(3.1)--3第三章蛋白质和氨基酸的分析.ppt

第三章第三章 蛋白质和氨基酸的分析蛋白质和氨基酸的分析学学习习要要点点掌握凯氏定氮分析法的原理和掌握凯氏定氮分析法的原理和步骤步骤熟悉蛋白质的快速分析方法熟悉蛋白质的快速分析方法熟悉氨基酸总量的分析方法熟悉氨基酸总量的分析方法了解氨基酸的分离分析方法了解氨基酸的分离分析方法 第一节第一节 概述概述l蛋白质是由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物，组成蛋白质的元素主要有C C、H H、O O、N N四种，除此以外，还含有少量的S、P、Fe、Mg、I等元素。lN N是构成蛋白质的特征元素。1.1 蛋白质的定义蛋白质的定义第一节第一节 概述概述1.2 各种常见食品中蛋白质的含量各种常见食品中蛋白质的含量食物名称蛋白质含量食物名称蛋白质含量食物名称蛋白质含量猪肉9.5大黄鱼17.6小麦粉（标准）9.9牛肉20.1小黄鱼16.7大白菜1.1羊肉11.1带鱼18.1菠菜2.4牛乳3.3鲤鱼17.3黄瓜0.8乳粉（全脂）26.2稻米8.3苹果0.4鸡蛋14.7小米9.7柑橘0.9鸡肉21.5玉米8.5鸭梨0.1鸭肉16.5大豆36.3桃0.8l蛋白质是食物的重要组成部分之一。l食物中的蛋白质来源种类繁多，主要来源于肉类、豆类和粮谷类等，果蔬中含量较少。第一节第一节 概述概述1.3 蛋白质的功能蛋白质的功能02030104蛋白质的功能营养功能构成人体最基本的物质生物功能调节人体机能，保健作用食品加工功能影响食品的色香味安全性问题抗营养因子、过敏原第一节第一节 概述概述1.4 蛋白质系数蛋白质系数 1 份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。元素 C HONSP百分比（%）50723160-30-3不同的蛋白质，其组成和结构不同。近似的蛋白质的元素组成百分比如下：食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定（GB5009.5-2016 GB5009.5-2016）蛋白质系数）蛋白质系数第一节第一节 概述概述第一节第一节 概述概述1.5 蛋白质分析的意义蛋白质分析的意义对食物的营养价值进行评价完善食品营养成分表优化食物配方，改善食物蛋白质、氨基酸的数量与结构对食品企业或开发工作有重要促进作用蛋白质蛋白质、胨、胨、肽肽氨基酸氨基酸酶、酸、碱虽然从各种天然源中分离得到的氨基酸已达175种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，包括8种必需氨基酸。随着食品科学的发展和营养知识的普及，食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的组成越来越得到人们的重视，为提高蛋白质的生理效价而进行食品的开发及合理配膳等工作具有极其重要的意义。第一节第一节 概述概述必需氨基酸在人体中不能合成或合成速度远不能适应人体需求，必须从食物中获取。第一节第一节 概述概述1.5 蛋白质和氨基酸的测定方法蛋白质和氨基酸的测定方法氨氨基基酸酸的的测定定总量总量个别个别比色法、滴定法氨基酸分析仪；GC；HPLC；TLC共性共性含氮量含氮量肽键肽键折射率折射率特性特性特定氨基酸残基特定氨基酸残基酸性和碱性基团酸性和碱性基团芳香基团芳香基团蛋蛋白白质的的测定定凯氏定氮法、双缩脲法、燃烧法凯氏定氮法、双缩脲法、燃烧法凯氏定氮法、双缩脲法、燃烧法凯氏定氮法、双缩脲法、燃烧法紫外、紫外、紫外、紫外、红红外光外光外光外光谱谱法；染料法；染料法；染料法；染料结结合法合法合法合法第二节第二节 蛋白质的分析蛋白质的分析2.1 凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法是测定蛋白质含量的经典方法。凯氏定氮法是测定蛋白质含量的经典方法。凯氏定氮法凯氏定氮法常量法常量法微量法微量法半微量法半微量法改良式法改良式法自动定氮仪法自动定氮仪法GB5009.5-2016第一法：凯氏定氮法（包括自动蛋白质测定仪法）第二法：分光光度法第三法：燃烧法样品样品N N浓H2SO4催化剂(NH4）2SO4CO2H2O浓NaOH蒸馏NH3硼酸(NH4）2B4O7HCl滴定计算相关系数2.1 凯氏定氮法凯氏定氮法（1）原理）原理第二节第二节 蛋白质的分析蛋白质的分析2.1 凯氏定氮法凯氏定氮法 样品消化样品消化样品消化样品消化 N N (NH(NH44)22SOSO44 2 2NHNH2 2(CH)(CH)2 2COOH COOH 13H 13H2 2SOSO4 4 (NH(NH4 4)2 2SOSO4 4 6CO 6CO2 2 12SO 12SO2 2 16H 16H2 2O O（1 1）硫酸钾（）硫酸钾（增温剂）增温剂）A.增温（增温（340-400）K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3B.不可加太多不可加太多（NH4)2SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2OA、催化剂、催化剂 B、消化终点指示剂、消化终点指示剂 C、下一步蒸馏时碱性反应的、下一步蒸馏时碱性反应的指示剂指示剂2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2 C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2（2）硫酸铜）硫酸铜CuSO4（2）步）步骤第二节第二节 蛋白质的分析蛋白质的分析2.1 凯氏定氮法凯氏定氮法 蒸馏与吸收蒸馏与吸收蒸馏与吸收蒸馏与吸收 在消化完全的样品溶液中加入浓氢浓氢氧化钠氧化钠使溶液呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气氨气。加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸硼酸溶液进行吸收。2 2N NaOHOH(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4 2NH2NH3 3 NaNa2 2SOSO4 4 2H2H2 2O O2NH2NH3 3+4H4H3 3BOBO3 3=(NH=(NH4 4)2 2B B4 4O O7 7+5H+5H2 2O O 滴定滴定滴定滴定待吸收完全后，用盐酸标准溶液盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂的变色反应，但它有吸收氨的作用。(NH(NH4 4)2 2B B4 4O O7 7+2HCl+5H+2HCl+5H2 2O=2NHO=2NH4 4Cl+4HCl+4H3 3BOBO3 3第二节第二节 蛋白质的分析蛋白质的分析2.1 凯氏定氮法凯氏定氮法（3）注意事）注意事项（1）消化应在通风橱进行，并使试样全部浸泡在消化液中。样品不易消化时，可将定氮瓶取下放冷却后，缓缓加入30%过氧化氢2-3mL，促进消化。若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5mL的比例增加硫酸用量。（2）蒸馏时，蒸气发生应均匀、充足，蒸馏中途不得停火断气，否则会发生倒吸。加碱要足量，动作要快，防止生成的氨气逸散损失。冷凝管口一定要浸入吸收液中，防止氨挥发损失。蒸馏结束后应先将吸收液离开冷凝管口，以免发生倒吸。第二节第二节 蛋白质的分析蛋白质的分析2.1 凯氏定氮法凯氏定氮法（4）方法）方法评价价优点优点适用范围广适用范围广操作相对比较简单操作相对比较简单实验费用较低实验费用较低结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法缺点缺点实验时间比较长（至少需要实验时间比较长（至少需要2h2h才能完成）才能完成）最终测定的是总有机氮，而不是蛋白质氮最终测定的是总有机氮，而不是蛋白质氮非蛋白氮:游离氨基酸、小肽核酸、磷脂、氨基糖、嘌呤以及某些维生素、生物碱、尿酸、脲和氨基离子。凯氏定氮法适用于各类食品中蛋白质含量的测定，但不适用于添加了无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品样品的测定。含氮量含氮量66.7%第二节第二节 蛋白质的分析蛋白质的分析2.2 分光光度法（国标第二法）分光光度法（国标第二法）食食品品中中的的蛋蛋白白质质在在催催化化加加热热条条件件下下被被分分解解，分分解解产产生生的的氨氨与与硫硫酸酸结结合合生生成成硫硫酸酸铵铵，在在pH4.8的的乙乙酸酸钠钠-乙乙酸酸缓缓冲冲溶溶液液中中与与乙乙酰酰丙丙酮酮和和甲甲醛醛反反应应生生成成黄黄色色的的3,5-二乙酰二乙酰-2,6-二甲基二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。二氢化吡啶化合物。在在波波长长400 nm 下下测测定定吸吸光光度度值值，与与标标准准系系列列比比较较定定量量，结结果果乘乘以以换换算算系系数，即为蛋白质含量。数，即为蛋白质含量。第二节第二节 蛋白质的分析蛋白质的分析第二节第二节 蛋白质的测定蛋白质的测定2.3 燃烧法燃烧法（国标第三法）（杜马斯法）（国标第三法）（杜马斯法）试样在900 1200 高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收，氮氧化物被全部还原成氮气氮氧化物被全部还原成氮气，形成的氮气气流通过热导检测（TCD）进行检测。是凯氏定氮法的一个替代方法；不需要任何有害化合物（1）需要的仪器价格昂贵；（2）非蛋白氮也包含在内。2.4 双缩脲法（Cu-肽键）当脲被小心地加热至当脲被小心地加热至150150160160时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲）。脲（也叫双缩脲）。H2NCONH2+H-N(H)-CO-NH2 H2NCONHCONH2+NH3双缩脲与碱及少量双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液硫酸铜溶液作用生成作用生成紫红色紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反的配合物，此反应称为双缩脲反应。应。蛋白质分子含有肽键肽键，与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫紫红色配合物红色配合物。在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量。第二节第二节 蛋白质的分析蛋白质的分析2.5 紫外吸光光度法紫外吸光光度法 蛋白质及其降解产物（胨、肽和氨基酸）的芳香残基蛋白质及其降解产物（胨、肽和氨基酸）的芳香残基-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-在紫外区对一定波长的光有选择吸收。在波长在紫外区对一定波长的光有选择吸收。在波长280nm280nm处，吸光度与蛋白质浓处，吸光度与蛋白质浓度（度（3-8mg/mL3-8mg/mL）呈直线关系。通过测定蛋白质溶液的吸光度，求出样品的蛋）呈直线关系。通过测定蛋白质溶液的吸光度，求出样品的蛋白质。白质。此法操作简便、迅速。更适合纯化体系：非蛋白质在紫外光区有吸收作用，加之光散射作用的干扰，在较复杂的食品体系中适用受限。2023/4/219第二节第二节 蛋白质的分析蛋白质的分析2.5 紫外吸收法紫外吸收法 蛋白质及其降解产物（胨、肽和氨基酸）的芳香残基蛋白质及其降解产物（胨、肽和氨基酸）的芳香残基-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-在紫外区对一定波长的光有选择吸收。在波长在紫外区对一定波长的光有选择吸收。在波长280nm280nm处，吸光度与蛋白质浓处，吸光度与蛋白质浓度（度（3-8mg/mL3-8mg/mL）呈直线关系。通过测定蛋白质溶液的吸光度，求出样品的蛋）呈直线关系。通过测定蛋白质溶液的吸光度，求出样品的蛋白质。白质。此法操作简便、迅速。更适合纯化体系：非蛋白质在紫外光区有吸收作用，加之光散射作用的干扰，在较复杂的食品体系中适用受限。第二节第二节 蛋白质的分析蛋白质的分析第第三三节节 氨基酸氨基酸的分析的分析氨氨基基酸酸的的测定定总量总量个别个别比色法、滴定法氨基酸分析仪；气相色谱法；薄层色谱法（氨基酸总量）氨基酸态氮双指示剂甲醛滴定法双指示剂甲醛滴定法双指示剂甲醛滴定法双指示剂甲醛滴定法电位滴定法电位滴定法电位滴定法电位滴定法非水溶液滴定法非水溶液滴定法非水溶液滴定法非水溶液滴定法茚三酮比色法茚三酮比色法茚三酮比色法茚三酮比色法3.1 氨基酸总量的测定氨基酸总量的测定 氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的-COOHCOOH基和碱性的基和碱性的-NHNH2 2基。它们相互作用而使氨基酸成为基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。中性的内盐。当加入甲醛溶液时，当加入甲醛溶液时，-NHNH2 2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。利用强碱标准基与甲醛结合，从而使其碱性消失。利用强碱标准溶液来滴定溶液来滴定-COOHCOOH基，基，依据酸度计指示的依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点，值判断和控制滴定终点，测定氨基测定氨基酸的总量。酸的总量。该法准确、快速，可用于各类样品中游离氨基酸含量的测定，浑浊和色深样液可不经处理，直接测定。在发酵工业中常用于测定发酵液中氨基酸含量的变化，以了解可被微生物利用氮源的量及利用情况，可作为控制发酵生产的指标之一。（1 1）电位滴定法）电位滴定法）电位滴定法）电位滴定法第第三三节节 氨基酸氨基酸的分析的分析 氨基酸在碱性条件下与茚三酮共热，形成紫色络合物，其颜色深浅与氨基氨基酸在碱性条件下与茚三酮共热，形成紫色络合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，最大吸收波长为酸含量成正比，最大吸收波长为570nm570nm，用分光光度法测定其含量。，用分光光度法测定其含量。注意：本方法中使用的茚三酮，容易与阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前需要进行纯化处理。该法适用于除脯氨酸和羟脯氨酸以外的食品中大部分氨基酸含量的测定。（2 2）茚三酮比色法）茚三酮比色法）茚三酮比色法）茚三酮比色法3.1 氨基酸总量的测定氨基酸总量的测定第第三三节节 氨基酸氨基酸的分析的分析3.2 个别氨基酸的定量测定个别氨基酸的定量测定（1 1）氨基酸分析仪法）氨基酸分析仪法）氨基酸分析仪法）氨基酸分析仪法氨基酸分析仪法 利用氨基酸的酸碱性、极性和相对分子质量利用氨基酸的酸碱性、极性和相对分子质量利用氨基酸的酸碱性、极性和相对分子质量利用氨基酸的酸碱性、极性和相对分子质量大小不同的性质，使用阳离子交换树脂的色谱大小不同的性质，使用阳离子交换树脂的色谱大小不同的性质，使用阳离子交换树脂的色谱大小不同的性质，使用阳离子交换树脂的色谱柱在色谱柱上进行分离。柱在色谱柱上进行分离。柱在色谱柱上进行分离。柱在色谱柱上进行分离。与含有已知量氨基酸的标准溶液迚行比较，与含有已知量氨基酸的标准溶液迚行比较，与含有已知量氨基酸的标准溶液迚行比较，与含有已知量氨基酸的标准溶液迚行比较，即可对未知样品中的氨基酸进行定性、定量即可对未知样品中的氨基酸进行定性、定量即可对未知样品中的氨基酸进行定性、定量即可对未知样品中的氨基酸进行定性、定量检测检测检测检测当样液加入色谱柱顶端后，采用不同当样液加入色谱柱顶端后，采用不同当样液加入色谱柱顶端后，采用不同当样液加入色谱柱顶端后，采用不同pHpH和离和离和离和离子浓度的缓冲溶液即可将他们依次洗脱下来。子浓度的缓冲溶液即可将他们依次洗脱下来。子浓度的缓冲溶液即可将他们依次洗脱下来。子浓度的缓冲溶液即可将他们依次洗脱下来。分离出的单个氨基酸组分与茚三酮试剂反应，分离出的单个氨基酸组分与茚三酮试剂反应，分离出的单个氨基酸组分与茚三酮试剂反应，分离出的单个氨基酸组分与茚三酮试剂反应，生成紫色化合物或黄色化合物，颜色深浅与生成紫色化合物或黄色化合物，颜色深浅与生成紫色化合物或黄色化合物，颜色深浅与生成紫色化合物或黄色化合物，颜色深浅与各有关氨基酸的含量成正比。各有关氨基酸的含量成正比。各有关氨基酸的含量成正比。各有关氨基酸的含量成正比。第第三三节节 氨基酸氨基酸的分析的分析3.2 个别氨基酸的定量测定个别氨基酸的定量测定（1 1）氨基酸分析仪法）氨基酸分析仪法）氨基酸分析仪法）氨基酸分析仪法混合氨基酸标准工作液色谱图氨基酸与茚三酮试剂反应生成蓝紫色产物，在570nm有最大吸收的。羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色产物，最大吸收在440nm。氨基酸分析仪是一种高效液相色谱，用于测定蛋白质、肽及其他药物制剂的氨基酸组成或含量的方法。根据生产厂家仪器型号的不同，可测定不同数量的氨基酸，常见的氨基酸分析仪一般可分析50多种氨基酸。第第三三节节 氨基酸氨基酸的分析的分析小结小结掌握掌握 ：凯氏定氮分析法的原理和步骤：凯氏定氮分析法的原理和步骤熟悉：蛋白质的其他分析方法熟悉：蛋白质的其他分析方法熟悉：氨基酸总量的分析方法熟悉：氨基酸总量的分析方法了解：氨基酸的分离分析方法了解：氨基酸的分离分析方法蛋白质、氨基酸的分析方法很多，应根据实际工作的需要，包括准确度、灵敏度和仪器、试剂、人员、时间、成本、实验室条件等进行综合判断，合理选择分析方法，以达到分析检验的要求和目的。蛋白质和氨基酸测定的意义及方法蛋白质和氨基酸测定的意义及方法凯氏定氮法的原理、步骤、注意事项及方法评价凯氏定氮法的原理、步骤、注意事项及方法评价