0.2mol/L,分子量：182.17g/mol m=0.2mol/L*100mL*182.17g/mol=3.6434g.2.细胞核与叶绿体的分离提纯 为保证提纯的细胞器中组分免受破坏,以下步骤均要在 04下进行.2.1 细胞核与叶绿体的粗提(1).向原生质体中加入含有 0.5%Triton X-100 的 CSK 缓冲液(100 mmol/L KCl,3 mmol/LMgCl2,1mmol/LEGTA(pH8.0),10mmol/LPIPES(pH6.8),300mmol/Lsucrose,1.2 mmol/L PMSF,20 mmol L DTT),振荡混匀后,静置 7 min.溶去原生质体膜但保证细胞核和叶绿体的膜系统不被破坏.(2).取 120g 离心 10min,弃上清液.(3).用 CSK 缓冲液重悬沉淀,(4).20m 孔径的滤膜过滤,(5).取 120g 离心 10 min,得到的沉淀为粗提的细胞核与叶绿体的混合物,(6).用改良碱性品红苯酚染色,镜检细胞核与叶绿体的初步分离情况.2 2.2 细胞核与叶绿体的纯化（1）.把含有 2.3mol L 蔗糖的 CSK 缓冲液(100mmol LKCl,3 mmol L MgCl2,1 mmol L EGTA(pH8.0),10mmol LPIPES(pH6.8),2.3 mol L sucrose,1.2 mmol LPMSF,20mmol LDTT)加至于离心管底部,名称 使用浓度 配制体积 从母液吸取体积 母液浓度 称取 g 实际g 母液体积 备注 KCl 0.1molL 100ml 100ml 0.1mol/L 0.746 100mL MgCl2 0.003 mol L 100ml 1ml 0.3mol/L 2.8563 100mL EGTA 0.001 mol L 100ml 1ml 0.1mol/L 3.8035 100mL pH=8.0 PIPES 0.01molL 100ml 10ml 0.1mol/L 3.024 100mL pH=6.8 sucrose蔗糖 2.3 mol L 100ml 100ml 2.3mol/L 78.729 100mL 苯甲基磺酰氟(剧毒)PMSF 0.0012 molL 100ml 1ml 0.12mol/L 2.09028 100mL DTT 二硫苏糖醇 0.02mol L 100ml 10ml 0.2mol/L 3.085 100mL 计算过程:KCl:配制体积：100ml,浓度：0.1mol/L,分子量：74.6g/mol m=0.1mol/L*100mL*74.6g/mol=0.746g.MgCl2:配置体积：100ml,浓度:0.3mol/L,分子量：95.21g/mol m=0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g.EGTA:配置体积：100ml,浓度：0.1mol/L,分子量：380.35g/mol m=0.1mol/L*100mL*380.35g/mol=3.8035g PIPES:配置体积：100ml,浓度：0.1mol/L,分子量：302.40g/mol m=0.1mol/L*100mL*302.40g/mol=3.024g.sucrose:配置体积：100ml,浓度：2.3mol/L,分子量：342.3g/mol m=2.3mol/L*100mL*342.3g/mol=78.729g.PMSF:配置体积：100ml,浓度：0.12mol/L,分子量：174.19g/mol m=0.12mol/L*100mL*174.19g/mol=2.0903g.DTT:配置体积：100ml,浓度：0.2mol/L,分子量：154.25g/mol m=0.2mol/L*100mL*154.25g/mol=3.085g.（2）.再把 60%percoll CSK 缓冲液(60%percoll,100 mol L KCl,3mmol L MgCl2,1 mmol L EGTA(pH8.0),10 mmol LPIPES(pH6.8),300mmol Lsucrose,1.2mmol LPMSF,20mmol LDTT)轻轻地平铺于它的上方,名称 使用浓度 配制体积 从母液吸取体积 母液浓度 称取 g 实际g 母液体积 备注 percoll 60%100ml 100ml 60%60 100ml 2 KCl 100mol/L 10ml 10ml 100mol/L 74.6 10mL MgCl2 0.003mol/L 100ml 1ml 0.3mol/L 2.8563 100mL EGTA 0.001mol/L 100ml 1ml 0.1mol/L 3.8035 100mL Ph=8.0 PIPES 0.01mol/L 100ml 10ml 0.1mol/L 3.024 100mL Ph=6.8 sucrose 0.3mol 100ml 100ml 0.3mol/L 10.269 100mL PMSF苯甲基磺酰氟(剧毒)0.0012mol L 100ml 1ml 0.12mol/L 2.0903 100mL DTT 0.02mol L 100ml 10ml 0.2mol/L 3.085 100mL 计算过程:KCl:配置体积：10ml,浓度：100mol/L,分子量:74.6g/mol m=100mol/L*10mL*74.6g/mol=74.6g.MgCl2:配置体积：100ml,浓度：0.3mol/L,分子量：95.21g/mol m=0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g.EGTA:配置体积：100ml,浓度:0.1mol/L，分子量：380.35g/mol m=cv/M=0.1mol/L*100mL*380.35g/mol=3.8035g.PIPES:配置体积：100ml,浓度：0.1mol/L 分子量：302.40g/mol m=0.1mol/L*100mL*302.40g/mol=3.024 g.Sucrose:配置体积：100ml,浓度：0.3mol/L,分子量：342.3g/mol m=0.3mol/L*100mL*342.3g/mol=10.269 g.PMSF：配置体积：100ml,浓度：0.12mol/L,分子量：174.19g/mol m=0.12mol/L*100mL*174.19g/mol=2.0903g.DTT:配置体积：100ml,浓度：0.2mol/L 分子量：154.25g/mol m=0.2mol/L*100mL*154.25g/mol=3.085g.(3).用移液枪加时要小心顺着管壁把一溶液平铺于另一溶液之上.这时应该能观察到溶液明显的分层现象,(4).然后把粗提细胞核与叶绿体的混合物用 CSK 缓冲液悬起并轻轻的平铺于上述两层的溶液顶部,(5).最终形成三层溶液各居其层,(6).200 g 离心 32min.溶液梯度层重新分布,(7).叶绿体沉于离心管底部,(8).细胞核分布于 2.3mol/L 蔗糖的 CSK 缓冲液与 60%percoll CSK 缓冲液的交界处一薄层中,(9).用移液枪小心吸出这一薄层,再加入 2 倍体积的 CSK 缓冲液,12000g 离心5min,沉淀即为纯化的细胞核,(10).用改良碱性品红苯酚染色,镜检细胞核的纯化情况.并用 1/400 mm2 的血细胞计数板对从烟草悬浮细胞中提取的细胞核计数.四、液泡的分离 1 原生质体分离步骤 同细胞核的分离 2.酶液配制 2 酶的种类及配比根据酶解材料选择.应用的酶主要有果胶酶 Y-23(pectolyase Y-23)、果胶酶 R-10(离析酶 macerozyme R-10)、纤维素酶 RS(celllase ONOZUKA)、纤维素酶 R-10(cellulase ONOZUKAR-10)等.3.取材 制备原生质体时要将冲洗过的组织，表面用70%的乙醇消毒 30 s.有的研究者认为,将消毒后的组织剥去表皮并切成0.52mm 的小条块;对于难于剥去表皮的叶片,如禾本科的一些植物,可直接切成小条.适当的萎蔫有利于原生质体分离.4.分离与纯化 1.将处理好的材料放入直径 6cm 的培养皿中.2.每 2g 材料加入酶液 10mL,在 2530酶解 612 h.3.每隔 30m in 镜检一次,直到有一定数量的原生质体释放出来为止.4.将酶解好的混合液通过尼龙网或金属网过滤,一般 40100m.5.用含渗透剂浓度较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面,常用的渗透剂有（蔗糖、山梨醇或甘露醇）.6.将从叶片酶解得来的原生质体混合液在 500g 离心 5m in,使原生质体与杂质一起沉淀.7.去上清液后用 25%的蔗糖使之悬浮,在 1500g 离心 5 m in,弃沉淀,将上清液用蒸馏水稀释 3 倍,再在 500g 离心 5m in;沉淀即为纯化的原生质体.5 液泡分离 5.1 渗透裂解法（1）.酶法制备原生质体,在制备好的 120mL 原生质体悬浮液中迅速(15s 内)加入等体积的介质溶液.（2）.介质溶液成分及浓度为:3mmol/LMgCl2,1mmol/L DDT(二硫基苏糖醇),pH 用 HCl 调节到 8.名称 使用浓度 配制体积 从母液吸取体积 母液浓度 称取g 实 际g 母液体积 备注 MgCl2,0.003mol/L 100ml 1ml 0.3 2.8563 100mL DDT(二硫基苏糖醇)0.001mol/L 100ml 1ml 0.1 1.5425 100mL 计算过程:MgCl2:配置体积：100ml,浓度：0.3mol/L,分子量：95.21g/mol m=0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g.DDT:配置体积：100ml,浓度：0.1mol/L,分子量：154.25g/mol m=cv/M=0.1mol/L*100mL*154.25g/mol=1.5425g.（3）.缓慢摇动后得到一个均一的悬浮液.用一个多浆叶的搅拌器搅拌 24 m in,转速为每分钟 15 转.（4）.去掉搅拌器将悬浮液通过 1mm 孔径的塑料板过滤,然后再通过 2 层玻璃棉.（5）.得到的悬浮液在23g 下离心 3m in 使一些杂质沉淀,将上部清液转移到另 2 一个 250mL 的离心管中,用一木条缓慢搅拌使其成为均一悬浮液;而残余的聚合团和碎片附着在木条上.去掉木条,在 100g 下离团和碎片附着在木条上.(6).心悬浮液 3m in,去掉上清液得到的沉淀即为含大量色素的液泡;而不含色素的液泡需要在 1100g 离心 3m in 才能获得.