目的基因的克隆与分离精选PPT.ppt

关于目的基因的克隆与关于目的基因的克隆与关于目的基因的克隆与关于目的基因的克隆与分离分离分离分离第1页，讲稿共121张，创作于星期二目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。第2页，讲稿共121张，创作于星期二第一节 基因组DNA片断化一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切第3页，讲稿共121张，创作于星期二由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。1.优点2.缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamH IBamH IBamH Igene第4页，讲稿共121张，创作于星期二二、随机片断化1.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。（1 1）限制性内切酶的选用原则）限制性内切酶的选用原则第5页，讲稿共121张，创作于星期二1）4bp的内切酶平均每46（4096）bp一个切点。2）6bp的内切酶平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。（Sau3ABamH I）第6页，讲稿共121张，创作于星期二2.机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。第7页，讲稿共121张，创作于星期二1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。第二节 化学合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。第8页，讲稿共121张，创作于星期二 保护dNTP的5端P 或3端-OH 用酸或碱的脱保护（1）原理1.磷酸二酯法 带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。带5保护的单核苷酸与带3保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。第9页，讲稿共121张，创作于星期二（2）合成过程下一个5端保护的单核苷酸又可以同3端保护的二核苷酸聚合。第10页，讲稿共121张，创作于星期二原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3端磷酸和5-OH上都先连接了一个保护基团。2.磷酸三酯法第11页，讲稿共121张，创作于星期二将第一个核苷酸的3-OH端固定在固相支持物上。固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。合成的二核苷酸连接处有三个酯键！第12页，讲稿共121张，创作于星期二固相磷酸三酯合成过程固相支持物结果是全保护的DNA：5 DMT,3固相支持物,核苷酸之间对氯苯。最后脱保护固相 支持物固相 支持物C第13页，讲稿共121张，创作于星期二化学合成的DNA片断一般在200bp以内。二、化学合成DNA片断的组装用T4多核苷酸激酶使各个片段的5端带上磷酸。1.互补连接法预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。（2）5端磷酸化（1）互补配对（合成的DNA单链的5端是-OH）第14页，讲稿共121张，创作于星期二T4 DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5-OH磷酸化完整的DNA双链（3）连接酶连成完整双链第15页，讲稿共121张，创作于星期二2.互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。3 5 5 3 5 3 T4DNA连接酶Klenow片段引物第16页，讲稿共121张，创作于星期二1.直接合成基因三、寡聚核苷酸化学合成的优点2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA 3.合成探针序列4.定点突变合成合成带有定点突变的基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低第17页，讲稿共121张，创作于星期二DNA合成仪5.合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor第18页，讲稿共121张，创作于星期二 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。一、基因文库的构建1.基因文库（gene library）第三节 目的基因的保存与文库构建第19页，讲稿共121张，创作于星期二（2）目前常用的载体 2.构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列：容量为 24 kp cosmid载体：容量为 50 kb YAC：容量为 1 Mb BAC:容量为 300 kb第20页，讲稿共121张，创作于星期二断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体DNA大片段的制备3.基因文库构建的一般步骤超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。酶切法：第21页，讲稿共121张，创作于星期二（2）载体与基因组DNA大片段的连接 粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamH I的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。第22页，讲稿共121张，创作于星期二各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端 同聚物加尾第23页，讲稿共121张，创作于星期二第24页，讲稿共121张，创作于星期二4.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因 组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）第25页，讲稿共121张，创作于星期二例如：人的基因组是 3109 bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7104 bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61GfN=4.61GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61Gf=4.6131091.7104=8.1105第26页，讲稿共121张，创作于星期二1.cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。2.cDNA library二、cDNA文库的构建mRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶引物利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。第27页，讲稿共121张，创作于星期二（1 1）不含内含子序列不含内含子序列。（2 2）可以在细菌中直接表达。）可以在细菌中直接表达。（3 3）包含了所有）包含了所有编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因。（4 4）比）比DNADNA文库小文库小的多，容易构建。的多，容易构建。4.构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（total RNA）提取3.cDNA文库的特点提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。第28页，讲稿共121张，创作于星期二分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化 原理 mRNA的分离纯化Column（柱）第29页，讲稿共121张，创作于星期二第30页，讲稿共121张，创作于星期二反转录酶（3）cDNA的合成 cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物第31页，讲稿共121张，创作于星期二用碱处理或用RNase H降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶引物mRNAcDNA第一链3 3 5 5 引物cDNA第一链3 5 引物 降解mRNA模板或RNaseH碱第32页，讲稿共121张，创作于星期二剩下的cDNA单链的3末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。cDNA第一链5 cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5 3 cDNA第二链合成第33页，讲稿共121张，创作于星期二去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链cDNA第二链5 3 cDNA第一链cDNA第二链5 3 5 3 第34页，讲稿共121张，创作于星期二第35页，讲稿共121张，创作于星期二这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。妙用妙用RNaseHRNaseH小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。DNA Pol I除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。第36页，讲稿共121张，创作于星期二mRNAcDNA3 5 反转录酶引物mRNAcDNA第一链3 5 引物mRNAcDNA第一链3 5 mRNAmRNADNA 聚合酶DNA 聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3 5 RNaseHDNA ligase去引物第37页，讲稿共121张，创作于星期二第38页，讲稿共121张，创作于星期二在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3端分别加上几个C或G，成为粘性末端。5.cDNA与载体连接：接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶第39页，讲稿共121张，创作于星期二第40页，讲稿共121张，创作于星期二6.cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N：所需的重组载体数（克隆数）1n1n第41页，讲稿共121张，创作于星期二三、文库的查询（screening）用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。文库载体探针电泳后杂交放射自显影测序分析第42页，讲稿共121张，创作于星期二第四节 目的基因的分离和扩增一、目的基因的分离1.探针柱分离特异mRNA根据已知的基因序列合成探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化该基因的mRNA。富集特定基因的mRNA或cDNA模板。第43页，讲稿共121张，创作于星期二纤维柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNATotal mRNA纤维柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA过柱与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。特异mRNA洗脱RT-PCR第44页，讲稿共121张，创作于星期二2.mRNA消解杂交原理：羟基磷灰石柱结合单链DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。（Hydroxylapatite column）第45页，讲稿共121张，创作于星期二从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。将表达A蛋白的组织mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。第46页，讲稿共121张，创作于星期二AAA组织B组织总mRNA（A）总mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA总cDNA第一链A杂交内含蛋白A 的cDNA羟磷灰石柱过柱吸收RNA-DNA单链滤过羟磷灰石柱BAPCRcDNA文库第47页，讲稿共121张，创作于星期二3.mRNA3.mRNA差异显示差异显示PCRPCR（DD RT-PCRDD RT-PCR）mRNA differential display RT-PCR原理：利用几乎所有mRNA3的polyA尾巴合成poly T 的锚定引物，逆转录成cDNA的第一链，然后加入随机引物合成第二链，得到与mRNA对应的标签，变性胶电泳，比较不同来源的cDNA带，有差异的基因进一步克隆。（1）3端的锚定引物Oligo(dT)引物的3端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NMTTTTTTTTM：A、G or C N:A、G、T or C5 3 第48页，讲稿共121张，创作于星期二（2）12种锚定引物AG TTTTTTTT5 3 CG TTTTTTTT5 3 GGTTTTTTTT5 3 TGTTTTTTTT5 3 AATTTTTTTT5 3 CATTTTTTTT5 3 GATTTTTTTT5 3 TATTTTTTTT5 3 ACTTTTTTTT5 3 CCTTTTTTTT5 3 GCTTTTTTTT5 3 TCTTTTTTTT5 3 第49页，讲稿共121张，创作于星期二（3）5端的随机引物10 mer AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NMTTTTTTTT5 3 扩增cDNA第一链。RTNM TTTTTTTT5 cDNA3 NNNNNNNNNN5 3 NNNNNNNNNN5 3 cDNA第二链，并PCR第50页，讲稿共121张，创作于星期二（4）随机引物与锚定引物成对扩增12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。引物组合：240组能分出20000多条带！实验结果：如果每条带相当于一种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。第51页，讲稿共121张，创作于星期二（5）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较不同组织的240组引物组合PCR产物在测序胶中电泳。选择有差异的带，进一步PCR作探针。筛选文库，找到差别基因的全长序列。第52页，讲稿共121张，创作于星期二二、PCR扩增获得目的基因1.直接从基因组中扩增（1）提取基因组DNA作模板（2）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增真核生物基因组含有内含子！适合扩增原核生物基因。第53页，讲稿共121张，创作于星期二原核基因组部分原核细胞提取基因组DNAPCR扩增第54页，讲稿共121张，创作于星期二（1）提取基因组 total RNA（2）反转录合成总cDNA作模板（4）PCR扩增（3）根据目的基因序列设计引物2.从mRNA中扩增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。适合扩增真核生物基因。第55页，讲稿共121张，创作于星期二目的基因 的引物1反转录成目的基因cDNA第一链目的基因 的引物2目的 基因cDNA第二链PCRmRNA第56页，讲稿共121张，创作于星期二克隆外源基因第57页，讲稿共121张，创作于星期二外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞第58页，讲稿共121张，创作于星期二第59页，讲稿共121张，创作于星期二一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与3-OH连到一起。第五节 DNA片段的体外连接第60页，讲稿共121张，创作于星期二1.两段DNA的连接依靠粘性末端第61页，讲稿共121张，创作于星期二2.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端第62页，讲稿共121张，创作于星期二第63页，讲稿共121张，创作于星期二ligasenick第64页，讲稿共121张，创作于星期二二、齐平末端（blunt end）的连接5端与3端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1.直接连接T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5 5 5 5 3 3 3 3-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3-OH-PP-HO-5 3 第65页，讲稿共121张，创作于星期二1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾法 2.人工加尾形成“粘性末端”DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。加尾碱基互补第66页，讲稿共121张，创作于星期二缺点：优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点第67页，讲稿共121张，创作于星期二用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物(linker)连接 linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCC CCTTAAGGEcoR I linker：linker的作用第68页，讲稿共121张，创作于星期二 第69页，讲稿共121张，创作于星期二 第70页，讲稿共121张，创作于星期二 缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:优点：第71页，讲稿共121张，创作于星期二（3 3）DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5 BamHI adapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。adapter的作用第72页，讲稿共121张，创作于星期二Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG-GGCCCTAG-P5 5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5 接头自我连接第73页，讲稿共121张，创作于星期二第74页，讲稿共121张，创作于星期二接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。优点：连上后就能用。缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）防止自我连接第75页，讲稿共121张，创作于星期二5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5 接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5 CIP处理-OHHO-第76页，讲稿共121张，创作于星期二Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P 5GATCCCGG-HO-GGCC CCGG-OH-GGCCCTAG5 5GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5 缺口缺口HO-OHCIP处理T4 ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。第77页，讲稿共121张，创作于星期二三、PCR产物的连接1.在引物的5端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3端1520bp与模板互补；5端610bp是某个内切酶的识别序列。（5端多余的35bp属保护碱基）避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。第78页，讲稿共121张，创作于星期二引物1GCAGAATTC 互补序列模板EcoR I位点5-3 GCAGAATTC 互补序列5-3 3 模板GCAGAATTC 互补序列 PCR产物5-3 3 复性延伸模板模板3 3 第79页，讲稿共121张，创作于星期二GCTAGCCGG 互补序列模板BamH I 位点-5 3-5 复性延伸模板模板3 3 GCTAGCCGG 互补序列-5 3-模板5 GCTAGCCGG PCR产物 互补序列-5 3-引物2第80页，讲稿共121张，创作于星期二带酶切位点的PCR产物GCAGAATTC PCR产物5-3 GCTAGCCGG PCR产物-5 3-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoR I位点BamH I位点AATTC PCR产物5-3 GCTAG PCR产物-5 3-GCEcoR IBamH I两头各有一个粘性末端！第81页，讲稿共121张，创作于星期二2.与T载体直接连接（1）PCR产物两个3端一般都有一个ATaq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。（2）T载体的两个3端人为地各加一个T利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！第82页，讲稿共121张，创作于星期二AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶载体PCR产物TATA第83页，讲稿共121张，创作于星期二四、DNA体外连接应注意的事项1.插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。决不能进行非粘性末端连接。第84页，讲稿共121张，创作于星期二EcoR IEcoR IEcoR I（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamH I、Bcl I、Bgl II、Sau3A I、Xho II都产生GATC4个碱基的粘性末端。第85页，讲稿共121张，创作于星期二2.DNA插入的方向正确用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoR IBamH IEcoR IBamH IEcoR IBamH I第86页，讲稿共121张，创作于星期二3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoR IEcoR IATGGAATTC T重组但移码突变！第87页，讲稿共121张，创作于星期二4.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。5 3 载体插入片断第88页，讲稿共121张，创作于星期二1.载体自身环化连接（能存活）2.载体之间互相连接（能存活）3.插入片段互相连接（不能存活）4.一个载体与几个插入片段重组（能存活）五、载体和外源DNA插入片段的连接结果5.几个载体与一个插入片段重组（能存活）第89页，讲稿共121张，创作于星期二第90页，讲稿共121张，创作于星期二1.目的增加受体菌细胞膜的通透性。第六节 重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备第91页，讲稿共121张，创作于星期二使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2.菌种第92页，讲稿共121张，创作于星期二第93页，讲稿共121张，创作于星期二用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理第94页，讲稿共121张，创作于星期二4.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4On ice 5-10 min4离心收集菌用 冰 冷 的60mM CaCl2重悬4离心收集菌4离 心收集菌分装、-70冻存用 冰 冷 的60mM CaCl2重悬On ice 30 min用 冰 冷 的60mM CaCl2重悬第95页，讲稿共121张，创作于星期二二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染（transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。1.外源DNA导入细菌的几种方法（3）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。第96页，讲稿共121张，创作于星期二每g DNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法 2.转化率简单，但转化效率不高（106-108/g DNA）。（1）热休克法（heat shock）转化效率高（高于109/g DNA）。（2 2）电转化法）电转化法 electronporation electronporation 第97页，讲稿共121张，创作于星期二10ng载体DNA100L感受态菌 On ice混合，静置10分钟42C 1分钟加入1mL LB培养基37摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法第98页，讲稿共121张，创作于星期二LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2离心集菌冰冷的水重悬菌体2离心集菌冰冷的水重悬菌体2离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成 50-300L 电转仪调为2.5kV,25F 脉冲控制器200-400 0.5g质粒DNA On ice混合加入1mLSOC培养液37中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化（2 2）电转化法）电转化法第99页，讲稿共121张，创作于星期二4.4.平板培养基平板培养基培养细菌培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37过夜第100页，讲稿共121张，创作于星期二环形重组质粒 质粒自我连接线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。环形质粒数（1）重组质粒）重组质粒 5.影响转化率的因素影响转化率的因素第101页，讲稿共121张，创作于星期二生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受态菌要在-70以下。CaCl2处理使用感受态菌时必须迅速融化。融化后一般不能再次冻存使用。（2 2）感受态细胞）感受态细胞）感受态细胞）感受态细胞 （competent cells)competent cells)第102页，讲稿共121张，创作于星期二把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。6.体外包装的噬菌体的转导体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（in vitro packaging）（2）转导（transduction）通 过 受 体 菌 细 胞 表 面 的DNA接 受 器 位 点（receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。第103页，讲稿共121张，创作于星期二cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到44-45时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857基因突变的基因突变的 噬菌体噬菌体 但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。第104页，讲稿共121张，创作于星期二cI857其它基因溶源状态（DNA不转录、不翻译）DNA阻遏 蛋白阻遏 蛋白44-45DNA转录、翻译合成外壳蛋白32第105页，讲稿共121张，创作于星期二噬菌体1外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突变的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。（4）互补型噬菌体）互补型噬菌体 外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。噬菌体2第106页，讲稿共121张，创作于星期二(5)体体外外包包装装过过程程 第107页，讲稿共121张，创作于星期二体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每g DNA能形成106噬菌斑）。（6）转导）转导 第108页，讲稿共121张，创作于星期二转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。第七节第七节 外源基因导入真核细胞外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞1.菌株选择如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31第109页，讲稿共121张，创作于星期二（1）利用原生质球进行转化 2.酵母的转化方法酵母的转化方法 酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因 的酵母载体PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。转化第110页，讲稿共121张，创作于星期二 酵母0.1mol/L LiCl处理插入外源基因的酵母载体感受态40%PEG 4000（2）利用）利用Li+盐进行转化盐进行转化第111页，讲稿共121张，创作于星期二叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗二、导入植物细胞二、导入植物细胞1.叶盘法（leaf disk)第112页，讲稿共121张，创作于星期二植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液1-2kV,3-25F电击愈伤组织幼苗分化2.2.电击法（电击法（电击法（电击法（electroporation)electroporation)第113页，讲稿共121张，创作于星期二又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles)DNA1.2m钨弹头 吸附特制手枪射击植物装入3.3.基因枪法（基因枪法（基因枪法（基因枪法（gene gungene gun）4.农杆菌（agrobacterium）介导（详见另外章节）第114页，讲稿共121张，创作于星期二（1）原理：三、导入哺乳动物细胞三、导入哺乳动物细胞三、导入哺乳动物细胞三、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。第115页，讲稿共121张，创作于星期二不需要载体。（2 2）特点：）特点：）特点：）特点：第116页，讲稿共121张，创作于星期二脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。2.2.脂质体（脂质体（脂质体（脂质体（lipofectinlipofectin）载体法）载体法）载体法）载体法脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。第117页，讲稿共121张，创作于星期二直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。3.3.显微注射法显微注射法显微注射法显微注射法(microinjection)(microinjection)第118页，讲稿共121张，创作于星期二二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。4.DEAE4.DEAE葡萄糖传染法葡萄糖传染法葡萄糖传染法葡萄糖传染法葡聚糖葡聚糖+DNA吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。第119页，讲稿共121张，创作于星期二DEAE-dextran细胞外源DNA预处理摄入DEAE-dextran外源DNA细胞混合DEAE-dextran对细胞有毒!5.病毒（virus）介导（详见另外章节）葡聚糖葡聚糖第120页，讲稿共121张，创作于星期二感谢大家观看第121页，讲稿共121张，创作于星期二