目的基因表达精选PPT.ppt

关于目的基因表达第1页，讲稿共62张，创作于星期二1.原核生物基因的表达调控原核生物基因的表达调控2.原核生物的主要转录调控方式原核生物的主要转录调控方式3.原核细胞表达体系与表达载体原核细胞表达体系与表达载体4.真核细胞表达体系真核细胞表达体系5.展示表达技术展示表达技术第2页，讲稿共62张，创作于星期二1.原核生物基因的表达调控原核生物基因的表达调控（1 1）染色体）染色体DNADNA特点特点基因结构简洁有效，无多余序列，必须利用少量的基因结构简洁有效，无多余序列，必须利用少量的DNADNA序列充分存储必要的序列充分存储必要的遗传信息（操纵子、重叠基因）遗传信息（操纵子、重叠基因）一个复制起点（一个复制起点（oriori），一个复制终点（），一个复制终点（terter）（2 2）基因表达特点）基因表达特点1 1种种RNARNA聚合酶，多种聚合酶，多种因子，通过调控因子，通过调控因子的表达来调控不同种类基因表达因子的表达来调控不同种类基因表达 E.coli 有有7种种 70(housekeeping),H,E,S,N,F,FecI 转录与翻译同时进行，无转录后加工，翻译后加工方式简单（酶原）转录与翻译同时进行，无转录后加工，翻译后加工方式简单（酶原）启动子的重要保守区启动子的重要保守区-35-35、-16-16、-10-10区等，区等，RBSRBS序列（序列（SDSD序列与起始密码子间隔序列与起始密码子间隔3 39 9个碱基）个碱基）（3 3）基因表达调节特点）基因表达调节特点 调控层次少：酶活调节调控层次少：酶活调节-转录和翻译调节转录和翻译调节-总体调控总体调控 以转录调控为主，简单而快速（以转录调控为主，简单而快速（mRNAmRNA半衰期比蛋白质短，重新合成半衰期比蛋白质短，重新合成RNARNA在能耗在能耗上也比重新合成蛋白质少）上也比重新合成蛋白质少）第3页，讲稿共62张，创作于星期二第4页，讲稿共62张，创作于星期二2.原核生物的主要转录调控方式原核生物的主要转录调控方式主要方式有：诱导、激活、阻遏、弱化、主要方式有：诱导、激活、阻遏、弱化、Riboswitch调控（核调控（核糖核酸开关）糖核酸开关）（1）诱导）诱导+激活激活 ：lac操纵子的表达调控操纵子的表达调控Cell numbersGlucoseLactose葡萄糖葡萄糖 乳糖乳糖二次生长现象二次生长现象:葡萄糖被优先利用，被基本耗尽时，细胞开始合成有关利用乳糖的酶葡萄糖被优先利用，被基本耗尽时，细胞开始合成有关利用乳糖的酶（生长停滞期），将乳糖运入胞内后继续生长。（生长停滞期），将乳糖运入胞内后继续生长。GlucoseLactoseCell numberssugar concentrationCatabolite Repression(also called glucose repression)第5页，讲稿共62张，创作于星期二底物诱导底物诱导诱导物乳糖（或异乳糖）缺乏时，诱导物乳糖（或异乳糖）缺乏时，lacIlacI编码的阻遏物具有活性，编码的阻遏物具有活性，和操纵基因和操纵基因lacO结合后关闭转结合后关闭转录，起负调控作用录，起负调控作用存在诱导物乳糖（或异乳糖）存在诱导物乳糖（或异乳糖）时，诱导物充当辅阻遏物，时，诱导物充当辅阻遏物，和阻遏蛋白结合使其失活，和阻遏蛋白结合使其失活，转录起始转录起始(效率低）效率低）,在在cAMP-CRPcAMP-CRP结合在结合在DNADNA的前的前提下，高效转录提下，高效转录CRPCRP：cyclic AMP cyclic AMP Receptor Protein Receptor Protein 是乳糖是乳糖操纵子转录的正调节物操纵子转录的正调节物（或者（或者CAP)CAP)第6页，讲稿共62张，创作于星期二 激活激活葡萄糖浓度高时，细胞内葡萄糖浓度高时，细胞内cAMPcAMP浓度很低，浓度很低，CRPCRP无法无法被激活，即使阻遏蛋白被激活，即使阻遏蛋白LacILacI失活，操纵子也不失活，操纵子也不能高表达能高表达葡萄糖浓度低造成葡萄糖浓度低造成cAMPcAMP的大量生成，从而激活的大量生成，从而激活CRPCRP启动转录，起正调控作启动转录，起正调控作用用第7页，讲稿共62张，创作于星期二（2）阻遏）阻遏:Trp 操纵子阻遏操纵子阻遏当当TrpTrp很少时，由很少时，由trpRtrpR编码的阻遏蛋编码的阻遏蛋白没有活性，不能白没有活性，不能和操纵基因结合，和操纵基因结合，转录可以起始。转录可以起始。当当TrpTrp大量存在时，大量存在时，阻遏物可以和作为阻遏物可以和作为辅阻遏物辅阻遏物TrpTrp结合而结合而被激活，然后和操被激活，然后和操纵基因结合，使转纵基因结合，使转录不能起始。录不能起始。TrpTrp反馈阻遏的解除使转反馈阻遏的解除使转录强度提高录强度提高7070倍倍第8页，讲稿共62张，创作于星期二 在大肠杆菌色氨酸操纵子中在存在一种转录的弱化调节，弱化作用的解除可使转录强在大肠杆菌色氨酸操纵子中在存在一种转录的弱化调节，弱化作用的解除可使转录强度升高度升高8-108-10倍。转录的倍。转录的mRNAmRNA的的5 5端存在一段前导链，通过前导链二级结构的变化、端存在一段前导链，通过前导链二级结构的变化、色氨酰色氨酰-tRNA-tRNA（色氨酸）以及核糖体的翻译来控制转录是否继续进行（色氨酸）以及核糖体的翻译来控制转录是否继续进行大肠杆菌色氨酸操纵子大肠杆菌色氨酸操纵子前导链前导链RNARNA二级结构受到氨基酰二级结构受到氨基酰-tRNA-tRNA分子的调节：分子的调节：HisHis、TrpTrp、PhePhe等氨基酸操纵子等氨基酸操纵子（3）弱化）弱化:Trp 操纵子转录弱化操纵子转录弱化前导链的特点：前导链的特点：含有一个起始密码子和一个终含有一个起始密码子和一个终止密码子止密码子含有两个连续的含有两个连续的Trp密码子密码子四段能形成不同二级结构四段能形成不同二级结构的序列，可以形成终止子的序列，可以形成终止子结构或抗终止子结构结构或抗终止子结构(茎环）茎环）第9页，讲稿共62张，创作于星期二一旦转录开始后，核糖体结合在前导链上开始翻译，核糖体紧随在一旦转录开始后，核糖体结合在前导链上开始翻译，核糖体紧随在RNARNA聚合酶之聚合酶之后移动。后移动。TrpTrp缺乏时，由于大多数色氨酰缺乏时，由于大多数色氨酰-tRNA-tRNA空载，核糖体在两个连续的空载，核糖体在两个连续的TrpTrp密码子处密码子处暂时停滞或移动变慢，转录出的前导链暂时停滞或移动变慢，转录出的前导链2 2、3 3区配对形成抗终止子结构，区配对形成抗终止子结构，mRNAmRNA链继链继续随着续随着RNARNA聚合酶的移动而延长，直到转录出完整的产物。聚合酶的移动而延长，直到转录出完整的产物。第10页，讲稿共62张，创作于星期二TrpTrp充足时，大多数色氨酰充足时，大多数色氨酰-tRNA-tRNA载有载有Trp Trp，核糖体快速通过两个连续的，核糖体快速通过两个连续的TrpTrp密密码子并占据前导链码子并占据前导链2 2区的一部分，使区的一部分，使2 2、3 3区不能配对形成抗终止子，而是区不能配对形成抗终止子，而是3 3、4 4区配对，刚好形成终止子结构，区配对，刚好形成终止子结构，mRNAmRNA链从链从RNARNA聚合酶上脱落下来，转录提聚合酶上脱落下来，转录提前终止。前终止。第11页，讲稿共62张，创作于星期二前导链前导链RNA直接感应终端产物的浓度而改变二级结构：直接感应终端产物的浓度而改变二级结构：THI（B1）-box、RFN（B2）-box和和 B12-box维生素操纵子、维生素操纵子、嘌呤操纵子等或与其代谢相关的基因，这种调节结构也称为嘌呤操纵子等或与其代谢相关的基因，这种调节结构也称为“Riboswitch”(ribonucleotide switch)（4）Riboswitch第12页，讲稿共62张，创作于星期二可以体外通过对随机可以体外通过对随机RNA序列的筛选得到可以感应特定代谢物浓度的适配体序列的筛选得到可以感应特定代谢物浓度的适配体（aptamer），根据该代谢物浓度变化来开关目标基因的表达），根据该代谢物浓度变化来开关目标基因的表达第13页，讲稿共62张，创作于星期二3.原核表达体系原核表达体系（1 1）启动子）启动子(基本类型基本类型2 2类：组成型和调控型）类：组成型和调控型）lac 启动子启动子 最早应用的表达系统，含最早应用的表达系统，含CRP结合位点及结合位点及lacO，其转录，其转录受受CRP正调控和正调控和lacI负调负调控控。lacUV5 启动子启动子 Plac的突变型的突变型,能够在没有能够在没有CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子在转的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上录水平上只受只受lacI的调控的调控，因而随后得到了更广泛采用，因而随后得到了更广泛采用-35 -10第14页，讲稿共62张，创作于星期二 tac 启动子启动子/trc启动子启动子 trp启动子启动子-35区和区和lacUV5-10区、区、lacO区杂合区杂合,启动强度更高（约比启动强度更高（约比PlacUV5高高1个个数量级数量级,比比trp启动子高启动子高3倍），适合于高表达系统倍），适合于高表达系统。tacI(-20为界限）为界限）tacII(-11为界，下为界，下游为人工合成的游为人工合成的46bp片段）片段）trc启动子和启动子和tacI类似类似受受IPTG诱导启动子的问题：无诱导物存在时本底表达高（甚至有一些基因不加诱导物时表达水诱导启动子的问题：无诱导物存在时本底表达高（甚至有一些基因不加诱导物时表达水平更恰当）平更恰当）采用采用lacI突变基因：突变基因：lacIq，突变后导致阻遏蛋白表达量增加，突变后导致阻遏蛋白表达量增加第15页，讲稿共62张，创作于星期二 T7噬菌体启动子噬菌体启动子 只有只有T7RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克隆基因独自得到表达。聚合酶才能使其启动，故可以使克隆基因独自得到表达。T7RNA聚合酶的聚合酶的效率比大肠杆菌效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚聚合酶有效转录的序列。合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因，但要注意用这种启动子时这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因，但要注意用这种启动子时宿主宿主中必须含有中必须含有T7RNA聚合酶聚合酶，如如BL21(DE3)菌株菌株问题：表达强度超强，如何控制？实现诱导表达？问题：表达强度超强，如何控制？实现诱导表达？利用利用lacUV5启动子控制启动子控制T7RNA聚合酶基因的表达，实现诱导聚合酶基因的表达，实现诱导 在在T7启动子下游加上数个启动子下游加上数个lacO序列，使其变为诱导启动子。序列，使其变为诱导启动子。PBAD 启动子启动子 PBAD 启动子受阿拉伯糖诱导，无诱导物时本底表达低，启动子效率较高。另启动子受阿拉伯糖诱导，无诱导物时本底表达低，启动子效率较高。另外随着诱导物浓度增加，启动表达的细胞比例增加（而转录强度并不增加），即外随着诱导物浓度增加，启动表达的细胞比例增加（而转录强度并不增加），即对单个细胞而言表达状态只有对单个细胞而言表达状态只有“0”和和“1”PL启动子启动子 l噬菌体早期左向转录启动子，强度比噬菌体早期左向转录启动子，强度比Trp启动子高启动子高11倍。倍。PL启动子受控于温敏阻遏物启动子受控于温敏阻遏物 cIts857。在低温。在低温(30)时，时，cIts857阻遏蛋白可阻遏其转录。在高温阻遏蛋白可阻遏其转录。在高温(45)时，时，cIts857失活，启动子转录。适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换失活，启动子转录。适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。另外不利于大规模也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。另外不利于大规模生产的应用（升温慢）。生产的应用（升温慢）。第16页，讲稿共62张，创作于星期二n大肠杆菌大肠杆菌典型的典型的SD序列序列为为“AAGGA”，枯草芽孢杆菌为，枯草芽孢杆菌为“GGAGG”，一般来说，一般来说，mRNA与核糖体与核糖体16S rRNA(3-AUUCCUCCA-5).的结合程度越强，翻译的起始效的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，率就越高，（2 2）RBS RBS 序列与起始密码子序列与起始密码子在间隔相同的情况下，在间隔相同的情况下，UAAGGAGG的的SD序列比序列比AAGGA的的SD序列能使蛋白质序列能使蛋白质的产量提高的产量提高36倍；倍；对于同一对于同一SD序列，存在一序列，存在一最佳的间隔最佳的间隔。AAGGA的间隔为的间隔为5-7个核苷酸，而个核苷酸，而UAAGGAGG的间隔为的间隔为4-8个核苷酸；个核苷酸；对于同一对于同一SD序列，有翻译所必需的最小间隔。序列，有翻译所必需的最小间隔。AAGGA的最小间隔为的最小间隔为5个核苷酸，个核苷酸，而而UAAGGAGG的最小间隔约为的最小间隔约为4个核苷酸，以保证起始密码子刚好位于核糖体个核苷酸，以保证起始密码子刚好位于核糖体P位。位。大肠杆菌中的起始大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别分子可以同时识别AUG、GUG和和UUG三种三种起始密码子起始密码子，但识别频率并不相同，通常但识别频率并不相同，通常GUG为为AUG的的50%，而，而UUG只及只及AUG的的25%。在。在枯草芽孢杆菌中，多数基因的起始密码子为枯草芽孢杆菌中，多数基因的起始密码子为AUG，为起始密码子的最优选择。，为起始密码子的最优选择。从从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，这一序列不能与开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，这一序列不能与mRNA的的5端非端非编码区形成茎环结构，否则会严重干扰编码区形成茎环结构，否则会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位在核糖体上的准确定位 第17页，讲稿共62张，创作于星期二E.coliB.subtilis原核生物中普遍存在重叠基因，而且重叠基因之间具有翻译偶联现象：即两个原核生物中普遍存在重叠基因，而且重叠基因之间具有翻译偶联现象：即两个基因的翻译存在固定的计量学关系，机理主要有两种：基因的翻译存在固定的计量学关系，机理主要有两种：核糖体移码或滑动（核糖体移码或滑动（40bp以内）以内），即同一核糖体翻译重叠基因，即同一核糖体翻译重叠基因 mRNA形成二级结构，上游基因的形成二级结构，上游基因的mRNA序列将下游基因的序列将下游基因的SD 序列掩蔽，序列掩蔽，只有上游基因翻译后才能破坏二级结构而暴露出下游基因的只有上游基因翻译后才能破坏二级结构而暴露出下游基因的SD序列，核糖体序列，核糖体才能结合进行下游基因翻译。才能结合进行下游基因翻译。核糖体与核糖体与mRNA结合稳定性在刚开始翻译时较差，遇到二级结构可能会影响翻结合稳定性在刚开始翻译时较差，遇到二级结构可能会影响翻译效率。而在蛋白质链从核糖体中延伸出来后（约译效率。而在蛋白质链从核糖体中延伸出来后（约10个残基）稳定性较强，通个残基）稳定性较强，通常遇到强度大的二级结构也不会影响翻译。常遇到强度大的二级结构也不会影响翻译。第18页，讲稿共62张，创作于星期二（3 3）终止子）终止子表达的基因末端的终止子非常重要，可以避免表达的基因末端的终止子非常重要，可以避免RNARNA聚合酶的通读而聚合酶的通读而合成不必要的合成不必要的RNARNA序列。序列。通读后多余的通读后多余的RNARNA序列可能会形成不利于基因表达的二级结构序列可能会形成不利于基因表达的二级结构通读会影响下游基因的转录，对于质粒，还会影响其复制。通读会影响下游基因的转录，对于质粒，还会影响其复制。通常需要在表达载体的多克隆位点下游加上强终止子，对于通常需要在表达载体的多克隆位点下游加上强终止子，对于T7T7启动子启动子这样的强启动子，甚至需要加这样的强启动子，甚至需要加2-32-3个连续的终止子以防止通读。个连续的终止子以防止通读。同理，也需要防止核糖体同理，也需要防止核糖体“通读通读”而产生不必要的蛋白质，一般而产生不必要的蛋白质，一般在表达载体下游连续加上数个终止密码子在表达载体下游连续加上数个终止密码子(UAAU是是E.coli中最有效中最有效的转录终止序列的转录终止序列)。（4 4）密码子偏爱性）密码子偏爱性在基因受体菌中表达基因供体菌中与密码子对应的在基因受体菌中表达基因供体菌中与密码子对应的tRNAtRNA基因基因根据受体菌的密码子偏爱性进行序列优化后重新合成外源基因根据受体菌的密码子偏爱性进行序列优化后重新合成外源基因第19页，讲稿共62张，创作于星期二（5 5）表达策略）表达策略对于蛋白质产品：对于蛋白质产品：采用高拷贝载体、诱导性强启动子、高效采用高拷贝载体、诱导性强启动子、高效RBS序列，以保证目的蛋白质的产量序列，以保证目的蛋白质的产量（或低（或低拷贝载体上串联多个基因）拷贝载体上串联多个基因）对于代谢物产品：对于代谢物产品：由于表达的蛋白起到催化剂的作用，其量要适中，不能耗费大量碳氮源和能量去合成过由于表达的蛋白起到催化剂的作用，其量要适中，不能耗费大量碳氮源和能量去合成过量催化剂，既要避免过大的代谢负担，也要避免底物的浪费。量催化剂，既要避免过大的代谢负担，也要避免底物的浪费。大量研究表明采用中低拷贝数载体（大量研究表明采用中低拷贝数载体（2030），中等强度启动子效果较好，也可在染色），中等强度启动子效果较好，也可在染色体上整合进行表达，启动子为强启动子体上整合进行表达，启动子为强启动子 生产代谢物时通常要表达数个、甚至数十个基因，这些基因之间表达水平生产代谢物时通常要表达数个、甚至数十个基因，这些基因之间表达水平的稳定和的稳定和协调（拷贝数、启动子和协调（拷贝数、启动子和RBS强度的优化）强度的优化）对于菌株的生产性能至关重要。对于菌株的生产性能至关重要。Mini F 质粒质粒:12 拷贝拷贝pSC101:5 拷贝拷贝pACYC（p15A 复制子）复制子）:1520 拷贝拷贝 pBR322（ColE1复制子）复制子）:4055 拷贝拷贝pUC plasmid：数百拷贝：数百拷贝第20页，讲稿共62张，创作于星期二融合蛋白技术策略：融合蛋白技术策略：外源基因连接到融合的蛋白的外源基因连接到融合的蛋白的C 端端,不必另外设计不必另外设计SD 序列序列,同时宿主蛋白同时宿主蛋白N 端的端的存在使得外源基因的表达较容易存在使得外源基因的表达较容易;外源蛋白常被宿主细胞的蛋白酶降解外源蛋白常被宿主细胞的蛋白酶降解,当外源蛋白与宿主蛋白的部分序列融合后当外源蛋白与宿主蛋白的部分序列融合后,会会减低宿主细胞对产物的降解减低宿主细胞对产物的降解和宿主外膜蛋白融合，有利于在细胞表面表达（展示），对于底物利用、毒物降和宿主外膜蛋白融合，有利于在细胞表面表达（展示），对于底物利用、毒物降解、重金属吸附等有关蛋白表达有利。解、重金属吸附等有关蛋白表达有利。和宿主信号肽融合，实现蛋白的胞外分泌（或分泌至周质空间和宿主信号肽融合，实现蛋白的胞外分泌（或分泌至周质空间)，有利于避免蛋，有利于避免蛋白酶降解、有利于蛋白产品的纯化白酶降解、有利于蛋白产品的纯化利用融合蛋白技术将药物和能与病灶特异性结合的配基融合在一起构成融利用融合蛋白技术将药物和能与病灶特异性结合的配基融合在一起构成融合蛋白合蛋白,目的蛋白可特异性的与靶细胞结合并将药物导向病灶杀伤、杀死目的蛋白可特异性的与靶细胞结合并将药物导向病灶杀伤、杀死肿瘤细胞达到治疗目的。肿瘤细胞达到治疗目的。与能与亲和层析柱上配基特异结合的与能与亲和层析柱上配基特异结合的“亲和手柄亲和手柄”相融合，利于产物纯化相融合，利于产物纯化缺点：由于融合序列的感染，有可能会影响外源蛋白的正常折叠，可以在两者之间加入特殊缺点：由于融合序列的感染，有可能会影响外源蛋白的正常折叠，可以在两者之间加入特殊蛋白酶识别的氨基酸序列，融合表达后酶切产品，去掉融合的非天然序列。蛋白酶识别的氨基酸序列，融合表达后酶切产品，去掉融合的非天然序列。亲和手柄亲和手柄 酶切序列酶切序列 外源基因外源基因第21页，讲稿共62张，创作于星期二可溶表达和包涵体表达可溶表达和包涵体表达真核基因在原核细胞中表达易形成包涵体，主要原因为缺乏翻译后修饰真核基因在原核细胞中表达易形成包涵体，主要原因为缺乏翻译后修饰导致折叠错误。即使是原核基因，过量表达也会形成包涵体，原因可能导致折叠错误。即使是原核基因，过量表达也会形成包涵体，原因可能为表达量过大，产物来不及正确折叠就发生聚集。为表达量过大，产物来不及正确折叠就发生聚集。以包涵体形式表达的外源目的产物不具有物理活性以包涵体形式表达的外源目的产物不具有物理活性,必须溶解包涵体进行复性必须溶解包涵体进行复性,才能才能得到具有生物活性的蛋白。得到具有生物活性的蛋白。在通常情况下在通常情况下,包涵体的表达具有可包涵体的表达具有可避免产物被蛋白酶降解避免产物被蛋白酶降解,包涵体表达的目包涵体表达的目的蛋白常在大肠杆菌中的蛋白常在大肠杆菌中高效表达高效表达,目的蛋白的目的蛋白的纯化相对容易纯化相对容易,能得到纯度较高的能得到纯度较高的目的蛋白目的蛋白,另外可以另外可以避免毒性避免毒性蛋白的毒性。蛋白的毒性。如果表达的蛋白质用于结构研究如果表达的蛋白质用于结构研究,则需可溶性表达，一般需降低表达量、同则需可溶性表达，一般需降低表达量、同时表达分子伴侣（大多为热激蛋白，时表达分子伴侣（大多为热激蛋白，HSP,heat shocking protein），以有利于蛋），以有利于蛋白正确折叠、溶解。白正确折叠、溶解。包涵体就是指由于蛋白的空间构象与原来不符，如折叠不对，导致的溶解性包涵体就是指由于蛋白的空间构象与原来不符，如折叠不对，导致的溶解性降低，就会聚集到一起，形成包涵体。降低，就会聚集到一起，形成包涵体。第22页，讲稿共62张，创作于星期二大肠杆菌大肠杆菌GroEL-GroES复合体。它由两个堆叠的环复合体。它由两个堆叠的环和一个帽子结构组成，其中环结构由和一个帽子结构组成，其中环结构由GroEL蛋白组蛋白组成，在图中以蓝色和绿色表示；帽子结构位于分子成，在图中以蓝色和绿色表示；帽子结构位于分子的一端，由的一端，由GroES组成，在图中以红色和黄色表示。从组成，在图中以红色和黄色表示。从分子俯视图可以看出，由分子俯视图可以看出，由7个个GroEL蛋白组成的环结蛋白组成的环结构的中央有一个蛋白质大小的空穴。未折叠的蛋构的中央有一个蛋白质大小的空穴。未折叠的蛋白质就是进入这个空穴，并在其中完成折叠。白质就是进入这个空穴，并在其中完成折叠。分子伴侣分子伴侣是指细胞内一类能介导其他蛋白正确是指细胞内一类能介导其他蛋白正确装配装配,其自身却不是具有功能的最终装配产物组成成其自身却不是具有功能的最终装配产物组成成分的物质分的物质 第23页，讲稿共62张，创作于星期二（6 6）表达载体）表达载体 表达系统表达系统 亲和手柄亲和手柄 抗原序列抗原序列 蛋白酶位点蛋白酶位点 可变区可变区 多克隆位点多克隆位点保证表达保证表达 分纯分纯 定性定量分析定性定量分析 切割融合序列切割融合序列 正确读码正确读码 插入片段插入片段Bgl II第24页，讲稿共62张，创作于星期二常用的抗原序列：常用的抗原序列：凝血酶，肠激酶，凝血酶，肠激酶，Xa因子因子 常用的蛋白酶：常用的蛋白酶：第25页，讲稿共62张，创作于星期二4.真核细胞表达体系真核细胞表达体系基因组特点：基因组特点：基因组规模大（基因组规模大（109)，有充分的遗传物质，能形成各种特殊的基因结构（内含子，高度重，有充分的遗传物质，能形成各种特殊的基因结构（内含子，高度重复序列），单基因为主。复序列），单基因为主。组蛋白组蛋白+DNA，形成核小体，进一步压缩成致密的异染色质结构。普遍存在甲基，形成核小体，进一步压缩成致密的异染色质结构。普遍存在甲基化修饰。化修饰。基因表达调控特点：基因表达调控特点：调控层次多而复杂：调控层次多而复杂：转录前（转录前（DNADNA扩增、甲基化）扩增、甲基化）转录（增强子）转录（增强子）转录后（转录后（mRNAmRNA拼接）拼接）翻译（翻译因子的磷酸化、转铁蛋翻译（翻译因子的磷酸化、转铁蛋白等）白等）翻译后（蛋白质糖基化等修饰）翻译后（蛋白质糖基化等修饰）对遗传信息传递的准确性和稳定性更对遗传信息传递的准确性和稳定性更有利有利转录依然是真核生物基因表达调控的主要环节转录依然是真核生物基因表达调控的主要环节 4.1真核细胞基因表达特点真核细胞基因表达特点第26页，讲稿共62张，创作于星期二启动子特点：启动子特点：有三种不同的有三种不同的RNA聚合酶，因此也有三种不同的启动子，其中以启动子聚合酶，因此也有三种不同的启动子，其中以启动子最为复最为复杂，和原核的启动子有很多不同：杂，和原核的启动子有很多不同：有多种元件：有多种元件：TATA框，框，GC框，框，CATT框，框，OCT等，起到控制转录效率和选择等，起到控制转录效率和选择起始位点的作用起始位点的作用结构不恒定。有的有多种框盒，有的只有结构不恒定。有的有多种框盒，有的只有TATA框和框和GC框，如框，如SV40早期基因启早期基因启动子。动子。它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同，它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同，有的有远距离的调控元件存在，如增强子；有的有远距离的调控元件存在，如增强子；不直接和不直接和RNA pol结合。转录时先和其它转录激活因子（基本转录因子）相结结合。转录时先和其它转录激活因子（基本转录因子）相结合，再和聚合酶结合合，再和聚合酶结合 酶的种类酶的种类存在存在功能功能对抑制物的对抑制物的敏感性敏感性RNA聚合聚合酶酶核仁核仁合成合成rRNA前体前体不敏感不敏感RNA聚合聚合酶酶核质核质合成合成mRNA前体及大多数前体及大多数snRNA低浓度敏感低浓度敏感RNA聚合聚合酶酶核质核质合成合成5S rRNA前体、前体、tRNA前体及其他的核前体及其他的核和胞质小和胞质小RNA前体前体高浓度敏感高浓度敏感第27页，讲稿共62张，创作于星期二上游元件：上游元件：CAAT box：保守序列是保守序列是GGCTCAATCT，一般位于上游，一般位于上游-75-80bp左右，控制左右，控制转录起始活性。能和转录起始活性。能和CTF（识别（识别CATT的转录因子）相结合的转录因子）相结合 GC box：保守序列是保守序列是GTGGGCGGGGCAAT，常以多拷贝形式存在，常以多拷贝形式存在-90处。处。它的作用也是控制转录效率。它的作用也是控制转录效率。核心元件：核心元件：TATA T85A97T93A85A63A83A50，常在起始位点的上游，常在起始位点的上游-25左右，相当于原核的左右，相当于原核的-10序列，序列，对转录起始正确定位，控制转录效率。对转录起始正确定位，控制转录效率。转录起始位点附近的启始子转录起始位点附近的启始子（initiator，Inr）Py2 CA Py5构成，位于构成，位于-3+5，可能提供，可能提供RNA pol 识别位点。识别位点。远端调控区：远端调控区：增强子，增强子，其特点是：其特点是：具有远距离效应，常在上游具有远距离效应，常在上游-200bp处，即使相距十几处，即使相距十几Kb也能发挥作用也能发挥作用 无方向性，无论在靶基因的上游，下游或内部都可发挥增强转录作用无方向性，无论在靶基因的上游，下游或内部都可发挥增强转录作用 顺式调节，只调节同一染色体的靶基因，而对其它染色体上基因无作用顺式调节，只调节同一染色体的靶基因，而对其它染色体上基因无作用 无物种和基因的特异性，可以接到异源基因上发挥作用；无物种和基因的特异性，可以接到异源基因上发挥作用；具有组织特异性，具有组织特异性，如抗体基因的增强子只有在如抗体基因的增强子只有在B淋巴细胞中才起作用。淋巴细胞中才起作用。其作用和其作用和DNA构象有关构象有关,有的增强子可以对外部信号产生反应，如热有的增强子可以对外部信号产生反应，如热/激素等激素等II类启动子一般由核心元件和上游元件组成。类启动子一般由核心元件和上游元件组成。第28页，讲稿共62张，创作于星期二减弱子，减弱子，在某些基因的上游远端或下游远端具有负调节序列，其作用不受距离和方向在某些基因的上游远端或下游远端具有负调节序列，其作用不受距离和方向的影响，叫做减弱子。的影响，叫做减弱子。上游激活序列（上游激活序列（upstream activating seguences UASs）UASs是酵母中远上游序列类似于增强子。它仅影响转录程度，对位点选择不起作用。是酵母中远上游序列类似于增强子。它仅影响转录程度，对位点选择不起作用。和增强子不同的是它有方向性，不能在启动子的下游起作用。它结合的转录因子是和增强子不同的是它有方向性，不能在启动子的下游起作用。它结合的转录因子是GCN4和和GAL4，识别位点为，识别位点为ATGACTCAT。静息子：静息子：类似于减弱子，但对基因表达起完全抑制作用，造成基因沉默。类似于减弱子，但对基因表达起完全抑制作用，造成基因沉默。基本基本(通用）转录因子识别通用）转录因子识别TATA或者或者Inr，RNA聚合酶聚合酶II再和基本转录因子结合形成再和基本转录因子结合形成转录起始复合体，在转录激活蛋白的作用下，复合体起始转录。转录起始复合体，在转录激活蛋白的作用下，复合体起始转录。初级转录本经过剪切、拼接、初级转录本经过剪切、拼接、5端加帽和端加帽和3端加尾成为成熟的可翻译的端加尾成为成熟的可翻译的mRNA第29页，讲稿共62张，创作于星期二第30页，讲稿共62张，创作于星期二第31页，讲稿共62张，创作于星期二5端甲基化的帽子为核糖体结合位点端甲基化的帽子为核糖体结合位点，和其，和其40S亚基发生作用，亚基发生作用，40S亚基结合后亚基结合后沿链滑动到沿链滑动到AUG处，此时核糖体组装完整（加上处，此时核糖体组装完整（加上60S亚基），开始翻译。亚基），开始翻译。除此之外，一些除此之外，一些mRNA（真核病毒和少数真核基因）在起始密码子上游（真核病毒和少数真核基因）在起始密码子上游还有还有IRES位位点点（internal ribosome entry sites，内部核糖体进入位点），内部核糖体进入位点）。这类。这类RNA序列能折叠序列能折叠成类似于起始成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与的结构，从而介导核糖体与RNA结合（结合（40S亚基亚基P位点，起始蛋位点，起始蛋白质翻译）白质翻译）不同于原核生物的不同于原核生物的SD序列，序列，IRES序列长度变化很大，从序列长度变化很大，从9bp到数百到数百bp长，长，IRES的存的存在可以很方便的构建人工的真核操纵子，不同翻译强度的在可以很方便的构建人工的真核操纵子，不同翻译强度的IRES序列，也为不同基因序列，也为不同基因的表达协调提供了可选的元件。的表达协调提供了可选的元件。如果第一个如果第一个ATG周围的序列符合周围的序列符合KOZAK序列（序列（NNNPuNNATGG),小亚基将会在此驻留小亚基将会在此驻留较长的时间，从而更有利于组装成完整的核糖体，使翻译效率提高较长的时间，从而更有利于组装成完整的核糖体，使翻译效率提高 第32页，讲稿共62张，创作于星期二KOZAK是一个女科学家，她总结出在真核生物中起始密码子两端序列为：是一个女科学家，她总结出在真核生物中起始密码子两端序列为：G/N-C/N-C/N-ANNAUGG，如，如GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG时，翻译效率最时，翻译效率最高，特别是高，特别是-3位的位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并序列，并被应用于表达载体的构建中。被应用于表达载体的构建中。Kozak序列为统计规律，第序列为统计规律，第4位的偏好碱基为位的偏好碱基为G，AUG的的5端约端约15bp范围的侧翼序范围的侧翼序列内不含碱基列内不含碱基T。真核基因表达时通常在真核基因表达时通常在AUG前需设计前需设计GCCACC 的的kozak序列，或使用基因上游序序列，或使用基因上游序列自带的列自带的kozak序列，避免核糖体出现序列，避免核糖体出现leaky scan KOZAK序列序列 NNNPuNNATGG第33页，讲稿共62张，创作于星期二4.2真核诱导表达体系真核诱导表达体系对于组成型表达系统，常用来源于病毒的启动子和增强子，或者看家基对于组成型表达系统，常用来源于病毒的启动子和增强子，或者看家基因的启动子（如因的启动子（如gapA/GAPDH的启动子）的启动子）如如SV40病毒早期启动子和增强子、病毒早期启动子和增强子、Rouse肉瘤病毒基因组长末端重复序列肉瘤病毒基因组长末端重复序列LTR(RSV)、人类巨细胞病毒等、人类巨细胞病毒等(CMV)。poly(A)加尾信号：加尾信号：AAUAAA真核表达载体含有两类组件：原核生物中使用的组件真核表达载体含有两类组件：原核生物中使用的组件(包括复制子、抗性筛包括复制子、抗性筛选基因和多克隆位点等选基因和多克隆位点等)和真核宿主细胞中表达所需的转录调控元件和真核宿主细胞中表达所需的转录调控元件（启动子、增强子、转录终止和加启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、信号序列、mRNA剪接信剪接信号号(内含子两侧内含子两侧)序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列以及药物抗性序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列以及药物抗性基因等）基因等）第34页，讲稿共62张，创作于星期二无诱导物存在时表达水平低无诱导物存在时表达水平低:既本底表达水平低或无泄漏既本底表达水平低或无泄漏诱导物存在时表达水平很高，且表达水平易受诱导物控制诱导物存在时表达水平很高，且表达水平易受诱导物控制启动子系统不干扰宿主细胞的正常生理活动启动子系统不干扰宿主细胞的正常生理活动,系统不影响宿主中系统不影响宿主中其它基因的表达，不易引起免疫识别其它基因的表达，不易引起免疫识别诱导物易进入细胞，半衰期短，不易在体内残留诱导物易进入细胞，半衰期短，不易在体内残留理想诱导表达系统的特点理想诱导表达系统的特点u内源诱导启动子内源诱导启动子 热激启动子、金属硫蛋白启动子热激启动子、金属硫蛋白启动子 等等u重组诱导系统重组诱导系统 lac lac、tet tet 阻遏蛋白系统阻遏蛋白系统 激素类诱导系统激素类诱导系统 FK506FK506、RU486RU486诱导系统诱导系统第35页，讲稿共62张，创作于星期二(1)热激（诱导）启动子的机理热激（诱导）启动子的机理(2)常用的热激启动子常用的热激启动子：4.2.1热激启动子热激启动子热激转录因子热激转录因子heat shock factor 1(HSF1)：负责热激启动子的转录：负责热激启动子的转录热激元件热激元件heat shock elements(HSEs)：HSF1特异结合在特异结合在DNA上的序列上的序列热激（诱导）启动子一般含有热激（诱导）启动子一般含有24个热激元件和一个个热激元件和一个TATA区区常温下常温下HSF1为单体，高温条件下变为有调节活性的三聚体，并和为单体，高温条件下变为有调节活性的三聚体，并和HSEs特异结合特异结合而启动转录而启动转录 Drosophila hsp70 Human hsp70 The soybean heat shock promoter Gmhsp17.5-E第36页，讲稿共62张，创作于星期二u诱导机理的普遍性诱导机理的普遍性 在真核细胞中普遍存在热激系统，在真核细胞中普遍存在热激系统，HSFHSF保守性高