真核转染稳定筛选标记及原理精选PPT.ppt

LOGO关于真核关于真核转染染稳定定筛选标记及原理及原理第1页，讲稿共17张，创作于星期二外源基因表达的三个概念外源基因表达的三个概念 转染转染转染转染 通过生化或者物理方法将目的基因导入真核细胞中。分类分类 转导转导 通过病毒介导，用基因组中携带有克隆目的片断的病毒来感染靶细胞。转化 通过生化或者物理方法将目的基因导入原核细胞中。第2页，讲稿共17张，创作于星期二常用的真核表达系统常用的真核表达系统v酵母表达系统v丝状真菌表达系统v昆虫表达系统v哺乳动物表达系统第3页，讲稿共17张，创作于星期二转转 染染 方方 法法第4页，讲稿共17张，创作于星期二 理想的细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等特点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高、细胞毒性很低，但准备程序复杂，对细胞类型有很强的选择性很难普及。非病毒介导的转染技术中，以阳离子非脂性物质为主的混合物配方转染效率最高。该类转染具有广谱、细胞毒性小、性能稳定等特点，且不受培养液中的血清和抗生素的干扰，比脂质体介导的转染方法更方便。第5页，讲稿共17张，创作于星期二转染后的表达1.瞬时表达 质粒转染到细胞中，一部分转运进入细胞核，进行转录输出mRNA进行蛋白质合成。几天内大部分的质粒都会被降解或传代而稀释。一周以后几乎检测不到。转染的质粒不整合到染色体上，出现短暂的（24-96h）高水平表达，依赖于质粒纯度、浓 度和转染效率。第6页，讲稿共17张，创作于星期二2.稳定表达 转染的质粒DNA整合到染色体上可以持续存在，转染的细胞可以长期表达。整合的概率比较小，要获得稳定转染的细胞株需要筛选标记共同转染，通过选择压力维持表达稳定。需要长时间的抗性选择培养。第7页，讲稿共17张，创作于星期二酵母表达系统常用的选择性标记酵母表达系统常用的选择性标记v营养缺陷性酵母 trp1-，ura3-，his3-，leu2-，lys2-。v显性选择标记，用于野生型酵母菌的转染。G418筛选。第8页，讲稿共17张，创作于星期二哺乳动物细胞遗传性标记胸苷激酶基因（tk）选择系统二氢叶酸还原酶基因（dhfr）选择系统黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶基因（HGPRT）选择系统新霉素抗性基因（neo）选择系统氯霉素乙酰转移酶基因（cat）选择系统潮霉素抗性选择系统第9页，讲稿共17张，创作于星期二细胞内细胞内DNA的合成途径的合成途径细胞的细胞的DNA合成有主要途径和旁路途径两种方式合成有主要途径和旁路途径两种方式1.主要途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸脲甘酸在二氢主要途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸脲甘酸在二氢叶酸还原酶的催化下合成叶酸还原酶的催化下合成DNA2.旁路途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌旁路途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶（或胸腺嘧啶激酶（TK）的）的催化下补救合成催化下补救合成DNA。第10页，讲稿共17张，创作于星期二胸苷激酶基因选择系统基因选择系统v遗传标记：遗传标记：TKv编码产物：编码产物：胸苷激酶胸苷激酶v筛选药物：筛选药物：HAT选择法选择法H：次黄嘌呤；补救合成核苷酸的原料：次黄嘌呤；补救合成核苷酸的原料A：氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成：氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成T：胸苷；补救合成：胸苷；补救合成dTTP的原料的原料v作用机理：作用机理：TK是核苷酸补救合成途径的一个关键酶是核苷酸补救合成途径的一个关键酶第11页，讲稿共17张，创作于星期二二氢叶酸还原酶（DHFR）基因选择系统v遗传标记：遗传标记：DHFR：真核细胞生物合成核苷酸的关键酶，：真核细胞生物合成核苷酸的关键酶，功能是催化二氢叶酸还原成四氢叶酸功能是催化二氢叶酸还原成四氢叶酸v编码产物：编码产物：二氢叶酸还原酶（二氢叶酸还原酶（DHFR）v筛选药物：筛选药物：叶酸类似物叶酸类似物氨基喋呤或氨甲喋呤氨基喋呤或氨甲喋呤v作用机理：作用机理：dhfr缺陷型细胞因不能合成核酸而死亡，而导缺陷型细胞因不能合成核酸而死亡，而导入了外源基因的细胞成功存活，并且在氨甲喋呤的选择压力入了外源基因的细胞成功存活，并且在氨甲喋呤的选择压力下大量表达蛋白。下大量表达蛋白。第12页，讲稿共17张，创作于星期二黄嘌呤黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）基因选择系统基因选择系统v遗传标记：遗传标记：XGPRTv编码产物：编码产物：黄嘌呤黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶鸟嘌呤磷酸核糖转移酶v筛选药物：筛选药物：霉酚酸霉酚酸v作用机理：作用机理：XGPRT合成合成GMP。哺乳动物细胞无哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌呤磷酸酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），可催化黄嘌呤形），可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸（成次黄嘌呤磷酸（IMP）。哺乳动物细胞可通过）。哺乳动物细胞可通过IMP生成生成GMP。当用。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了GMP的合成，使细胞失去合成的合成，使细胞失去合成DNA能力而死亡。能力而死亡。将含将含XGPRT基因的重组体导入真核细胞后，能表达基因的重组体导入真核细胞后，能表达XGPRT酶，酶，可在含有黄嘌呤的培养基中通过可在含有黄嘌呤的培养基中通过XMP中间体补救合成中间体补救合成GMP，使，使DNA合成正常进行。加入霉酚酸后，阳性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，合成正常进行。加入霉酚酸后，阳性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而阴性细胞则受霉酚酸的抑制而死亡，以此来筛选阳性细胞。而阴性细胞则受霉酚酸的抑制而死亡，以此来筛选阳性细胞。第13页，讲稿共17张，创作于星期二新霉素抗性基因选择系统v遗传标记遗传标记：APHv编码产物编码产物：氨基糖苷磷酸转移酶：氨基糖苷磷酸转移酶v筛选药物筛选药物：新霉素，即：新霉素，即G418一种氨基糖苷类抗生素，一种氨基糖苷类抗生素，影响影响80S核糖体功能核蛋白质的合成核糖体功能核蛋白质的合成v作用机理作用机理：新霉素抗性基因编码：新霉素抗性基因编码3磷酸转移酶降解磷酸转移酶降解G418。适。适用于所有的真核细胞用于所有的真核细胞第14页，讲稿共17张，创作于星期二氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因选择系统v遗传标记遗传标记：CAT，大肠杆菌，大肠杆菌Tn9转座子编码的催化氯霉素转座子编码的催化氯霉素 乙酰乙酰化反应的蛋白质化反应的蛋白质v编码产物编码产物：氯霉素乙酰转移酶：氯霉素乙酰转移酶v筛选药物筛选药物：氯霉素：氯霉素v作用机理作用机理：真核细胞缺乏：真核细胞缺乏CAT，将，将CAT作为报告基因与目的基作为报告基因与目的基因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养基中选择阳因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养基中选择阳性细胞。常用于瞬时表达研究。性细胞。常用于瞬时表达研究。第15页，讲稿共17张，创作于星期二潮霉素抗性选择系统潮霉素抗性选择系统v遗传标记遗传标记：HPHv编码产物编码产物：潮霉素：潮霉素B磷酸转移酶磷酸转移酶v筛选药物筛选药物：潮霉素：潮霉素Bv作用机理作用机理：HPH灭活潮霉素灭活潮霉素B第16页，讲稿共17张，创作于星期二感谢大家观看第17页，讲稿共17张，创作于星期二