目的基因的制备精选PPT.ppt

关于目的基因的制备关于目的基因的制备第1页，讲稿共83张，创作于星期二n n目的基因：目的基因：那些已被或者准备要分离、改造、那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或扩增或表达的特定基因或DNADNA片段，片段，编码蛋白质编码蛋白质（酶）的结构基因。（酶）的结构基因。n n外源基因：外源基因：插入到载体内的那个特定的片段插入到载体内的那个特定的片段基因。基因。第2页，讲稿共83张，创作于星期二经典原核克隆体系流程图核酸限制核酸限制核酸限制核酸限制内切酶消化内切酶消化内切酶消化内切酶消化机械切割机械切割机械切割机械切割双链双链双链双链cDNAcDNA合成合成合成合成直接直接直接直接化学合成化学合成化学合成化学合成PCRPCR扩增扩增扩增扩增含目的基因含目的基因含目的基因含目的基因片段的获得片段的获得片段的获得片段的获得同聚物加尾同聚物加尾同聚物加尾同聚物加尾法连接法连接法连接法连接粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端连接连接连接连接平末端平末端平末端平末端连接连接连接连接接头或接头或接头或接头或衔接物分子衔接物分子衔接物分子衔接物分子重组噬菌体重组噬菌体重组噬菌体重组噬菌体DNADNA的的的的转染转染转染转染重组质粒重组质粒重组质粒重组质粒的的的的转化转化转化转化重组噬菌体重组噬菌体重组噬菌体重组噬菌体DNADNA或柯斯质粒或柯斯质粒或柯斯质粒或柯斯质粒体外包装成噬菌体颗粒的体外包装成噬菌体颗粒的体外包装成噬菌体颗粒的体外包装成噬菌体颗粒的转导转导转导转导目的基因序列测定目的基因序列测定目的基因序列测定目的基因序列测定体外重组体外重组体外重组体外重组导入宿导入宿导入宿导入宿主细胞主细胞主细胞主细胞筛选筛选筛选筛选T-AT-A克隆克隆克隆克隆遗传标遗传标遗传标遗传标记检测记检测记检测记检测结构分结构分结构分结构分析筛选析筛选析筛选析筛选免疫学免疫学免疫学免疫学筛选筛选筛选筛选核酸杂核酸杂核酸杂核酸杂交筛选交筛选交筛选交筛选免疫印免疫印免疫印免疫印迹筛选迹筛选迹筛选迹筛选转译转译转译转译筛选筛选筛选筛选第3页，讲稿共83张，创作于星期二1 1 基因组基因组基因组基因组DNADNA片断化片断化片断化片断化2 PCR2 PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因技术扩增目的基因技术扩增目的基因3 3 化学合成基因化学合成基因化学合成基因化学合成基因4 基因文库技术获取目的基因基因文库技术获取目的基因基因文库技术获取目的基因基因文库技术获取目的基因 基因组文库的构建基因组文库的构建基因组文库的构建基因组文库的构建 cDNA文库的构建文库的构建文库的构建文库的构建目的基因的获取目的基因的获取第4页，讲稿共83张，创作于星期二 1 1 基因组基因组DNADNA片断化片断化1.1 1.1 限制性内切核酸酶酶切法限制性内切核酸酶酶切法限制性内切核酸酶酶切法限制性内切核酸酶酶切法n n该法适于从该法适于从简单基因组中分离目的基因简单基因组中分离目的基因简单基因组中分离目的基因简单基因组中分离目的基因，如质粒和病毒等，如质粒和病毒等，如质粒和病毒等，如质粒和病毒等DNA DNA。BamH I 和和EcoR I 酶切，可获得目的基因。酶切，可获得目的基因。第5页，讲稿共83张，创作于星期二特点：优点：优点：由于带有粘性末端，产物可以直接与载体由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。连接。缺点：缺点：目的基因目的基因目的基因目的基因内部内部内部内部也可能有该内切酶的切点。目的也可能有该内切酶的切点。目的也可能有该内切酶的切点。目的也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！基因也被切成碎片！基因也被切成碎片！基因也被切成碎片！BamH IBamH IBamH Igene第6页，讲稿共83张，创作于星期二1.2 机械切割法1）超声波）超声波）超声波）超声波 超声波强烈作用于超声波强烈作用于超声波强烈作用于超声波强烈作用于DNADNA，可使其断裂成约，可使其断裂成约，可使其断裂成约，可使其断裂成约300bp300bp的的的的随机片断。随机片断。随机片断。随机片断。2 2）高速搅拌）高速搅拌）高速搅拌）高速搅拌 15001500转转转转/分下搅拌分下搅拌分下搅拌分下搅拌30min，可产生约，可产生约，可产生约，可产生约8kb8kb的随机片断。的随机片断。的随机片断。的随机片断。第7页，讲稿共83张，创作于星期二1 1 基因组基因组DNADNA片断化片断化片断化片断化2 PCR2 PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因技术扩增目的基因技术扩增目的基因3 3 化学合成基因化学合成基因化学合成基因化学合成基因4 基因文库技术获取目的基因基因文库技术获取目的基因基因文库技术获取目的基因基因文库技术获取目的基因 基因组文库的构建基因组文库的构建基因组文库的构建基因组文库的构建 cDNA文库的构建文库的构建文库的构建文库的构建目的基因的获取目的基因的获取第8页，讲稿共83张，创作于星期二PCR，Polymerase Chain Reaction （1）反应体系：）反应体系：n n含有目的基因或序列的含有目的基因或序列的含有目的基因或序列的含有目的基因或序列的DNA模板模板n n 热稳定的热稳定的DNADNA聚合酶（聚合酶（聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）酶）酶）酶）n n一对脱氧寡核苷酸引物（一对脱氧寡核苷酸引物（一对脱氧寡核苷酸引物（一对脱氧寡核苷酸引物（primer）n n4 4种脱氧核苷三磷酸种脱氧核苷三磷酸种脱氧核苷三磷酸种脱氧核苷三磷酸(dNTP)(dNTP)n nBufferBuffer及及及及Mg Mg 2+2+等等 第9页，讲稿共83张，创作于星期二5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 （2 2）基本工作原理）基本工作原理第10页，讲稿共83张，创作于星期二Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的的含量可以扩大含量可以扩大100万倍以上。万倍以上。第11页，讲稿共83张，创作于星期二（3 3）PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C第12页，讲稿共83张，创作于星期二|如果知道目的基因的全序列或其两侧的序列，可以如果知道目的基因的全序列或其两侧的序列，可以合成一对与模板合成一对与模板DNA 互补的引物，利用互补的引物，利用互补的引物，利用互补的引物，利用PCRPCR技术扩技术扩增出含目的基因的增出含目的基因的DNA DNA 片段。片段。片段。片段。2 利用利用PCR扩增目的基因扩增目的基因第13页，讲稿共83张，创作于星期二局限性：局限性：n n必须知道侧接靶序列的核苷酸序列，以制备引物。必须知道侧接靶序列的核苷酸序列，以制备引物。必须知道侧接靶序列的核苷酸序列，以制备引物。必须知道侧接靶序列的核苷酸序列，以制备引物。n n常规常规常规常规PCR PCR 扩增片段一般在扩增片段一般在扩增片段一般在扩增片段一般在lkb lkb 以内。以内。以内。以内。n n未知序列的目的基因和大片段基因的扩增，则需要未知序列的目的基因和大片段基因的扩增，则需要未知序列的目的基因和大片段基因的扩增，则需要未知序列的目的基因和大片段基因的扩增，则需要特殊类型的特殊类型的特殊类型的特殊类型的PCRPCR ：n n套式套式套式套式PCRPCR、反向、反向、反向、反向PCRPCR、不对称、不对称、不对称、不对称PCRPCR、多重多重多重多重PCRPCR、锚定、锚定、锚定、锚定PCRPCR、长程、长程、长程、长程PCRPCR、反转录、反转录、反转录、反转录PCRPCR、荧光定量、荧光定量、荧光定量、荧光定量PCR PCR 和原位和原位和原位和原位PCRPCR等。等。等。等。第14页，讲稿共83张，创作于星期二1）Nested pcr（套式套式套式套式PCR）n n特点特点特点特点:需要设计两对引物，一对引物扩增稍长片段，在需要设计两对引物，一对引物扩增稍长片段，在需要设计两对引物，一对引物扩增稍长片段，在需要设计两对引物，一对引物扩增稍长片段，在这一扩增范围内再设计一对引物，扩增的产物是以第这一扩增范围内再设计一对引物，扩增的产物是以第这一扩增范围内再设计一对引物，扩增的产物是以第这一扩增范围内再设计一对引物，扩增的产物是以第一对引物的产物为模版一对引物的产物为模版一对引物的产物为模版一对引物的产物为模版 n n套式套式套式套式PCR 通过内外引物进行两次扩增，大大提高了通过内外引物进行两次扩增，大大提高了通过内外引物进行两次扩增，大大提高了通过内外引物进行两次扩增，大大提高了检测的敏感性检测的敏感性检测的敏感性检测的敏感性 第15页，讲稿共83张，创作于星期二2）反向反向PCR（Inverse PCR）基本原理：基本原理：基本原理：基本原理：n n扩增一段已知序列旁侧的扩增一段已知序列旁侧的扩增一段已知序列旁侧的扩增一段已知序列旁侧的DNA，在引物外侧合成，在引物外侧合成，在引物外侧合成，在引物外侧合成DNA。第16页，讲稿共83张，创作于星期二已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列连接酶连接酶第17页，讲稿共83张，创作于星期二3）不对称）不对称PCR 目的：目的：扩增产生特异长度的单链扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物，最佳比例一方法：采用两种不同浓度的引物，最佳比例一 般是般是0.01 0.5M。第18页，讲稿共83张，创作于星期二 高浓度引物低浓度引物第19页，讲稿共83张，创作于星期二 以其中的以其中的以其中的以其中的mRNAmRNA作为模板，作为模板，作为模板，作为模板，以以以以 OligoOligo（dTdT）或）或）或）或 随机引物随机引物随机引物随机引物 或或或或 基因特异性为引物，利用基因特异性为引物，利用基因特异性为引物，利用基因特异性为引物，利用逆转录酶反转录成逆转录酶反转录成逆转录酶反转录成逆转录酶反转录成cDNAcDNA。以以以以cDNAcDNA为模板进行为模板进行为模板进行为模板进行PCR PCR 扩扩扩扩增，而获得目的基因或检测基因增，而获得目的基因或检测基因增，而获得目的基因或检测基因增，而获得目的基因或检测基因表达表达表达表达 4 4）RT-PCR:RT-PCR:提取组织或细胞中的总提取组织或细胞中的总提取组织或细胞中的总提取组织或细胞中的总RNARNA第20页，讲稿共83张，创作于星期二5 5）多重）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引在一个反应体系中使用一对以上引在一个反应体系中使用一对以上引在一个反应体系中使用一对以上引物的物的物的物的PCRPCR称，其结果是产生多个称，其结果是产生多个称，其结果是产生多个称，其结果是产生多个PCRPCR产物，产物，产物，产物，用于用于用于用于检检检检测特定基因序列的存在或缺失。测特定基因序列的存在或缺失。测特定基因序列的存在或缺失。测特定基因序列的存在或缺失。电电电电泳泳泳泳引物引物第21页，讲稿共83张，创作于星期二6）原位）原位PCRa.a.将样品组织切片或细胞涂片，然后固定在载玻片将样品组织切片或细胞涂片，然后固定在载玻片将样品组织切片或细胞涂片，然后固定在载玻片将样品组织切片或细胞涂片，然后固定在载玻片上；上；上；上；b.b.加热变性，加引物、加热变性，加引物、加热变性，加引物、加热变性，加引物、dNTPdNTP、TaqDNA聚合酶到载聚合酶到载聚合酶到载聚合酶到载玻片上玻片上玻片上玻片上c.c.在在在在原位原位原位原位 PCRPCR仪仪内进行内进行内进行内进行PCR扩增、检测。扩增、检测。扩增、检测。扩增、检测。d.d.可以检测组织细胞中微量可以检测组织细胞中微量可以检测组织细胞中微量可以检测组织细胞中微量DNA或或或或RNARNA，且可精确，且可精确，且可精确，且可精确定位定位定位定位 人类染色体端粒人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片的荧光原位杂交照片 第22页，讲稿共83张，创作于星期二7）定量）定量PCR：荧光实时定量荧光实时定量PCRPCR技术是指在技术是指在技术是指在技术是指在PCR反应体系中加反应体系中加反应体系中加反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCRPCR进进进进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法法法法 。第23页，讲稿共83张，创作于星期二1 1 基因组基因组DNA片断化片断化片断化片断化2 PCR2 PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因技术扩增目的基因技术扩增目的基因3 化学合成基因化学合成基因化学合成基因化学合成基因4 4 基因文库技术获取目的基因基因文库技术获取目的基因基因文库技术获取目的基因基因文库技术获取目的基因 基因组文库的构建基因组文库的构建 cDNAcDNA文库的构建文库的构建文库的构建文库的构建目的基因的获取目的基因的获取第24页，讲稿共83张，创作于星期二3 化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNADNA序列序列序列序列第25页，讲稿共83张，创作于星期二基因的化学合成n n2020世纪世纪世纪世纪7070年代，年代，年代，年代，KhoranaKhorana提出，提出，提出，提出，n n 提出体外扩增提出体外扩增提出体外扩增提出体外扩增DNADNA1922-）印度）印度-美国化学家美国化学家 遗传密码的破译，获得遗传密码的破译，获得1968年诺贝尔医学和生年诺贝尔医学和生理学奖。理学奖。第26页，讲稿共83张，创作于星期二3.1 DNA合成仪的基合成仪的基本工作原理是：本工作原理是：n n将要合成的将要合成的将要合成的将要合成的DNADNA片段片段片段片段33端的第一个核苷酸端的第一个核苷酸端的第一个核苷酸端的第一个核苷酸固定固定固定固定于于于于不溶性载体上不溶性载体上不溶性载体上不溶性载体上n n该核苷酸开始与另一核苷酸进行该核苷酸开始与另一核苷酸进行该核苷酸开始与另一核苷酸进行该核苷酸开始与另一核苷酸进行缩合反应缩合反应缩合反应缩合反应，形成，形成，形成，形成二核苷酸分子二核苷酸分子二核苷酸分子二核苷酸分子n n通过酸或碱通过酸或碱通过酸或碱通过酸或碱洗脱洗脱洗脱洗脱其一端的保护基团，再次与另一其一端的保护基团，再次与另一其一端的保护基团，再次与另一其一端的保护基团，再次与另一个个个个5 5 或或或或33保护的核苷酸分子进行第二次缩合反应，保护的核苷酸分子进行第二次缩合反应，保护的核苷酸分子进行第二次缩合反应，保护的核苷酸分子进行第二次缩合反应，形成三核苷酸分子；形成三核苷酸分子；形成三核苷酸分子；形成三核苷酸分子；n n再用同样的步骤与下一个核苷酸进行循环反应。再用同样的步骤与下一个核苷酸进行循环反应。再用同样的步骤与下一个核苷酸进行循环反应。再用同样的步骤与下一个核苷酸进行循环反应。n n接长的链始终被固定在不溶的固相载体上，接长的链始终被固定在不溶的固相载体上，接长的链始终被固定在不溶的固相载体上，接长的链始终被固定在不溶的固相载体上，合成结束后，将寡核苷酸链从固相载体上合成结束后，将寡核苷酸链从固相载体上合成结束后，将寡核苷酸链从固相载体上合成结束后，将寡核苷酸链从固相载体上洗洗洗洗脱脱脱脱下来。下来。下来。下来。第27页，讲稿共83张，创作于星期二3.2 DNA片断的组装化学合成的化学合成的化学合成的化学合成的DNADNA片断一般在片断一般在200bp以内。以内。3.2.1 3.2.1 互补连接法互补连接法互补连接法互补连接法1 1 1 1）互补配对）互补配对 预先设计合成的片断之间都有预先设计合成的片断之间都有预先设计合成的片断之间都有预先设计合成的片断之间都有互补区域互补区域互补区域互补区域，不同片断，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。之间的互补区域能形成有断点的完整双链。2 2 2 2）5端磷酸化端磷酸化端磷酸化端磷酸化 用用用用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使各个片段的使各个片段的使各个片段的使各个片段的55端带上磷酸。端带上磷酸。端带上磷酸。端带上磷酸。（合成的（合成的（合成的（合成的DNADNADNADNA单链的单链的单链的单链的55端是端是端是端是-OH-OH-OH-OH）第28页，讲稿共83张，创作于星期二T4 DNA连接酶连接酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使使5-OH磷酸化磷酸化完整的完整的DNA双链双链3）连接酶连成完整双链第29页，讲稿共83张，创作于星期二3.2.2 互补延伸连接法预先设计的片断之间有预先设计的片断之间有局部互补区局部互补区局部互补区局部互补区，可以相互作为另，可以相互作为另，可以相互作为另，可以相互作为另一个片断延长的引物，用一个片断延长的引物，用一个片断延长的引物，用一个片断延长的引物，用DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶延伸成完整的双延伸成完整的双延伸成完整的双延伸成完整的双链。链。链。链。3 5 5 3 5 3 T4DNA连接酶连接酶Klenow片段片段引物引物第30页，讲稿共83张，创作于星期二化学合成法优缺点化学合成法优缺点n n优点：优点：准确性极高，合成速度较快准确性极高，合成速度较快n n缺点：缺点：合成的寡核苷酸链长度短合成的寡核苷酸链长度短(不大于不大于8080个个碱基碱基)n n一般用于一般用于PCRPCR引物、寡核苷酸探针、人工接头引物、寡核苷酸探针、人工接头或或衔接物序列衔接物序列、较小基因的合成。、较小基因的合成。第31页，讲稿共83张，创作于星期二n n对于高等真核生物而言，基因组对于高等真核生物而言，基因组对于高等真核生物而言，基因组对于高等真核生物而言，基因组DNADNA十分庞大十分庞大十分庞大十分庞大,基因可达数基因可达数基因可达数基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列.n n因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。第32页，讲稿共83张，创作于星期二n n为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增基因扩增基因扩增基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。，增加成功分离目的基因的可能性。n n但是由于要分离的目的基因往往是但是由于要分离的目的基因往往是但是由于要分离的目的基因往往是但是由于要分离的目的基因往往是未知基因未知基因，因，因此无法对它进行特异性扩增，此无法对它进行特异性扩增，n n只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库材料的基因文库材料的基因文库材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克，然后再根据不同的方法将所需的克，然后再根据不同的方法将所需的克，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。隆筛选出来，最后分离得到目的基因。隆筛选出来，最后分离得到目的基因。隆筛选出来，最后分离得到目的基因。第33页，讲稿共83张，创作于星期二1 基因组基因组基因组基因组DNADNA片断化片断化片断化片断化2 PCR2 PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因技术扩增目的基因技术扩增目的基因3 3 化学合成基因化学合成基因化学合成基因化学合成基因4 4 基因文库技术获取目的基因基因文库技术获取目的基因基因文库技术获取目的基因基因文库技术获取目的基因 基因组文库的构建基因组文库的构建基因组文库的构建基因组文库的构建 cDNAcDNA文库的构建文库的构建文库的构建文库的构建目的基因的获取目的基因的获取第34页，讲稿共83张，创作于星期二 基因文库基因文库基因文库基因文库(gene library)：指某一生物类型全部基因的指某一生物类型全部基因的集合。以重组体形式出现。集合。以重组体形式出现。n n基因文库由外源基因文库由外源基因文库由外源基因文库由外源DNADNA片段、载体和宿主组成。片段、载体和宿主组成。n n一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息传信息传信息传信息(即全部即全部即全部即全部DNADNA序列序列序列序列)。4 基因文库技术分离目的基因基因文库技术分离目的基因第35页，讲稿共83张，创作于星期二基因文库构建的基本程序：基因文库构建的基本程序：基因文库构建的基本程序：基因文库构建的基本程序：DNADNA提取及片段化，或是提取及片段化，或是提取及片段化，或是提取及片段化，或是cDNAcDNA的合成。的合成。的合成。的合成。载体的选择及制备。载体的选择及制备。DNA片段或片段或片段或片段或cDNAcDNA与载体连接。与载体连接。与载体连接。与载体连接。重组体转化宿主细胞。重组体转化宿主细胞。转化细胞的筛选。转化细胞的筛选。转化细胞的筛选。转化细胞的筛选。第36页，讲稿共83张，创作于星期二限制性限制性内切酶内切酶克隆、转化、培养、鉴定克隆、转化、培养、鉴定基因组基因组DNA基因文库基因文库第37页，讲稿共83张，创作于星期二基因文库技术分离目的基因基因文库技术分离目的基因-未知基因未知基因基因的克隆：基因的克隆：获得含重组获得含重组DNA的宿主细胞的宿主细胞n n克隆基因的分离克隆基因的分离:从文库中分离出目的基因从文库中分离出目的基因n n分离基因的鉴定分离基因的鉴定:确定基因的结构及功能确定基因的结构及功能 第38页，讲稿共83张，创作于星期二3）基因文库的类别）基因文库的类别基因组文库与基因组文库与cDNA文库文库n n基因组文库：基因组文库：指将某生物的全部基因组指将某生物的全部基因组DNA切切割成一定长度的割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上片段克隆到某种载体上而形成的集合。而形成的集合。n n基因组文库分为：核基因组文库、叶绿体基因组基因组文库分为：核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。文库及线粒体基因组文库。第39页，讲稿共83张，创作于星期二n ncDNA文库文库：是指某生物基因组转录的：是指某生物基因组转录的mRNA经反转录形成的经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。成的克隆的集合。n ncDNA(complementary DNA，互补，互补DNA)：是：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的的mRNA经体外反转录后形成的互补经体外反转录后形成的互补DNA。第40页，讲稿共83张，创作于星期二结构基因结构基因外显子外显子内含子内含子转录、加工修饰转录、加工修饰mRNA克隆、转化、培养、鉴定克隆、转化、培养、鉴定cDNA文库文库第41页，讲稿共83张，创作于星期二 基因组文库的概念和大小基因组文库的概念和大小 噬菌体基因组文库的构建噬菌体基因组文库的构建噬菌体基因组文库的构建噬菌体基因组文库的构建 4.1 基因组文库构建基因组文库构建第42页，讲稿共83张，创作于星期二基因组基因组DNA文库的类型文库的类型 根据所选用的载体可以分为：根据所选用的载体可以分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。酵母人工染色体文库）。4.1 基因组文库的构建基因组文库的构建第43页，讲稿共83张，创作于星期二一个理想的基因组文库要有足够多的克隆子数，保证所有的一个理想的基因组文库要有足够多的克隆子数，保证所有的一个理想的基因组文库要有足够多的克隆子数，保证所有的一个理想的基因组文库要有足够多的克隆子数，保证所有的基因都在克隆子群体中。基因都在克隆子群体中。基因都在克隆子群体中。基因都在克隆子群体中。以某生物基因组约以某生物基因组约3 10106 6kbkb，酶切片段平均长度，酶切片段平均长度15kb。理论克隆数：理论克隆数：理论克隆数：理论克隆数：基因组基因组基因组基因组DNADNA总长总长总长总长 DNADNA片段平均长度片段平均长度片段平均长度片段平均长度 3 106/15=2 1054.1.1 基因组文库的大小基因组文库的大小实际克隆数：实际克隆数：实际克隆数：实际克隆数：ppDNADNA片段是随机克隆的，因此理论值只是基因组文库所需要的最小数片段是随机克隆的，因此理论值只是基因组文库所需要的最小数片段是随机克隆的，因此理论值只是基因组文库所需要的最小数片段是随机克隆的，因此理论值只是基因组文库所需要的最小数值。值。值。值。pp一个完全的基因文库就必须含有更多的重组体克隆数。一个完全的基因文库就必须含有更多的重组体克隆数。一个完全的基因文库就必须含有更多的重组体克隆数。一个完全的基因文库就必须含有更多的重组体克隆数。文库理论克隆子数文库理论克隆子数文库理论克隆子数文库理论克隆子数第44页，讲稿共83张，创作于星期二以上的例子，以上的例子，以上的例子，以上的例子，NN值应是：值应是：值应是：值应是：（0.990.99）1-（15/315/3 106 6 ）(1975年，年，年，年，L.ClarkL.Clark和和J.CarbonJ.Carbon的经验公式：的经验公式：文库实际克隆子数文库实际克隆子数文库实际克隆子数文库实际克隆子数 N N（）（）（）（）（）（）（）（）N:N:基因组文库必需的克隆子数；基因组文库必需的克隆子数；基因组文库必需的克隆子数；基因组文库必需的克隆子数；P:P:文库中目的基因出现的机率，一般情况下期望值文库中目的基因出现的机率，一般情况下期望值文库中目的基因出现的机率，一般情况下期望值文库中目的基因出现的机率，一般情况下期望值9999，即，即，即，即0.990.99:分离的分离的分离的分离的DNA DNA 片段平均大小与基因组大小的比值。片段平均大小与基因组大小的比值。片段平均大小与基因组大小的比值。片段平均大小与基因组大小的比值。一个完全的基因文库必须含有一个完全的基因文库必须含有一个完全的基因文库必须含有一个完全的基因文库必须含有3-103-10倍于最低重组体克隆数的克隆。倍于最低重组体克隆数的克隆。倍于最低重组体克隆数的克隆。倍于最低重组体克隆数的克隆。N=N=9=9 101053 3 10106 6/15=2 /15=2 10 105 5第45页，讲稿共83张，创作于星期二基因组文库应具有的克隆子数基因组文库应具有的克隆子数第46页，讲稿共83张，创作于星期二 连接克隆载体的选择连接克隆载体的选择 质粒载体可承载质粒载体可承载质粒载体可承载质粒载体可承载 15kb DNA15kb DNA片段片段片段片段 载体载体载体载体 23kb DNA23kb DNA片段片段片段片段 Cosmid Cosmid 载体载体载体载体 45kb DNA45kb DNA片段片段 YAC文库文库 4000 kb4000 kb BAC BAC文库文库文库文库 300 kb300 kb第47页，讲稿共83张，创作于星期二 基因组文库的概念和大小基因组文库的概念和大小基因组文库的概念和大小基因组文库的概念和大小 噬菌体基因组文库的构建噬菌体基因组文库的构建 4.1 基因组文库构建基因组文库构建第48页，讲稿共83张，创作于星期二1）载体的特点：）载体的特点：n n 噬菌体是一种温和噬菌体，可保存在大肠杆菌中。噬菌体是一种温和噬菌体，可保存在大肠杆菌中。噬菌体是一种温和噬菌体，可保存在大肠杆菌中。噬菌体是一种温和噬菌体，可保存在大肠杆菌中。n n承载较大外源承载较大外源承载较大外源承载较大外源DNADNA，约，约，约，约23kb23kb。n n有多种限制酶识别位点。有多种限制酶识别位点。有多种限制酶识别位点。有多种限制酶识别位点。4.1.2 噬菌体基因组文库噬菌体基因组文库第49页，讲稿共83张，创作于星期二获得含目的基因的获得含目的基因的DNA片段片段与与噬菌体载体重组噬菌体载体重组重组重组DNA的包装的包装转化受体菌转化受体菌2 2）构建）构建）构建）构建噬菌体基因组文库的步骤噬菌体基因组文库的步骤噬菌体基因组文库的步骤噬菌体基因组文库的步骤重组克隆的挑选和保存重组克隆的挑选和保存 第50页，讲稿共83张，创作于星期二 目的基因目的基因DNA片段化片段化n n方法：方法：超声波处理超声波处理限制性内切酶部分酶切限制性内切酶部分酶切第51页，讲稿共83张，创作于星期二A 机械切割法（超声波处理）：机械切割法（超声波处理）：n n优点：优点：可获得较均一的随机片段，可获得较均一的随机片段，可获得较均一的随机片段，可获得较均一的随机片段，n n缺点：缺点：缺点：缺点：DNA片段呈平末端，片段不能直接用于克隆，片段呈平末端，片段不能直接用于克隆，片段呈平末端，片段不能直接用于克隆，片段呈平末端，片段不能直接用于克隆，需经末端修饰，连上接头后再用限制性内切酶消化产生需经末端修饰，连上接头后再用限制性内切酶消化产生需经末端修饰，连上接头后再用限制性内切酶消化产生需经末端修饰，连上接头后再用限制性内切酶消化产生黏性末端。黏性末端。黏性末端。黏性末端。B 限制酶消化限制酶消化：选用四或六核苷酸的限制性内切酶，如：选用四或六核苷酸的限制性内切酶，如：选用四或六核苷酸的限制性内切酶，如：选用四或六核苷酸的限制性内切酶，如：（GATCGATC）Sau3A ISau3A I或或Mbo IMbo I、BamH I(GGATCC)等。等。等。等。n n优点：优点：优点：优点：直接产生黏性末端，直接产生黏性末端，n n缺点：缺点：缺点：缺点：片段的随机性较差。片段的随机性较差。片段的随机性较差。片段的随机性较差。第52页，讲稿共83张，创作于星期二 载体的结构载体的结构n n左臂：左臂：左臂：左臂：编码噬菌体头部和尾部蛋白的基因编码噬菌体头部和尾部蛋白的基因编码噬菌体头部和尾部蛋白的基因编码噬菌体头部和尾部蛋白的基因n n右臂：右臂：右臂：右臂：复制起始点、转录启动区和其它必须基因复制起始点、转录启动区和其它必须基因n n左臂和右臂末端的左臂和右臂末端的CosCos位点位点位点位点n n中央片段中央片段：不含必须基因：不含必须基因：不含必须基因：不含必须基因第53页，讲稿共83张，创作于星期二基因文库基因文库 Sau3AI或或MboI密度梯度离心密度梯度离心或电泳或电泳第54页，讲稿共83张，创作于星期二YACYAC基因组文库的构建过程基因组文库的构建过程基因组文库的构建过程基因组文库的构建过程脉冲电场凝胶电泳脉冲电场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)第55页，讲稿共83张，创作于星期二1 1 基因组基因组基因组基因组DNA片断化片断化片断化片断化2 PCR2 PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3 3 化学合成基因化学合成基因化学合成基因化学合成基因4 4 基因文库技术获取目的基因基因文库技术获取目的基因基因文库技术获取目的基因基因文库技术获取目的基因 基因组文库的构建基因组文库的构建 cDNAcDNA文库的构建文库的构建文库的构建文库的构建目的基因的获取目的基因的获取第56页，讲稿共83张，创作于星期二4.2 cDNA基因文库的构建及目的基因分离基因文库的构建及目的基因分离4.2.1 cDNA基因文库的概念基因文库的概念cDNA文库：文库：是指某生物基因组转录的是指某生物基因组转录的mRNA经反经反转录形成的转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。的克隆的集合。4.2.2 cDNA基因文库的构建基因文库的构建4.2.3 mRNA丰度与丰度与cDNA基因文库大小的关系基因文库大小的关系4.2.4 cDNA克隆的优越性克隆的优越性第57页，讲稿共83张，创作于星期二4.2.2 cDNA基因文库的构建基因文库的构建主要步骤：主要步骤：从生物体或细胞中提取从生物体或细胞中提取从生物体或细胞中提取从生物体或细胞中提取mRNAmRNA；利用逆转录酶合成利用逆转录酶合成利用逆转录酶合成利用逆转录酶合成cDNAcDNA的第一条链；的第一条链；的第一条链；的第一条链；利用利用利用利用DNADNA聚合酶，以聚合酶，以聚合酶，以聚合酶，以cDNAcDNA第一条链作为模板，用第一条链作为模板，用适当引物合成适当引物合成cDNAcDNA第二条链，第二条链，第二条链，第二条链，cDNAcDNA与载体的重组后导入大肠杆菌宿主细胞增值。与载体的重组后导入大肠杆菌宿主细胞增值。与载体的重组后导入大肠杆菌宿主细胞增值。与载体的重组后导入大肠杆菌宿主细胞增值。第58页，讲稿共83张，创作于星期二n nmRNA的提取的提取全长全长mRNA具有一个具有一个polyA的的3末端，可以被末端，可以被用于用于mRNA的分离；的分离；用寡聚纤维素柱，选择性用寡聚纤维素柱，选择性地吸附地吸附mRNA纯化纯化第59页，讲稿共83张，创作于星期二 分离细胞总分离细胞总分离细胞总分离细胞总RNARNA，从中分离纯化，从中分离纯化，从中分离纯化，从中分离纯化mRNAmRNA；合成合成合成合成cDNAcDNA的第一条链：的第一条链：的第一条链：的第一条链：a.oligo(dT)a.oligo(dT)引导的引导的引导的引导的DNADNA合成法：合成法：合成法：合成法：n n原理：原理：原理：原理：真核真核真核真核mRNAmRNA分子具有分子具有分子具有分子具有poly(A)poly(A)尾巴，加入尾巴，加入尾巴，加入尾巴，加入oligo(dT)oligo(dT)短短短短 片段，由反转录酶合成片段，由反转录酶合成片段，由反转录酶合成片段，由反转录酶合成cDNAcDNA的第一链。的第一链。的第一链。的第一链。n n缺陷：缺陷：缺陷：缺陷：逆转录酶通常无法到达逆转录酶通常无法到达逆转录酶通常无法到达逆转录酶通常无法到达mRNAmRNA分子的分子的分子的分子的5-5-末端，必须末端，必须末端，必须末端，必须 从从从从3-3-末端开始合成末端开始合成末端开始合成末端开始合成cDNAcDNA。第60页，讲稿共83张，创作于星期二b.随机引物引导的随机引物引导的cDNA合成法合成法：n n原理：原理：原理：原理：n n随机引物：随机引物：随机引物：随机引物：人工合成的含有各种可能的排列顺序的六人工合成的含有各种可能的排列顺序的六人工合成的含有各种可能的排列顺序的六人工合成的含有各种可能的排列顺序的六核苷酸片段的混合物，可以与任何核酸片段杂交，并核苷酸片段的混合物，可以与任何核酸片段杂交，并核苷酸片段的混合物，可以与任何