人胃泌素酶联免疫分析.pdf

人胃泌素(Gastrin)酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 产品编号：CSB-E09166h 检测范围：3.12 ng/ml-200 ng/ml 最低检测限：0.78 ng/ml 特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组人胃泌素，且和其他相关蛋白无交叉反应。有效期：6 个月 预期应用：ELISA 法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中胃泌素含量。说明 1试剂盒保存：-20（较长时间不用时）；2-8（频繁使用时）。2浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。3中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。4刚开启酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。实验原理 用纯化抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗胃泌素抗体微孔中依次加入标本或标准品、生物素化抗胃泌素抗体、HRP 标记亲和素，经过彻底洗涤后用底物 TMB 显色。TMB 在过氧化物酶催化下转化成蓝色，并在酸作用下转化成最终黄色。颜色深浅和样品中胃泌素呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制 1.酶联板(Assay plate)：一块（96 孔）。2.标准品（Standard）：2 瓶(冻干品)。3.样品稀释液(Sample Diluent)：120ml/瓶。4.生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）：110ml/瓶。5.辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（HRP-avidin Diluent）：110ml/瓶。6.生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1120l/瓶（1：100）7.辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1120l/瓶（1：100）8.底物溶液（TMB Substrate）：110ml/瓶。9.浓洗涤液（Wash Buffer）：120ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍。10.终止液（Stop Solution）：110ml/瓶（2N H2SO4）。需要而未提供试剂和器材 1.标准规格酶标仪 2.高速离心机 3.电热恒温培养箱 4.干净试管和 Eppendof 管 5.系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器 6.蒸馏水，容量瓶等 标本采集及保存 1.血清：全血标本请于室温放置 2 小时或 4过夜后于 1000g 离心 20 分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20或-80保存，但应避免反复冻融。2.血浆：可用 EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后 30 分钟内于 2-8C 1000 g 离心 15 分钟，或将标本放于-20或-80保存，但应避免反复冻融。3.细胞培养物上清或其它生物标本：1000g 离心 20 分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20或-80保存，但应避免反复冻融。注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。标本稀释原则：首先通过文献检索方式了解待测样本大致含量，确定适当稀释倍数。只有稀释至标准曲线范围内，检测结果才是准确。稀释过程中，应做好详细记录。最后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本浓度应再乘以“N”。标准品稀释原则：2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml，盖好后静置 10 分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为 200 ng/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释 200 ng/ml，100 ng/ml，50 ng/ml，25 ng/ml，12.5 ng/ml，6.25 ng/ml，3.12 ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度 0 ng/ml，临用前 15 分钟内配制。如配制 100 ng/ml 标准品：取 0.5ml（不要少于 0.5ml）200 ng/ml 上述标准品加入含 0.5ml 样品稀释液Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推。生物素标记抗体稀释原则：临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好每次实验所需总量配制（每孔 100l），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如 10l 生物素标记抗体加 990l 生物素标记抗体稀释液比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。辣根过氧化物酶标记亲和素稀释原则：临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好每次实验所需总量配制（每孔100l），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如 10l 辣根过氧化物酶标记亲和素加 990l 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。操作步骤 实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒检测范围。1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100l，余孔分别加标准品或待测样品 100l，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37反应 120 分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新标准品溶液。2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100l（取 1l 生物素标记抗体加 99l生物素标记抗体稀释液比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37,60 分钟。3.温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分钟，200l/每孔，甩干。4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液）100l，37，60 分钟。5.温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2 分钟，200l/每孔，甩干。6.依序每孔加底物溶液 90l，37避光显色（30 分钟内，此时肉眼可见标准品前 3-4 孔有明显梯度蓝色，后 3-4 孔显色不明显，即可终止）。7.依序每孔加终止溶液 50l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液加入顺序应尽量和底物液加入顺序相同。为了保证实验结果准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。8.用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔光密度（OD 值）。在加终止液后 15 分钟以内进行检测。注：1.用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。2.每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及 2N H2SO4。测量时先用此孔调 OD 值至零。3.为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。4.未使用完酶标板或者试剂，请于 2-8保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需量配置使用。请勿重复使用已稀释过标准品、生物素标记抗体工作液、或辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。5.建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果准确性。洗板方法 手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐洗涤缓冲液至少 0.3ml 注入孔内，浸泡 1-2 分钟。根据需要，重复此过程数次。自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。计算 以标准物浓度为横坐标（对数坐标），OD 值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品 OD 值由标准曲线查出相应浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物浓度和OD 值计算出标准曲线直线回归方程式，将样品 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品实际浓度。注意事项 1.当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。2.洗涤过程非常重要，不充分洗涤易造成假阳性。3.一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4.请每次测定同时做标准曲线，最好做复孔。5.如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。6.在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应稀释液配制，不能混淆。7.底物请避光保存。8.不要用其它生产厂家试剂替换试剂盒中试剂。