生物技术概论基因工程精选PPT.ppt

关于生物技术概论基因工程第1页，讲稿共134张，创作于星期二基因片段的获得、验证和表达载体构建为体基因片段的获得、验证和表达载体构建为体外外DNADNA重组，一般认为是基因工程的重组，一般认为是基因工程的上游技术；上游技术；转化和转化体筛选主要是进行目的基因向目标转化和转化体筛选主要是进行目的基因向目标生物体内的转移、体内重组和重组体筛选鉴定，生物体内的转移、体内重组和重组体筛选鉴定，称为基因工程的称为基因工程的下游技术。下游技术。第2页，讲稿共134张，创作于星期二目的基因片段获得目的基因片段获得克隆载体克隆载体(空空)目的基因克隆载体目的基因克隆载体基因克隆验证基因克隆验证切出片段切出片段插入片段测序验证插入片段测序验证NY表达载体表达载体(空空)目的基因表达载体目的基因表达载体表达载体验证表达载体验证N表达载体构表达载体构建建Y基因片段获得基因片段获得第3页，讲稿共134张，创作于星期二Y导入工程菌或病毒导入工程菌或病毒直接转化直接转化介导生物验证介导生物验证YN生物介导转化生物介导转化转化转化目的基因DNA检测目的基因RNA检测目的Protein检测Protein 活性检测室内室内田间功能验证田间功能验证受体抗性筛选受体抗性筛选YNN筛选筛选第4页，讲稿共134张，创作于星期二一一、目的基因的获得、目的基因的获得1 1、目的基因、目的基因基因工程中用来改造生物个体或用于生产某种产物的有用基因。基因工程中用来改造生物个体或用于生产某种产物的有用基因。2 2、目的基因获得方法、目的基因获得方法（1）化化学学合合成成法法：按按照照预预先先设设计计的的DNADNA序序列列，通通过过化化学学反反应应合合成成目目的的基基因因片片段段的方法。的方法。合成方向：合成方向：3-53-5 合成长度：合成长度：10-500bp10-500bp 优点：目的性强，商业化程度高、自动化程度较高优点：目的性强，商业化程度高、自动化程度较高 缺点：合成长度有限，设备昂贵缺点：合成长度有限，设备昂贵第5页，讲稿共134张，创作于星期二乙腈亚磷酸胺化学合成法乙腈亚磷酸胺化学合成法Step1：对在担体上的第一个碱基进行脱保护（：对在担体上的第一个碱基进行脱保护（DMTr基）基）反应，用以准备附加下一个新的碱基。反应，用以准备附加下一个新的碱基。Step2：活化新的碱基，准备和前一个碱基进行反应。：活化新的碱基，准备和前一个碱基进行反应。Step3：第二个碱基附加反应到第一个碱基上。：第二个碱基附加反应到第一个碱基上。Step4：把第一个碱基没有和第二个碱基反应上的部分（反应：把第一个碱基没有和第二个碱基反应上的部分（反应失败部分）加帽封死（失败部分）加帽封死（Capping反应反应)，不让其进行进一步延伸反，不让其进行进一步延伸反应。应。Step5：对第二个碱基和第一个碱基的连接部分进行氧化反应，：对第二个碱基和第一个碱基的连接部分进行氧化反应，使使3价磷变成价磷变成5价磷，使合成产物变得更加稳定。如需进一步合成延价磷，使合成产物变得更加稳定。如需进一步合成延伸碱基时，再回到伸碱基时，再回到Step1进行合成。如此循环往复，可以不断合成进行合成。如此循环往复，可以不断合成DNA碱基，直至合成完所需序列碱基，直至合成完所需序列 Step6：从：从CPG担体上用氨水切离合成终了的担体上用氨水切离合成终了的Oligo DNA。第6页，讲稿共134张，创作于星期二第7页，讲稿共134张，创作于星期二（2 2）PCRPCR法法：参参照照已已知知基基因因序序列列，在在该该基基因因序序列列保保守守区区域域设设计计两两个个引引物物，用用PCRPCR反反应应获获得得两两个个引引物物之之间该基因间该基因DNADNA序列的方法。序列的方法。引物来源：已知基因序列引物来源：已知基因序列 片段获得：片段获得：PCRPCR 优点：操作容易、目的性强优点：操作容易、目的性强 缺点：不能克隆未知基因或序列同源性较差的基缺点：不能克隆未知基因或序列同源性较差的基因，含内含子因，含内含子 第8页，讲稿共134张，创作于星期二 (3)RT-PCR(3)RT-PCR法法：参参照照已已知知基基因因序序列列，在在该该基基因因序序列列保保守守区区域域设设计计两两个个引引物物，用用PCRPCR反反应应获获得得两两个个引引物物之之间间该该基基因编码序列因编码序列(mRNA)(mRNA)的方法。的方法。引物来源：已知基因序列引物来源：已知基因序列 片段获得：片段获得：RT-PCRRT-PCR 优点：操作容易、目的性强优点：操作容易、目的性强 缺点：不能克隆未知基因或序列同源性较差的基因缺点：不能克隆未知基因或序列同源性较差的基因第9页，讲稿共134张，创作于星期二（4 4）基因组文库法：将基因组）基因组文库法：将基因组DNADNA切割成片段后，直切割成片段后，直接克隆构建成基因组文库，从基因组文库中查找有用接克隆构建成基因组文库，从基因组文库中查找有用克隆的编码序列的方法。克隆的编码序列的方法。片段切割：识别序列为片段切割：识别序列为4 4碱基的限制性内切酶碱基的限制性内切酶 克隆载体：病毒、噬菌体、酵母人工染色体克隆载体：病毒、噬菌体、酵母人工染色体 优点：能够获得未知基因，能够对基因组所有基因进行研究优点：能够获得未知基因，能够对基因组所有基因进行研究 缺点缺点:序列含内含子序列含内含子,基因通用性较差基因通用性较差第10页，讲稿共134张，创作于星期二第11页，讲稿共134张，创作于星期二 （5）cDNAcDNA文文库库法法：以以生生物物体体内内mRNAmRNA合合成成cDNAcDNA后后直直接克隆构建成接克隆构建成cDNAcDNA文库，从中查找有用基因的方法。文库，从中查找有用基因的方法。片段来源：片段来源：mRNAmRNA逆转录逆转录 克隆载体：质粒载体克隆载体：质粒载体 优优点点：便便于于获获得得表表达达的的基基因因的的序序列列，获获得得得得序序列列为为编编码序列无内含子，费用较低码序列无内含子，费用较低 缺点：无法获得未表达或表达水平较低基因缺点：无法获得未表达或表达水平较低基因 第12页，讲稿共134张，创作于星期二第13页，讲稿共134张，创作于星期二（六）T-DNA标签法（七）mRNA差异显示法（八）反向克隆法第14页，讲稿共134张，创作于星期二二、目的基因的克隆二、目的基因的克隆在获得了目的基因片段后，为了便在获得了目的基因片段后，为了便于下一步操作，常需将该片段克隆到克隆于下一步操作，常需将该片段克隆到克隆载体上，进行大量复制，并验证该片段序载体上，进行大量复制，并验证该片段序列是否正确。列是否正确。第15页，讲稿共134张，创作于星期二(一一)克隆定义：克隆定义：1 1克克隆隆(名名词词)：通通过过无无性性繁繁殖殖形形成成的的与与其其亲亲本一致的生物群体。本一致的生物群体。2 2克隆克隆(动词动词)：生物的无性繁殖。：生物的无性繁殖。3.3.基因克隆：将目的基因片段连接到克隆载体基因克隆：将目的基因片段连接到克隆载体上并进行大量复制的过程。上并进行大量复制的过程。第16页，讲稿共134张，创作于星期二(二二)基因克隆步骤基因克隆步骤1 1、目的基因片段的获得：、目的基因片段的获得：PCRPCR、酶切获得、酶切获得2 2、目的基因片段的分离纯化：、目的基因片段的分离纯化：电泳：分离电泳：分离 回收：从胶内提取、纯化并定量。回收：从胶内提取、纯化并定量。3 3、目的基因片段与克隆载体连接：、目的基因片段与克隆载体连接：平末端连接：平末端酶酶切获得的或粘末端经补平后的片段的连接。平末端连接：平末端酶酶切获得的或粘末端经补平后的片段的连接。粘末端连接：粘末端酶酶切后获得的片段的连接。粘末端连接：粘末端酶酶切后获得的片段的连接。T/AT/A克隆：经常规克隆：经常规PCRPCR反应获得的片段的连接。反应获得的片段的连接。4 4、目的基因片段重组克隆载体筛选验证、目的基因片段重组克隆载体筛选验证5 5、目的基因片段复制第17页，讲稿共134张，创作于星期二(三三)基因基因重组克隆重组克隆筛选筛选 将将已已经经连连接接外外源源基基因因的的载载体体(DNA)(DNA)向向受受体体生生物物细细胞胞中中导导入入，从从大大量量的的受受体体中中筛筛选选出出成成功功导导入入目目的的基基因因克隆载体的个体，称克隆载体的个体，称为重组克隆筛选为重组克隆筛选。一一般般克克隆隆载载体体的的受受体体生生物物为为大大肠肠杆杆菌菌。常常用用的的筛筛选方法有两种：选方法有两种：1 1、抗生素抗性筛选、抗生素抗性筛选 2 2、菌落蓝、白斑筛选、菌落蓝、白斑筛选 第18页，讲稿共134张，创作于星期二pUC19第19页，讲稿共134张，创作于星期二筛选结果模式图第20页，讲稿共134张，创作于星期二第21页，讲稿共134张，创作于星期二(四四)载载体上体上插入基因片段的验证插入基因片段的验证1 1、DNADNA酶切法酶切法 第22页，讲稿共134张，创作于星期二2 2、PCRPCR法法第23页，讲稿共134张，创作于星期二3 3、DNADNA测序法测序法 模板模板+dNTP+测序引物测序引物+测序测序Taq酶酶ddATPddTTPddGTPddCTP第24页，讲稿共134张，创作于星期二三、目的基因的表达载体构建三、目的基因的表达载体构建 目的基因片段经验证正确后，需构建适合于受体生目的基因片段经验证正确后，需构建适合于受体生物的基因表达载体。物的基因表达载体。表达载体的构建过程就是把目的基因的阅读框架表达载体的构建过程就是把目的基因的阅读框架(编编码序列码序列)插入适宜的表达载体插入适宜的表达载体(空空)的启动子、终止子中间，的启动子、终止子中间，形成表达框架。形成表达框架。表达框架：表达框架：启动子启动子-目的基因的目的基因的ORF-终止子终止子第25页，讲稿共134张，创作于星期二 1 1、表达载体的作用：表达载体的作用：使该基因能够被导入使该基因能够被导入新的生物体、进行自主或整合复制并在生物体新的生物体、进行自主或整合复制并在生物体中启动和表达。中启动和表达。一般情况下有三个串联的表达框架：一般情况下有三个串联的表达框架：-1-2-3-1、启动子、启动子-抗性基因的抗性基因的ORF-终止子终止子 2、启动子启动子-目的基因的目的基因的ORF-终止子终止子 3、启动子、启动子-报告基因的报告基因的ORF-终止子终止子第26页，讲稿共134张，创作于星期二抗性基因：抗性基因：Npt II：新霉素磷酸转移酶基因，抗卡那霉素新霉素磷酸转移酶基因，抗卡那霉素 Hyg:潮霉素磷酸转移酶基因潮霉素磷酸转移酶基因,抗潮霉素抗潮霉素 gentR:庆大霉素抗性庆大霉素抗性 基因基因，抗庆大霉素抗庆大霉素 AmpAmpR:氨苄青霉素抗性基因，抗青霉素类氨苄青霉素抗性基因，抗青霉素类 TETR:四环素抗性基因四环素抗性基因,抗四环素抗四环素报告基因：报告基因：Gus:催化溴取代葡萄糖转化无色催化溴取代葡萄糖转化无色-蓝色反应蓝色反应 Gfp:绿色荧光蛋白，合成绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白，合成绿色荧光蛋白 Lac（z）:催化溴取代半乳糖无色催化溴取代半乳糖无色-蓝色转化反应蓝色转化反应常用选择标记常用选择标记(编码基因编码基因):第27页，讲稿共134张，创作于星期二2 2、生物表达系统的特异性、生物表达系统的特异性 不不同同生生物物中中，启启动动基基因因的的表表达达需需要要不不同同的的启启动动子子，在在原原核核生生物物中中，需需要要原原核核生生物物启启动动子子和和终终止止子子；在在植植物物中，需要适合植物的启动子和终止子。中，需要适合植物的启动子和终止子。在在原原核核生生物物中中，经经常常使使用用的的启启动动子子有有：T3T3、T7T7和和SP6SP6启动子。启动子。在植物中，经常使用的启动子有：在植物中，经常使用的启动子有：CaMV 35SCaMV 35S启动启动子，胭脂碱合成酶基因终止子。子，胭脂碱合成酶基因终止子。第28页，讲稿共134张，创作于星期二3 3、植物表达载体系统、植物表达载体系统目前常用的植物表达载体系统有：目前常用的植物表达载体系统有：1、质粒载体系统：、质粒载体系统：2、病毒载体系统：、病毒载体系统：第29页，讲稿共134张，创作于星期二根癌农杆菌及其质粒第30页，讲稿共134张，创作于星期二Ti质粒Vir:毒区，切割、转运、侵染区毒区，切割、转运、侵染区 T-DNA区：被转移整合到植物的区：被转移整合到植物的DNA区域区域LB:左边界左边界 RB：右边界：右边界第31页，讲稿共134张，创作于星期二 把目的基因表达框架整合到改造后的把目的基因表达框架整合到改造后的Ti质粒质粒(卸卸甲质粒甲质粒)的的T-DNAT-DNA区域形成的质粒载体。区域形成的质粒载体。所有基因转移、基因表达元件位于同一质粒上，所有基因转移、基因表达元件位于同一质粒上，称为一元表达载体。但这类载体构建困难，目的基称为一元表达载体。但这类载体构建困难，目的基因整合概率较低。因整合概率较低。改造改造TiTi质粒：取代致瘤和不必要的基因。质粒：取代致瘤和不必要的基因。1 1）一元载体系统（整合载体系统）一元载体系统（整合载体系统）第32页，讲稿共134张，创作于星期二Ti质粒Vir:区区:环化成辅助质粒环化成辅助质粒T-DNA区：环化成微型区：环化成微型Ti-质粒质粒第33页，讲稿共134张，创作于星期二 它它由由微微型型Ti质质粒粒（mini-Ti plasmid）和和辅辅助助Ti质质粒粒（helper Ti plasmid）两个独立的质）两个独立的质粒粒构成。构成。辅助质粒：辅助质粒：提供提供Vir基因的转移、切割、拼接功能基因的转移、切割、拼接功能 微微型型Ti质质粒粒：含含有有T-DNA边边界界、为为一一个个广广谱谱质质粒粒，提提供供用用于于转转移移的基因表达框架。的基因表达框架。2 2）双元载体系统）双元载体系统binary vectorbinary vector第34页，讲稿共134张，创作于星期二第35页，讲稿共134张，创作于星期二(三三)构建过程构建过程1 1片段获得：酶切法片段获得：酶切法2 2表达载体线性化：酶切法表达载体线性化：酶切法3 3、片段分离纯化：电泳、条带回收、片段分离纯化：电泳、条带回收4 4连接：基因片段和载体连接：基因片段和载体DNADNA定向连定向连接。接。第36页，讲稿共134张，创作于星期二第37页，讲稿共134张，创作于星期二(四四)表达载体验证表达载体验证标记基因筛选标记基因筛选 酶切鉴定法酶切鉴定法 PCRPCR鉴定法鉴定法DNADNA杂交：斑点杂交、菌落原位杂交杂交：斑点杂交、菌落原位杂交。(五五)工程菌构建工程菌构建 表达载体：直接转化。表达载体：直接转化。工程菌构建：生物介导转化。把表达载体转入介导生物中。工程菌构建：生物介导转化。把表达载体转入介导生物中。第38页，讲稿共134张，创作于星期二一、基因转移一、基因转移 把外源把外源DNADNA导入生物体，使生物体发生某种导入生物体，使生物体发生某种变化的过程称为转化变化的过程称为转化(Transformation)(Transformation)。把把一一种种生生物物的的基基因因导导入入到到另另外外一一个个生生物物体体内内的过程称为基因转移的过程称为基因转移(gene transfer)(gene transfer)。第四节第四节 基因工程下游技术基因工程下游技术第39页，讲稿共134张，创作于星期二（一）植物受体系统（一）植物受体系统受受体体:用用于于接接收收外外源源基基因因片片段段的的生生物个体、细胞或者组织。物个体、细胞或者组织。1 1、植物组织：、植物组织：2 2、原生、原生质质体：体：3 3、生殖、生殖细细胞：胞：第40页，讲稿共134张，创作于星期二1 1、植物组织：、植物组织：受伤的细胞容易受到病毒或质粒的感染。这些病受伤的细胞容易受到病毒或质粒的感染。这些病毒或质粒上的某些毒或质粒上的某些DNADNA通过各种不同的方式转移到受伤通过各种不同的方式转移到受伤的植物细胞，并形成愈伤组织。愈伤组织可以培养成的植物细胞，并形成愈伤组织。愈伤组织可以培养成完整的转化植株。完整的转化植株。该受体系统转化率高，可获得较多的转化植株，该受体系统转化率高，可获得较多的转化植株，取材广泛、适用性广。但再生植株无性系变异较大，转取材广泛、适用性广。但再生植株无性系变异较大，转化的外源基因稳定性差，嵌合体多。化的外源基因稳定性差，嵌合体多。第41页，讲稿共134张，创作于星期二2 2、原生质体：、原生质体：原原生生质质体体是是植植物物细细胞胞除除去去细细胞胞壁壁后后的的部部分分，是是一一个个质膜包围的质膜包围的“裸露细胞裸露细胞”。原原生生质质体体在在合合适适的的条条件件下下具具有有分分化化、繁繁殖殖并并再再生生成成完完整植株的能力，具有全能性。整植株的能力，具有全能性。原原生生质质体体比比较较容容易易完完成成一一系系列列细细胞胞操操作作或或遗遗传传操操作，而且还可以直接高效的捕获外源基因。作，而且还可以直接高效的捕获外源基因。嵌嵌合合体体少少，遗遗传传稳稳定定性性更更差差，培培养养周周期期长长，难难度度大大，再再生频率低。生频率低。第42页，讲稿共134张，创作于星期二3 3、生殖细胞：、生殖细胞：是以植物生殖细胞如：花粉细胞、卵细胞为受体是以植物生殖细胞如：花粉细胞、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统。细胞进行基因转化的系统。目前主要以两个途径利用生殖细胞进行基因目前主要以两个途径利用生殖细胞进行基因转化：一是利用花粉细胞和卵细胞培养，从而建转化：一是利用花粉细胞和卵细胞培养，从而建立单倍体的基因转化系统；二是直接利用花粉和立单倍体的基因转化系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化卵细胞受精过程进行基因转化 第43页，讲稿共134张，创作于星期二优点优点:一旦将外源基因一旦将外源基因导导入入这这些些细细胞，胞，可以遗传，可以遗传，利用植物自身的受粉利用植物自身的受粉过过程，具有操作方法方便、程，具有操作方法方便、简单简单。缺点缺点:不足受到季不足受到季节节的限制；只能花期的限制；只能花期进进行，且行，且无性繁殖的植物不能采用。无性繁殖的植物不能采用。第44页，讲稿共134张，创作于星期二（二）直接转化法（二）直接转化法直接将纯化的携带有外源基因的直接将纯化的携带有外源基因的DNADNA导入生物体的方法。根据导入生物体的方法。根据所采用的原理，可以分为：所采用的原理，可以分为：物理转化法、物理转化法、化学转化法、化学转化法、种质介导转化法。种质介导转化法。第45页，讲稿共134张，创作于星期二1.1.物理转化法：物理转化法：通通过过物物理理方方法法打打开开细细胞胞屏屏障障(细细胞胞壁壁和和细细胞胞膜膜)，将将外外源基因直接导入生物体的方法。源基因直接导入生物体的方法。(1)(1)电激法电激法(电穿孔法电穿孔法)：(2)(2)超声法超声法(超声穿孔法超声穿孔法)：(3)(3)热热激法：激法：(4)(4)显显微注射法：微注射法：(5)(5)激光法激光法(激光穿孔法激光穿孔法)(6)(6)基因基因枪枪法法(微微弹弹法法)第46页，讲稿共134张，创作于星期二(1)(1)电激法电激法(电穿孔法电穿孔法)：细胞膜在适当的外加电压作用下，细胞膜被击穿，细胞膜在适当的外加电压作用下，细胞膜被击穿，细胞周围的溶液中的外源细胞周围的溶液中的外源DNA分子会通过这些孔分子会通过这些孔洞进入细胞中。移去外加电压后，膜孔在一定洞进入细胞中。移去外加电压后，膜孔在一定时间内可以自动修复，外源基因进入细胞内后时间内可以自动修复，外源基因进入细胞内后少数可能会整合到染色体上。少数可能会整合到染色体上。第47页，讲稿共134张，创作于星期二 利用这一原理，将原生质体与外源基因混利用这一原理，将原生质体与外源基因混合置于电激仪的样品小室中，然后在一定的电合置于电激仪的样品小室中，然后在一定的电压下进行短时间直流电脉冲，电击后的原生质压下进行短时间直流电脉冲，电击后的原生质体被转移至培养基中培养，根据选择标记筛选体被转移至培养基中培养，根据选择标记筛选带有标记基因的转化子。带有标记基因的转化子。超声穿孔法超声穿孔法、热热激法激法、显显微注射法微注射法、激光法激光法原理原理与此相同与此相同第48页，讲稿共134张，创作于星期二物理转化法步骤：1、目的基因表达载体DNA溶液配制2、受体细胞准备(原生质体制备)3、物理法导致细胞穿孔4、细胞恢复培养和筛选第49页，讲稿共134张，创作于星期二第50页，讲稿共134张，创作于星期二基因枪法(微弹法)第51页，讲稿共134张，创作于星期二第52页，讲稿共134张，创作于星期二2.2.化学转化法化学转化法(1)(1)聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)法法 PEGPEG与与多多聚聚赖赖氨氨酸酸、多多聚聚鸟鸟氨氨酸酸等等多多聚聚物物和和二二价价阳阳离离子子（如如MgMg2+2+、CaCa2+2+、MnMn2+2+）及及DNADNA常常在在原原生生质质体体表表面面形形成成沉沉淀淀颗颗粒粒，通通过过原原生生质质体体的的内内吸吸作作用而被吸收。用而被吸收。利利用用PEGPEG诱诱导导原原生生质质体体融融合合时时要要求求原原生生质质体体具具有较高的活力。有较高的活力。第53页，讲稿共134张，创作于星期二(2)(2)脂质体法脂质体法 带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与细胞形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合；另一种解释膜上的唾液酸残基的负电核结合；另一种解释是通过内吞作用而进入细胞。是通过内吞作用而进入细胞。第54页，讲稿共134张，创作于星期二3.种质介导转化法种质介导转化法(1)花粉管通道法花粉管通道法 是是我我国国科科学学家家周周光光宇宇等等首首次次提提出出外外源源DNA导导入植物的转基因技术。入植物的转基因技术。其其基基本本原原理理是是授授粉粉后后使使外外源源DNA能能沿沿着着花花粉粉管管渗渗入入，经经过过珠珠心心通通道道进进入入胚胚囊囊，转转化化还还不不具具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞 第55页，讲稿共134张，创作于星期二(2)生殖细胞浸泡法生殖细胞浸泡法 生生殖殖细细胞胞(种种子子、胚胚、胚胚珠珠、子子房房、花花粉粉粒粒、花花药药悬悬浮浮细细胞胞培培养养物物等等)直直接接浸浸泡泡在在外外源源DNA溶溶液液中中，利利用用渗渗透作用把外源基因导入受体并整合和遗传的方法。透作用把外源基因导入受体并整合和遗传的方法。(3)胚囊、子房注射法胚囊、子房注射法 使用显微注射仪把外源基因溶液注射到子房或胚囊中，使用显微注射仪把外源基因溶液注射到子房或胚囊中，由于子房或胚囊中产生的压力和卵细胞的吸收使外源由于子房或胚囊中产生的压力和卵细胞的吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中，从而获得转基因植株。进入受精的卵细胞中，从而获得转基因植株。第56页，讲稿共134张，创作于星期二（三）间接转化法（三）间接转化法(生物转化法生物转化法)1.农杆菌介导法农杆菌介导法 有两种农杆菌有两种农杆菌:根癌农杆菌（根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）发根农杆菌发根农杆菌(A.Rhizogenes)被广泛用于植物转基因。被广泛用于植物转基因。原原理理：农农杆杆菌菌在在适适宜宜条条件件下下(酸酸性性,酚酚类类诱诱导导物物如如乙乙酰酰丁丁香香酮酮)，将其质粒将其质粒T-DNA部分可以转入植物细胞并插入到植物基因组中。部分可以转入植物细胞并插入到植物基因组中。第57页，讲稿共134张，创作于星期二2.病毒介导法病毒介导法 病病毒毒通通过过膜膜糖糖蛋蛋白白和和宿宿主主细细胞胞表表面面的的受受体体相相互互作作用用或或细细胞胞内内吞吞进进入入宿宿主主细细胞胞，经经反反转转录录合合成成DNA并并随随机机整整合合到到宿宿主主基基因因组中。可介导转基因的病毒组中。可介导转基因的病毒:(1)(1)双链双链DNADNA病毒病毒 CaMVCaMV花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒 DaMVDaMV大丽花花叶病毒大丽花花叶病毒 CEKVCEKV石竹饰刻斑纹病毒石竹饰刻斑纹病毒 (2)(2)单链单链DNADNA病毒病毒 (3)(3)单链单链RNARNA病毒病毒 第58页，讲稿共134张，创作于星期二症状第59页，讲稿共134张，创作于星期二（四）农杆菌介导转化法（四）农杆菌介导转化法A、整体植株接种共感染法整体植株接种共感染法1 1、原理与方法：、原理与方法：该该途途径径是是模模仿仿自自然然界界农农杆杆菌菌天天然然的的转转化化过过程程，人人为为的的在在植植株株上上造造成成创创伤伤部部位位，然然后后把把携携带带目目的的基基因因表表达达载载体体的的农农杆杆菌菌接接种种在在创创伤伤面面上上或或植植株株体体内内，使使农农杆杆菌菌在在植植株株内内进进行行侵侵染染转转化化，获获得得转转化化的的植植物物细细胞胞，因因此此也也称为体内转化。称为体内转化。2 2、受体材料：、受体材料：无菌苗、种子实生苗无菌苗、种子实生苗3 3、优点：试验周期短、具有较高的转化效率、优点：试验周期短、具有较高的转化效率、4 4、缺点：嵌合体多、筛选困难、缺点：嵌合体多、筛选困难第60页，讲稿共134张，创作于星期二B、叶盘转化法叶盘转化法 1 1、原理和方法：、原理和方法：为为了了诱诱导导农农杆杆菌菌的的侵侵染染活活性性，把把无无菌菌苗苗叶叶片片剪剪切切成成圆圆形形或或方方形形叶叶盘盘，人人为为地地造造成成较较大大的的伤伤口口/面面积积比比，叶叶盘盘浸浸蘸蘸接接种种农农杆杆菌菌后后，与与农农杆杆菌菌共共培培养养一一段段时时间间后后，目目的的基基因因可可经经农农杆杆菌菌整整合合到到植植物物染染色色体体上上，经经转转接到脱菌培养基上除去农杆菌，经筛选后可得转化植株。接到脱菌培养基上除去农杆菌，经筛选后可得转化植株。2 2、受体材料：、受体材料：无菌苗叶片。无菌苗叶片。3 3、优点：、优点：适用性广、重复性好适用性广、重复性好 缺点：部分材料叶盘再生困难。缺点：部分材料叶盘再生困难。第61页，讲稿共134张，创作于星期二C、原生质体共培养转化法原生质体共培养转化法1 1、原理同上、原理同上2、受体材料原生质体3、优点：易转化、无嵌合体4、缺点：再生困难第62页，讲稿共134张，创作于星期二常用植物基因转化方法特点比较评价条件评价条件农杆菌农杆菌PEGPEG法法电击法电击法注射法注射法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法受体材料受体材料组组织织、原原 生生 质质体体原原生生质质体体原原 生生 质质体体原原生生质质体体组组织织、细细胞胞卵细胞卵细胞寄主范围寄主范围有有无无无无无无无无有性繁殖材料有性繁殖材料组培条件组培条件简单简单复杂复杂复杂复杂复杂复杂简单简单不需要不需要转化率转化率1-10%1-10%1010-5-4-5-41010-5-4-5-41010-3-2-3-21010-3-2-3-210%1010%10嵌合体比例嵌合体比例有有无无无无无无多多无无操作复杂性操作复杂性简单简单简单简单复杂复杂复杂复杂复杂复杂简单简单设备要求设备要求简单简单简单简单昂贵昂贵昂贵昂贵昂贵昂贵简单简单工作效率工作效率高高低低低低低低高高低低单子叶植物单子叶植物少少可行可行可行可行可行可行广泛广泛广泛广泛第63页，讲稿共134张，创作于星期二大麦转化示意图第64页，讲稿共134张，创作于星期二二二、转移植株筛选、转移植株筛选1、抗性筛选、抗性筛选2、报告基因筛选、报告基因筛选3、DNA检测检测4、RNA检测检测5、蛋白质检测、蛋白质检测6、功能检测、功能检测第65页，讲稿共134张，创作于星期二第五节第五节 植物转基因改良的应用植物转基因改良的应用一、抗虫改良一、抗虫改良1、常用常用抗虫基因抗虫基因可分可分为为三三类类:(1)细细菌菌中中分分离离的的抗抗虫虫基基因因,主主要要是是苏苏云云金金杆杆菌菌杀杀虫虫结结晶晶蛋蛋白白(Bt)基基因因;(2)植植物物中中分分离离的的抗抗虫虫基基因因,主主要要为为蛋蛋白白酶酶抑抑制制剂剂基基因因、淀淀粉粉酶酶抑抑制制剂剂基基因因、外外源源凝凝集集素素基基因因(Lec)等等,应应用用最最广广泛泛的的是是豇豇豆豆胰胰蛋蛋白白酶酶抑抑制制剂剂基因基因(CpTI);(3)从昆虫从昆虫中中分离的分离的抗虫抗虫基因基因,主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等。主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等。第66页，讲稿共134张，创作于星期二2 2、杀虫原理、杀虫原理(1)BT(1)BT基因基因 BtBt基因又称杀虫结晶蛋白基因又称杀虫结晶蛋白(insecticidal crystal protein.(insecticidal crystal protein.ICP)ICP)基因基因,来自于苏云金芽孢杆菌来自于苏云金芽孢杆菌,其杀虫毒性来自芽孢形成过程其杀虫毒性来自芽孢形成过程中产生的杀虫晶体蛋白中产生的杀虫晶体蛋白(或或内毒素内毒素)。原理原理:破坏昆虫的消化系统破坏昆虫的消化系统.这种蛋白通常以原毒素形式存在这种蛋白通常以原毒素形式存在,当当昆虫取食后昆虫取食后,原毒素在消化道内被活化，破坏肠道细胞膜上的特原毒素在消化道内被活化，破坏肠道细胞膜上的特异性结合蛋白异性结合蛋白,使细胞膜产生一些孔道。使细胞膜产生一些孔道。第67页，讲稿共134张，创作于星期二 目前常见的目前常见的btbt基因分为基因分为7 7类，共类，共3030多个小类，多个小类，分别可以抗鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目害虫分别可以抗鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目害虫以及线虫，有些种类具有多种昆虫抗性。以及线虫，有些种类具有多种昆虫抗性。第68页，讲稿共134张，创作于星期二抗虫棉基因的转化过程第69页，讲稿共134张，创作于星期二70由中国农科院生物工程中心开发的Bt棉对棉铃虫有显著的抗性。与对照相比减少农药用量80，并减少用工150个/hm2，以上两者可使每公顷节省1500元，Bt转基因棉种深受棉农的欢迎。第70页，讲稿共134张，创作于星期二(2)胰蛋白胰蛋白酶酶抑制抑制剂剂基因基因 植物中存在三类蛋白酶抑制剂：植物中存在三类蛋白酶抑制剂：丝氨酸蛋白酶抑制剂丝氨酸蛋白酶抑制剂 巯基蛋白酶抑制剂巯基蛋白酶抑制剂 金属蛋白酶抑制剂。金属蛋白酶抑制剂。其中丝氨酸蛋白酶抑制剂中的豇豆胰蛋白酶抑制剂其中丝氨酸蛋白酶抑制剂中的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因基因(CpTI)是目前研究得较为深入且应用最为广泛的基是目前研究得较为深入且应用最为广泛的基因。因。第71页，讲稿共134张，创作于星期二蛋白酶抑制剂杀虫机理蛋白酶抑制剂杀虫机理:蛋白酶抑制剂与昆虫消化道的蛋白酶相结合蛋白酶抑制剂与昆虫消化道的蛋白酶相结合,形成酶形成酶-抑制剂复合物抑制剂复合物,使酶活性中心失活使酶活性中心失活,从而阻断或减弱酶的从而阻断或减弱酶的水解作用水解作用,干扰昆虫对外来蛋白的正常消化干扰昆虫对外来蛋白的正常消化,最终造成昆虫最终造成昆虫非正常发育或死亡。非正常发育或死亡。第72页，讲稿共134张，创作于星期二(3)植物凝集素基因植物凝集素基因(Lec)植植物物凝凝集集素素是是植植物物体体普普遍遍存存在在的的一一类类保保守守性性很很强强的的非非免免疫疫性性蛋蛋白白,能能特特异异性性识识别别并并可可逆逆地地结结合合糖糖蛋蛋白白的的糖糖基基部分。部分。麦胚凝集素麦胚凝集素(WGA),对对欧洲玉米螟有良好的抗性。欧洲玉米螟有良好的抗性。雪雪莲莲花凝集素花凝集素(GNA)对对蚜虫、叶蝉、稻蚜虫、叶蝉、稻飞飞虱等同翅目吸虱等同翅目吸食性害虫有极食性害虫有极强强的毒性。的毒性。豌豆外凝集素豌豆外凝集素(p-Lec)能抑制豇豆象的生长。能抑制豇豆象的生长。第73页，讲稿共134张，创作于星期二 作用机理作用机理:当昆虫取食外凝集素后当昆虫取食外凝集素后,外源凝集素在昆虫消化道周外源凝集素在昆虫消化道周围的细胞膜糖蛋白专一性结合围的细胞膜糖蛋白专一性结合,从而影响所有营养的吸收从而影响所有营养的吸收,达到抗虫目的。达到抗虫目的。第74页，讲稿共134张，创作于星期二(4)(4)淀粉酶抑制剂淀粉酶抑制剂 淀粉酶抑制剂能抑制昆虫消化道内淀粉酶抑制剂能抑制昆虫消化道内-淀粉酶活淀粉酶活性性,使食入的淀粉无法水解使食入的淀粉无法水解,阻断了昆虫主要能量来源；阻断了昆虫主要能量来源；它与淀粉酶形成的酶它与淀粉酶形成的酶-抑制剂复合物通过生理反馈调抑制剂复合物通过生理反馈调节作用节作用,刺激昆虫分泌过量的消化酶刺激昆虫分泌过量的消化酶,产生厌食反应。产生厌食反应。第75页，讲稿共134张，创作于星期二(5)(5)昆虫毒素基因昆虫毒素基因 昆虫神经毒素控制着昆虫许多关键的生理过程昆虫神经毒素控制着昆虫许多关键的生理过程,影影响昆虫的生长、变态、生殖、代谢和行为等响昆虫的生长、变态、生殖、代谢和行为等,近年来近年来,人们人们已开始在基因工程中利用昆虫神经毒素防治害虫。已开始在基因工程中利用昆虫神经毒素防治害虫。目前目前,蝎毒素和蜘蛛毒素两种昆虫特异性神经毒素蝎毒素和蜘蛛毒素两种昆虫特异性神经毒素已被用于植物抗虫基因工程。已被用于植物抗虫基因工程。第76页，讲稿共134张，创作于星期二 由于每一种抗虫基因都有其局限性由于每一种抗虫基因都有其局限性,近年来正近年来正在研究或已应用于抗虫基因工程的基因还有胆固在研究或已应用于抗虫基因工程的基因还有胆固醇氧化酶基因、营养杀虫蛋白基因、几丁质酶基醇氧化酶基因、营养杀虫蛋白基因、几丁质酶基因、核糖体失活蛋白基因和异戊烯转移酶基因等。因、核糖体失活蛋白基因和异戊烯转移酶基因等。第77页，讲稿共134张，创作于星期二(二二)抗真菌病改良抗真菌病改良1、抗真菌病基因、抗真菌病基因根据植物的防卫机制和病原菌致病机理，已知的植物抗真根据植物的防卫机制和病原菌致病机理，已知的植物抗真菌病基因主要有以下两个方面：菌病基因主要有以下两个方面：一是细胞壁结构增强基因，一是细胞壁结构增强基因，二是生成抗菌物质或激活抗菌物质活性的基因二是生成抗菌物质或激活抗菌物质活性的基因 第一类基因目前应用较少，第二类基因已经开始大量应第一类基因目前应用较少，第二类基因已经开始大量应用。用。第78页，讲稿共134张，创作于星期二2 2、主要抗真菌病基因及作用机理、主要抗真菌病基因及作用机理(1)(1)几丁质酶基因几丁质酶基因 植植物物和和微微生生物物中中几几丁丁质质酶酶基基因因编编码码的的降降解解几几丁丁质质酶酶。几几丁丁质质是是植植物物病病原原真真菌菌的的细细胞胞壁壁主主要要成成分分之之一一，几几丁丁质质的的降降解解可可以以导导致致病病原原细细胞胞死死亡亡，也也可可以以诱诱导导植植物物产产生生抗抗病病反反应。应。(2)-1(2)-1，3-3-葡聚糖酶基因葡聚糖酶基因 -1-1，3-3-葡聚糖是植物病原真菌的细胞壁主要成分之一，葡聚糖是植物病原真菌的细胞壁主要成分之一，的降解可以导致病原细胞死亡，也可以诱导植物产生抗病反的降解可以导致病原细胞死亡，也可以诱导植物产生抗病反应。应。第79页，讲稿共134张，创作于星期二(3)(3)植物抗毒素基因植物抗毒素基因 植物产生的对病原真菌具有毒性的物质，称为植物抗植物产生的对病原真菌具有毒性的物质，称为植物抗毒素，编码此类物质合成酶的基因称为植物抗毒素基因。毒素，编码此类物质合成酶的基因称为植物抗毒素基因。目前已从不同科属植物中鉴定了目前已从不同科属植物中鉴定了200200多种，其中以类多种，其中以类黄酮和萜烯类最多。其中的关键酶如苯丙氨酸裂解酶基黄酮和萜烯类最多。其中的关键酶如苯丙氨酸裂解酶基因因(PAL)(PAL)已经克隆。其中芪合成酶基因已从葡萄、花生等植已经克隆。其中芪合成酶基因已从葡萄、花生等植物中克隆并转入烟草中获得了抗病性植株。物中克隆并转入烟草中获得了抗病性植株。第80页，讲稿共134张，创作于星期二(4)核核糖