植物染色体显带技术505.pdf
细胞遗传学实验 实验一 植物染色体去壁、低渗、火焰干燥制片技术 一、实验原理：用此法可以显著提高染色体的分散程度和平衡性，可以减少染色体的变形、断裂等现象，也可以减轻细胞质对染色体的覆盖。使染色体各组成部分长臂、短臂、着丝粒、随体、染色单体等都显示得比较清楚，有利于染色体测量和显带的分析。此法也很简单，首先用酶解法去除植物细胞壁，再利用热胀冷缩的原理，将植物细胞在冰片上用火焰烧烤，用力甩片能使细胞膜破裂，不需要特殊设备，同时也省去了繁杂的压片手续，显著提高了制片的效率。二、实验目的：学习植物染色体标本制备去臂、低渗法的技术，为染色体显带实验提供了优良的标本。三、实验步骤：1 材料的制备：黑麦根尖(2n=14)根尖材料的制备：1.发根：将材料放入具有团粒结构条件的土壤中培养（锯木屑、土壤、砾石、麦杆、谷草)；最适温度(2332)；培养24h 再放入 04冰处理 17 天。目的:(1)使分裂速度减慢，根尖长度整齐一致；(2)调节工作时间。再将材料从冰箱中取出又放回最适温度条件下培养12 天；待根尖长度为 1.52cm 即可处理。2 预处理：化学和物理两种 (1)化学方法：(适合所有生物)a.秋水仙素 0.050.2(白色粉末，易溶于水的巨毒药品)；b.0.002M 8-羟基喹啉(淡黄色晶体，用少量的乙醇溶解再稀释，对禾本科植物的随体很清楚)；C.-溴萘饱和液(淡黄色的乳浊液，易溶于乙醇和苯；难溶于水，100ml 水中倒入 12 滴剧烈的振动 5 分钟)；（以上 abc 三种药剂在 1518温度下处理 35h）d.对二氯苯饱和液(淡黄色的晶体，难溶于水；具有强烈的腐蚀性，只能处理 11.5h)。(2)物理方法：(适合禾本科作物，本次实验所采用)冰水混合物在 04温度下处理 24h。预处理的目的 破坏或抑制纺锤体形成；增加中期图象，改变细胞质的粘度，使染色体缩短变粗，易于染色体的显带及研究。3 固定：卡诺氏 31(乙醇 醋酸);固定的目的 利用药剂迅速杀死正在分裂的细胞，使之保持细胞中的染色体处于被固定前的原有状态。4 保存：冲洗置换，从 9570的乙醇梯度置换；每次置换需停留 2030min,目的是将固定液中的醋酸从材料中置换掉，最后将材料保存在 70的乙醇中备用。5 解离：将根放在 0.2MHCI 中，在 25下浸泡 1h。作用：以软化细胞壁，去除细胞壁之间的果胶质。解离的目的 使胞间层的果胶类物质解体，利于细胞分散，有助于压片；同时解离也可适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，便于观察染色体。6 前低渗：用自来水冲洗材料，再用 25的蒸馏水浸泡 0.5h。作用：可置换出细胞内的 HCI，使细胞充分吸水。染色体在细胞内处于游离状态，在制片时便于染色体分散。7 酶解去壁：倒掉蒸馏水，加入 2的纤维素酶与 2果胶酶的混合液，在35-37下处理 2h。作用：对细胞壁所含的纤维素、半纤维素和果胶质进行消化。8 后低渗：用镊子夹住根部抖落分生区，将其它部分丢弃，收集分生区组织，转入指形管，沉淀 10min 后吸出酶液，加蒸馏水浸泡 0.5h。作用：可置换出酶液。使细胞充分吸水膨胀，染色体游离在细胞质中，制片时便于染色体分散，是关键步骤。9 固定：吸去蒸馏水，加 31 的甲醇固定液，静置 15min。作用：置换出细胞内的水分，便于燃烧。(甲醇固定液作用有：具有一定的脆性，甩片时容易使细胞膜破裂。能改善染色，有助于以后实验时的吉姆萨染色)。10 制备悬浮液：吸去上清液，以 110 的比例加入新鲜的固定液(即一份细胞，10 份固定液)，用吸管不停的吸放以捣碎组织，制成均匀的细胞悬液。11 标本片制备：将冷冻的载玻片斜放 30-45角，点上酒精灯，吸 2-3 滴细胞悬液在该片上，加热烧烤，此时用力甩片，制作 10 张标本片。实验二 植物染色体 GiemsaC 带技术 一、实验原理：染色体显带技术是借助于特殊的处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数目、部位、宽窄与浓淡具有相对的稳定性。从而在以往染色体形态特征（长度、着丝粒位置、臂比、随体等）以外又增添了一类新的标志。染色体分带技术能有效地鉴别染色体，研究染色体的结构与功能。C 一带是植物吉姆萨分带的一种类型，是染色体经过 C 一带程序处理，使染色体着丝粒两侧出现带纹，故名C 一带。二、实验目的：掌握植物染色体吉姆萨分带技术和方法。三、实验步骤：1、制片：选取前两次实验(压片法、去壁低渗法)制备的片子各 10 张。2、干燥：两种方法 自然干燥 松树、洋葱 15 天，(不超过 3 过月)；禾本科作物 215 天。无水乙醇干燥 只需要 112 小时即可。(目的：染色体具有后熟的作用；去除染色体上的蛋白质；使材料凝固在片子上)。本实验采用自然干燥方法。3、酸处理：两种方法 用 45%醋酸在室温下处理 11.5 h；用0.2MHCl，在 25下处理 11.5 h；（处理完毕用，用 30的蒸馏水过一次）作用：去除制片上的杂质和染色体上的蛋白质；破坏细胞质；使第一次染色褪色。与染色体上的 DNA 或某些碱基结合，使染色体上不同程度碱基脱落，有助于程度不同的显带。应选用种方法。(酸处理是变性的过程。应注意控制时间，如果处理恰倒好处感觉染色体饱满，带纹丰富；如果处理不够，染色体上的色差不明显，观察不到带纹；如果处理过度，染色体很薄，带纹也不丰富)。4、碱处理：两种方法 强碱 NaOH、KOH；室温处理，不得超过 20 秒；(大约 15 秒)弱碱 Ba(OH)2 饱和溶液，在 25下处理 15min。碱处理也是使染色体变性的过程，作用是与染色体上的 DNA 碱基结合，消化 DNA。处理完毕不能直接倒去碱液，以防止 Ba(OH)2 与空气中 CO2 结合生成的碳酸钡薄膜覆盖在制片材料的表面，影响后续工作的正常进行，所以必须用流动的自来水冲洗，以去除表面的薄膜以及水中的沉淀物,冲洗完毕用 30蒸馏水漂洗浸泡几分钟，置换出碱液。5、盐处理：用 2SSC 盐溶液(0.3MNaCl+0.03MNaC6H5O7 2H2O)，在 60下处理 1.5h。盐处理是使染色体复性的过程，作用(1)调节 PH 值；(2)修饰 DNA 上的碱性基团和酸性基团。1.5h 后倒去盐溶液，加入 30蒸馏水浸泡 5 分钟，置换出盐溶液。6、染色：取吉姆萨母液(1浓度)10-15ml,用磷酸缓冲液(PH6.8-7.2)稀释至1000ml（比较新鲜的母液 15ml,氧化 1 年以上的母液 10ml）。在 25下染色120min，然后在显微镜下观察。四、实验结果 载玻片观察结果有染为淡紫色细胞和蓝色杂质，但未见染色体 C 带，分析原因：1.酶解时对温度和时间的把控出现问题；2.制片时，细胞未破碎，没有甩出染色体；3.处理玻片时，将材料冲出玻片；4.当天室温太低影响了氢氧化钡的溶解，溶解不充分；如下图所示，黑色圆圈内即为一条染色体在着丝粒处的 C 带。
