血红蛋白的提取和分离 (3)精选PPT.ppt

关于血红蛋白的提取和分离(3)第1页，讲稿共40张，创作于星期三2第2页，讲稿共40张，创作于星期三31 1、分离生物大分子的基本思路、分离生物大分子的基本思路选用选用一定的物理或化学一定的物理或化学的方法分离具有的方法分离具有不同物理或不同物理或化学性质化学性质的生物大分子的生物大分子2 2、蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理根据蛋白质各种特性的差异，如根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同等等，可以用来分离不同蛋白质蛋白质相关链接相关链接第3页，讲稿共40张，创作于星期三43 3、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种特性，、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种特性，作用结果是什么被破坏？作用结果是什么被破坏？变性、变性，空间结构变性、变性，空间结构4 4、人们用鸡的红细胞提取、人们用鸡的红细胞提取DNADNA，用人的红细胞，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNA，便于进行，便于进行DNADNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富（红色）便于提取血红蛋白红蛋白含量丰富（红色）便于提取血红蛋白第4页，讲稿共40张，创作于星期三5一一.基础知识基础知识 （一）（一）（一）（一）凝胶色谱法：凝胶色谱法：（也叫分配色谱法）（也叫分配色谱法）根据被分离物质的根据被分离物质的根据被分离物质的根据被分离物质的相对分子质量的大小，相对分子质量的大小，相对分子质量的大小，相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的利用具有网状结构的凝胶的利用具有网状结构的凝胶的利用具有网状结构的凝胶的分分分分子筛作用子筛作用子筛作用子筛作用来分离来分离来分离来分离蛋白质的有效方法蛋白质的有效方法蛋白质的有效方法蛋白质的有效方法.1 1、概念：、概念：、概念：、概念：2 2 2 2、凝胶色谱法的原理、凝胶色谱法的原理、凝胶色谱法的原理、凝胶色谱法的原理分子筛效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。内部有许多贯穿的通道。内部有许多贯穿的通道。内部有许多贯穿的通道。当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小的蛋白质容易进入凝当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小的蛋白质容易进入凝当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小的蛋白质容易进入凝当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较。胶内部的通道，路程较长，移动速度较。胶内部的通道，路程较长，移动速度较。胶内部的通道，路程较长，移动速度较。分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。3 3 3 3、依据的特性：、依据的特性：、依据的特性：、依据的特性：相对分子质量的大小相对分子质量的大小相对分子质量的大小相对分子质量的大小4 4、具体过程具体过程具体过程具体过程第5页，讲稿共40张，创作于星期三6洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。促使蛋白质分子的差速流动。混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 第6页，讲稿共40张，创作于星期三7（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PHPHPHPH值的影响，维持值的影响，维持值的影响，维持值的影响，维持PHPHPHPH基本不变基本不变基本不变基本不变1 1 1 1、作用、作用、作用、作用2 2 2 2、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制通常由通常由通常由通常由1 1 1 12 2 2 2种缓冲剂种缓冲剂种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例使用比例使用比例就可以就可以就可以就可以制得在不同制得在不同制得在不同制得在不同PHPHPHPH范围内使用的缓冲液范围内使用的缓冲液范围内使用的缓冲液范围内使用的缓冲液阅读阅读阅读阅读：在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么：在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么：在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么：在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PHPHPHPH环境，保证环境，保证环境，保证环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察血红蛋白的正常结构和功能，便于观察血红蛋白的正常结构和功能，便于观察血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色红色红色红色)和科学研究和科学研究和科学研究和科学研究(活性活性活性活性)第7页，讲稿共40张，创作于星期三8（三）电泳：（三）电泳：1 1 1 1、概念：、概念：、概念：、概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程带电粒子在电场作用下发生迁移的过程带电粒子在电场作用下发生迁移的过程带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2 2 2 2、原理、原理、原理、原理:许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的的的的PHPHPHPH下，这些基团会带上正电或负电下，这些基团会带上正电或负电下，这些基团会带上正电或负电下，这些基团会带上正电或负电在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动移动移动移动电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离品中各种分子的分离品中各种分子的分离品中各种分子的分离3 3 3 3、常见方法、常见方法、常见方法、常见方法:琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳4 4 4 4、实例、实例、实例、实例应用应用应用应用十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDSSDSSDSSDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量量量量第8页，讲稿共40张，创作于星期三9蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净净电荷的多少电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素等因素等因素等因素原理原理原理原理 SDSSDS作用作用为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响净电荷对迁移率的影响净电荷对迁移率的影响净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入可以在凝胶中加入可以在凝胶中加入可以在凝胶中加入SDS SDS,SDS,SDS能与各种蛋白质形成复合物。能与各种蛋白质形成复合物。SDS所带负电荷的所带负电荷的所带负电荷的所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小分子的大小分子的大小分子的大小第9页，讲稿共40张，创作于星期三10二、实验操作二、实验操作样品处理样品处理粗分离粗分离粗分离粗分离纯化纯化纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定1 1、样品处理：、样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤:(:(四步）四步）血液组成血液组成（二）操作过程（二）操作过程成分成分血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖葡萄糖血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白（9090）两个两个a a肽链肽链两个两个 一肽链一肽链四个亚铁红四个亚铁红素基团素基团第10页，讲稿共40张，创作于星期三11每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子一分子氧或一分子二氧化碳，氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而呈红色而呈红色组成及作用组成及作用组成及作用组成及作用本课题可选用猪、牛、羊或其他本课题可选用猪、牛、羊或其他哺乳动物哺乳动物的血液来分离的血液来分离血红蛋白血红蛋白选材选材(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤洗涤红细胞目的洗涤红细胞目的除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少不可洗涤次数过少洗涤操作洗涤操作洗涤操作洗涤操作A A A A、采集血样、采集血样、采集血样、采集血样B B、低速短时间离心（为什么）低速短时间离心（为什么）低速短时间离心（为什么）低速短时间离心（为什么）速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果达不到分离的效果第11页，讲稿共40张，创作于星期三12C C C C、吸取血浆：上层透明的黄色血浆、吸取血浆：上层透明的黄色血浆DDDD、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.90.90.90.9的氯化钠溶的氯化钠溶的氯化钠溶的氯化钠溶液洗涤液洗涤液洗涤液洗涤E E E E、低速离心（低速短时间）、低速离心（低速短时间）F F、重复、重复、重复、重复4 4、5 5 5 5步骤三次，直至上步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明清液中已没有黄色，表明清液中已没有黄色，表明清液中已没有黄色，表明洗涤干净洗涤干净洗涤干净洗涤干净(2)(2)(2)(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放血红蛋白的释放血红蛋白的释放加蒸馏水（加蒸馏水（使红细胞大量吸水胀裂）使红细胞大量吸水胀裂）到到原血液体积，原血液体积，再加再加再加再加4040体积的体积的甲苯（甲苯（溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜），置于磁力搅拌器置于磁力搅拌器置于磁力搅拌器置于磁力搅拌器上充分搅拌上充分搅拌上充分搅拌上充分搅拌1010分钟分钟（加速细胞破裂）（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红细胞破裂释放出血红细胞破裂释放出血红细胞破裂释放出血红蛋白蛋白蛋白蛋白(3)(3)(3)(3)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液过程过程将搅拌好混合液转移到离心管内，以将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min2000r/min的的速度离心速度离心10 min10 min第12页，讲稿共40张，创作于星期三13第第1 1层（最上层）：层（最上层）：甲苯层（无色透明）甲苯层（无色透明）第第2 2层（中上层）：层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）固体）第第3 3层（中下层）：层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）透明液体）第第4 4层（最下层）：层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次试管中溶液层次第13页，讲稿共40张，创作于星期三14用用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体静置片刻后，分出下层的红色透明液体分离分离第14页，讲稿共40张，创作于星期三15取取取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml300ml300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（中（中（pHpHpHpH为为7.07.07.07.0），透析），透析），透析），透析12121212小时小时2 2 2 2、粗分离、粗分离、粗分离、粗分离除去样品中分子量较小的杂质或用于更换样品中的缓冲液除去样品中分子量较小的杂质或用于更换样品中的缓冲液除去样品中分子量较小的杂质或用于更换样品中的缓冲液除去样品中分子量较小的杂质或用于更换样品中的缓冲液过程过程过程过程透析目的透析目的透析目的透析目的（透析）（透析）（透析）（透析）第15页，讲稿共40张，创作于星期三16第16页，讲稿共40张，创作于星期三171、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是（深入，首先要做的一步是（）A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构 B 弄清各种蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能C 弄弄清各种蛋白质的合成过程清各种蛋白质的合成过程 D 获得高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质D2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是确的是()A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质质 D 二者根本无法比较二者根本无法比较A教学反馈教学反馈 第17页，讲稿共40张，创作于星期三183凝胶色谱法是根据（凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。）分离蛋白质的有效方法。A分子的大小分子的大小 B相对分子质量的大小相对分子质量的大小 C带电荷的多少带电荷的多少 D溶解度溶解度4缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来持缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来持（）基本不变。）基本不变。A温维度温维度 B pH C渗透压渗透压 D氧气浓度氧气浓度5电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。）的电极移动。A相同相同 B相反相反 C相对相对 D相向相向6.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（）与氧气的运输）与氧气的运输有关。有关。A血红蛋白血红蛋白 B肌红蛋白肌红蛋白 C肌动蛋白肌动蛋白 D肌球蛋白肌球蛋白BBBA第18页，讲稿共40张，创作于星期三197血液由血浆和各种血细胞组成，其中（血液由血浆和各种血细胞组成，其中（）的含量最多。的含量最多。A白细胞白细胞 B血小板血小板 C红细胞红细胞 D淋巴细胞淋巴细胞8为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（凝血剂（）。）。A.NaCl B.甲苯甲苯 C.蒸馏水蒸馏水 D.柠檬酸钠柠檬酸钠将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为以明显看到试管中的溶液分为4层，层，其中其中第第3层是（层是（）A无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物其他杂质的暗红色沉淀物CDC第19页，讲稿共40张，创作于星期三20第20页，讲稿共40张，创作于星期三213 3、纯化（凝胶色谱操作）、纯化（凝胶色谱操作）（1 1）凝胶色谱柱的制作）凝胶色谱柱的制作取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，两端需厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平用砂纸磨平底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移液管头部安装移液管头部 覆盖尼覆盖尼龙网，再用龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端一端第21页，讲稿共40张，创作于星期三22底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底蛋白质分离不彻底注意事项：注意事项：顶塞的制作顶塞的制作打孔打孔 安装玻璃管安装玻璃管组装组装将上述三者按相应位置组装成一个整体将上述三者按相应位置组装成一个整体第22页，讲稿共40张，创作于星期三23第23页，讲稿共40张，创作于星期三24（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填凝胶的选择凝胶的选择A A、材料、材料“GG”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围围7575表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.57.5克克B B、代表意义：、代表意义：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）第24页，讲稿共40张，创作于星期三25配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶凝胶浸泡于浸泡于蒸馏水或洗脱液蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液液凝胶的前处理凝胶的前处理凝胶色谱柱的装填方法凝胶色谱柱的装填方法A A、固定、固定B B、装填、装填将色谱柱处置固定在支架上将色谱柱处置固定在支架上将凝胶悬浮液将凝胶悬浮液一次性的一次性的装填入色谱柱内，装装填入色谱柱内，装填时填时轻轻敲动色谱柱，轻轻敲动色谱柱，使使凝胶填装均匀凝胶填装均匀第25页，讲稿共40张，创作于星期三26注意：注意：2 2、装填凝胶柱时不得气泡存在：、装填凝胶柱时不得气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果离效果1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙隙思考思考:你能从凝胶色谱的分离原理分析为什你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？么凝胶的装填要紧密、均匀吗？第26页，讲稿共40张，创作于星期三27第27页，讲稿共40张，创作于星期三281 1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果效果 在装填过程中要注意些什么问题呢？在装填过程中要注意些什么问题呢？2 2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓磷酸缓冲液冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡）充分洗涤平衡1212小时小时洗涤平衡洗涤平衡第28页，讲稿共40张，创作于星期三29（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱调节缓冲液面调节缓冲液面滴加透析样品滴加透析样品吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面破坏凝胶面打开打开下端出口，下端出口，使柱内使柱内缓冲液缓冲液缓慢下降到与缓慢下降到与凝胶凝胶面平齐面平齐关闭出口关闭出口第29页，讲稿共40张，创作于星期三30第30页，讲稿共40张，创作于星期三31样品渗入凝胶床样品渗入凝胶床洗脱洗脱加样后加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口品完全进入凝胶层后，关闭下端出口小心加入小心加入pHpH为为7 7的的20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液到适当高到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱收集：收集：待待红色的蛋白质红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每液，每5ml5ml一试管，连续收集一试管，连续收集（在分离过程中，如果（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）第31页，讲稿共40张，创作于星期三32讨论：讨论：答：让血红蛋白处在稳定的答：让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和范围内，维持结构和功能功能注意：正确的加样操作注意：正确的加样操作1 1、不要触及破坏凝胶面、不要触及破坏凝胶面2 2、贴壁加样、贴壁加样3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动、使吸管管口沿管壁环绕移动1 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？理的目的是什么？第32页，讲稿共40张，创作于星期三332 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。作。第33页，讲稿共40张，创作于星期三34血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定3 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？第34页，讲稿共40张，创作于星期三35（四）鉴定（四）鉴定（SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳）鉴定血红蛋白纯度鉴定血红蛋白纯度目的目的第35页，讲稿共40张，创作于星期三36观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见教科（见教科书图书图5-185-18），），如果分层不明显，可能是洗涤次如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价三、实验结果分析与评价1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？述处理后的样品发生了哪些变化吗？第36页，讲稿共40张，创作于星期三37由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。填得均匀。此外，还可以此外，还可以加入大分子的有色物质，加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。要重新装柱。2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？第37页，讲稿共40张，创作于星期三38如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。与凝胶色谱柱的装填有关。3 3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？断分离效果？第38页，讲稿共40张，创作于星期三392、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是关于蛋白质的叙述，正确的是()A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较二者根本无法比较A第39页，讲稿共40张，创作于星期三感谢大家观看第40页，讲稿共40张，创作于星期三