微生物学的复制和修复讲稿.ppt

微生物学的复制和修复第一页，讲稿共五十四页哦第一节 DNA的复制 (DNA replication)DNA复制的几个原则：1.半保留复制(Semiconservative)DNA复制时，双螺旋结构解开而成两股单链，各自作为模板，合成新的互补链。子代细胞出现的DNA双链，其中一条单链是从亲代完整地接受过来，另一条单链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。1958年，M.Meselson和F.W.Stahl用同位素标记和密度梯度离心的方法首次证明了这种复制机制。第二页，讲稿共五十四页哦 The Meselson-Stahl experiment was designed to distinguish between two alternative DNA replication mechanisms.第三页，讲稿共五十四页哦 1963年，Cairns用放射自显影的方法，第一次观察到完整的正在复制的大肠杆菌的DNA，证明大肠杆菌的DNA是一个环状分子，以半保留的方式进行复制。ACB第四页，讲稿共五十四页哦 DNA的半保留复制可以说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代的复制后，DNA的结构仍然可以保持完整，这与它的遗传功能是相符的。2.DNA复制有固定的起点，而且通常是双向复制 原核生物的DNA和质粒DNA属于环状双链DNA，具有一个固定的复制起点，从该起点开始，双向等速度地复制。复制过程中，在电镜下可以看到一个形如眼睛的结构，称为复制眼，它类似于希腊字母，所以这种复制方式又称为复制。第五页，讲稿共五十四页哦 Replication of a circular chromosome produces a structure resembling the Greek letter theta(),and shows that both strands are replicated at the same time.第六页，讲稿共五十四页哦 Addition of 3H thymidine for a short period just before the reaction is stopped allows a distinction to be made between unidirectional and bidirectional replication.第七页，讲稿共五十四页哦 真核生物的DNA是线状双链DNA，有多个复制起点，在每个复制起点上双向、等速度地进行复制。第八页，讲稿共五十四页哦 3.DNA复制的方向为5 3，是半不连续的 子链DNA的复制方向都是5 3，所以母链的读链方向是3 5。(前导链)(后续链)(冈崎片段)第九页，讲稿共五十四页哦一、DNA的聚合反应 从大肠杆菌中提取的DNA聚合酶，能在具备 底物：4种dNTP 模板：一条单链DNA 引物：一小段与模板配对的DNA或RNA，具备3-OH Mg2+的条件下，使4种 dNTP聚合起来。新加上的dNTP与引物的3 -OH作用，形成3,5-磷酸二酯键，且所加上的核苷酸要与模板上的碱基互补配对，合成方向是从53。第十页，讲稿共五十四页哦 DNA聚合酶催化聚合酶催化DNA链的延长链的延长DNA聚合酶第十一页，讲稿共五十四页哦 二、与DNA聚合有关的酶 DNA聚合酶 原核生物DNA聚合酶 DNA聚合酶(Pol)由大肠杆菌的polA基因编码的一条多肽链，分子量为109KD，每个大肠杆菌中约有400个Pol 分子，它催化脱氧核苷酸聚合的速度为1000个/分。Pol 具有的功能：按53方向延长核苷酸链的功能；35外切酶的功能；53外切酶的功能；该外切酶功能的特点是切去的核苷酸是正确配对的，这种功能在DNA的复制中引物的切除及DNA损伤的修复中起着重要作用。第十二页，讲稿共五十四页哦正常的碱基互补配对由于互变异构等导致的不正常配对第十三页，讲稿共五十四页哦DNA聚合酶的35外切酶的校对作用第十四页，讲稿共五十四页哦 DNA的53外切酶功能可以切除一段与模板配对的DNA或RNA链，同时又可以合成一段新的DNA单链，表现为“切口位移”。第十五页，讲稿共五十四页哦 用枯草杆菌蛋白酶将Pol 水解成大、小两个片段，大片段有聚合酶和35外切酶的功能，又称为Klenow片段。DNA聚合酶聚合酶的空间构型的空间构型第十六页，讲稿共五十四页哦 DNA聚合酶(Pol)也需要模板、引物、底物和Mg2+，合成方向也是53,也具有35外切酶功能，但没有53外切酶功能。它只在无Pol和Pol的 时候才发挥聚合酶作用,每个大肠杆菌中有约40个酶分子。DNA聚合酶(Pol)在大肠杆菌中的量只有Pol的1/20，但活性比Pol高40倍以上，每分钟能催化105个核苷酸的聚合，是大肠杆菌中真正负责合成DNA的聚合酶，由多种亚基组成。第十七页，讲稿共五十四页哦 E.coli中三种中三种DNA聚合酶的比较聚合酶的比较第十八页，讲稿共五十四页哦E.coliDNA聚合酶聚合酶的亚基组成及主要功能的亚基组成及主要功能第十九页，讲稿共五十四页哦E.coli DNA聚合酶-亚基形成环状结构围绕着DNA双链。第二十页，讲稿共五十四页哦 真核生物的DNA聚合酶 真核生物中发现的DNA聚合酶有、四种。-DNA聚合酶的活性与DNA合成的活跃程度有时相的相关，负责真核生物DNA中后随链的合成；-DNA聚合酶存在于细胞核，最适pH为碱性，有最强的外切酶活性，被认为与损伤的修复有关。-DNA聚合酶存在于线粒体，参与线粒体DNA的复制。-DNA聚合酶是多亚基酶，有35外切酶活性，负责真核生物DNA中前导链的合成。第二十一页，讲稿共五十四页哦 复制的保真性 DNA聚合酶对模板的依赖性，是子链与母链能准确配对，使遗传信息延续、传代的保证。要确保DNA复制的保真性，至少依赖三种机理：遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长中对碱基的选择作用；复制中出错时有及时的校对功能。第二十二页，讲稿共五十四页哦 DNA连接酶(ligase)因为DNA聚合酶不能将3-OH和5-PO32-连接起来，所以不能形成闭合、连续的子链。DNA连接酶是能催化一条DNA链的3-OH和另一条DNA链的5-PO32-之间形成磷酸二酯键的酶，但连接的都是碱基互补基础上的双链中的单链缺口，它并没有连接单独存在的DNA单链或RNA单链的能力，也没有连接超过两个碱基以上的缺口的能力。第二十三页，讲稿共五十四页哦 常用的DNA连接酶有两种：大肠杆菌的DNA连接酶：能催化粘性末端的连接；T4DNA连接酶：既能催化粘接，也能催化平头连接；连接反应的能量来源：细菌的DNA连接酶以NAD作为能量来源；动物细胞和噬菌体的DNA连接酶以ATP为能量来源；第二十四页，讲稿共五十四页哦DNA连接酶的作用机理连接酶的作用机理第二十五页，讲稿共五十四页哦 DNA引物酶(primase）因为DNA聚合酶不能起始合成新的DNA链，所以需要合成一段引物提供3-OH。催化RNA引物形成的酶就是RNA引物酶，本质上属于以DNA为模板的RNA聚合酶，但与催化转录的RNA聚合酶有本质的不同：引物酶在模板的起始部位催化互补碱基的聚合，形成10-60个核苷酸长的RNA的引物片段。第二十六页，讲稿共五十四页哦 DNA解螺旋酶(helicase)DNA在复制之前，须先排除核苷酸之间的氢键作用和疏水性基团的相互作用，将双链解开，DNA解螺旋酶就是一类通过水解ATP获得能量，在复制叉处解开DNA双链的酶。每解开一对双键，要消耗2个ATP的2个高能键。DNA解螺旋酶首先同DNA的单链部分结合，再按复制叉移动方向向双链部分延伸，DNA helicase和Rep蛋白(解螺旋酶的一种)协同作用，前者结合在滞后链的模板上(即在方向53母链上随复制叉方向移动)，后者结合在前导链的模板上。第二十七页，讲稿共五十四页哦 DNA单链结合蛋白(DNA SSB)DNA解螺旋酶解开的双链由DNA单链结合蛋白来稳定，DNA SSB的特性就是能专一性地同DNA分子中已解开的单链区结合，阻止复性和DNA被核酸酶降解。SSB同DNA结合时表现出协同效应。第二十八页，讲稿共五十四页哦 DNA拓扑异构酶(topisomerase)DNA拓扑异构酶可以将共价闭环的超螺旋DNA解开成松弛态的闭合环状DNA，反应机理是先切开双链DNA的一条链，使链的末端螺旋向拧松超螺旋的方向转动，然后再将切口连接起来，所以兼有水解酶和连接酶的功能。每作用一次，使负超螺旋数目+1。第二十九页，讲稿共五十四页哦 DNA拓扑异构酶 (topisomerase)与DNA 拓扑异构酶相反，DNA拓扑异构酶能在DNA中引入负超螺旋，作用机理是在ATP提供能量下，水解切断DNA的两条链，两条链的断口同时饶过切口，然后再重新形成磷酸二酯键。每作用一次可使超螺旋数目2。第三十页，讲稿共五十四页哦 三种能催化形成磷酸二酯键的酶的比较 提供3-OH 提供5-P 结果 DNA聚合酶 引物或延长中的新链 游离的dNTP 形成(dNMP)n+1 DNA连接酶 复制中不连续的两条单链 形成连续的链DNA拓扑酶 切断并整理后的单链或双链 改变拓扑状态第三十一页，讲稿共五十四页哦 三、DNA的复制过程 E.coli 复制的起始位点(oriC)第三十二页，讲稿共五十四页哦 要开始复制，至少需要以下的蛋白质因子：DnaA蛋白：识别oriC，在特定部位解开双链 DnaB蛋白：即解螺旋酶 DnaC蛋白：帮助DnaB在起始位点的结合 HU:类似组蛋白的蛋白质，启动复制的起始 引物酶：合成RNA引物 SSB：结合单链DNA DNA拓扑异构酶：释放DNA解链产生的超螺旋1.复制的起始第三十三页，讲稿共五十四页哦E.中中 DNA 复复 制制 的的 起起 始始coli 在解链酶、SSB和拓扑酶等酶及蛋白质因子的共同作用下，DNA双链解开成单链。第三十四页，讲稿共五十四页哦 复制的延长 延长阶段同样需要解螺旋酶和拓扑异构酶解开双链，需要SSB稳定DNA单链，但前导链和滞后链的复制是完全不同的。前导链的复制，可以由53方向，在引物上连续进行，直至复制终点。第三十五页，讲稿共五十四页哦 在滞后链上，要先由引物酶分段合成RNA引物，在各段引物上按53方向分别形成DNA片段(即冈崎片段)至前一个冈崎片段的前方为止。引物酶和其他蛋白质因子共同组成引发体。第三十六页，讲稿共五十四页哦 前导链和滞后链的合成实际上是由DNA聚合酶二聚体催化同时完成的。第三十七页，讲稿共五十四页哦E.coliDNA聚合酶聚合酶二聚体的作用机理二聚体的作用机理第三十八页，讲稿共五十四页哦 复制的终止 DNA聚合酶利用其53核酸外切酶的活性，将冈崎片段的RNA引物水解，产生的空隙由后面的冈崎片段继续延伸填补，这个过程也由DNA聚合酶来完成，延长直至前一个片段的5-P，最后由DNA连接酶将片段之间所剩的小缺口通过形成磷酸二酯键连接起来，成为真正连续的子链。第三十九页，讲稿共五十四页哦 第二节 DNA的损伤与修复 DNA的突变和保守是对立统一的自然现象，没有突变，就没有今天多种多样的物种。突变的分子基础 突变就是DNA分子上碱基的改变，分为自发突变和诱发突变。突变的后果有以下四种：致死性的；使生物体功能丧失；只改变基因型而无表现型的改变；有益的突变。第四十页，讲稿共五十四页哦 根据DNA分子的改变，可把突变分为 点突变 DNA分子上一个碱基的变换，又分为 转换（同型碱基的相互替换）和颠换（异 型碱基的相互替换）；缺失 一个碱基或一段核苷酸链从DNA分子上消失；插入 一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷 酸链插入到DNA分子中间；缺失和插入可以 引起移码突变，倒位 DNA链内部重组，使其中一段方向反置，或 大片段的链在DNA分子内迁移。第四十一页，讲稿共五十四页哦 诱发突变的原因及突变类型 诱变因素 突变类型 物理因素 紫外线照射 形成胸腺嘧啶二聚体 离子辐射 打断DNA分子的共价键化学因素 5-溴尿嘧啶 使A-T对最终变成G-C对 羟胺 使G-C对最终变成A-T对 亚硝酸盐 使G-C对最终变成A-T对 氮芥类 使DNA链脱鸟嘌呤第四十二页，讲稿共五十四页哦复制甲基化的甲基化的G使使DNA发生发生G-CA-T的突变的突变第四十三页，讲稿共五十四页哦 二、损伤的修复 光修复 紫紫外外线线引引起起相相邻邻嘧嘧啶啶碱碱基基之之间间形形成成二二聚聚体体。第四十四页，讲稿共五十四页哦光光 复复 活活 酶酶 修修 复复 嘧嘧 啶啶 二二 聚聚 体体第四十五页，讲稿共五十四页哦 切除修复 这是细胞具有的一种普遍的功能，对多种损伤造成的DNA双螺旋的不正常结构均能加以去除。1.不配对的碱基的切除修复第四十六页，讲稿共五十四页哦 2.能正确配对的异常碱基的切除修复第四十七页，讲稿共五十四页哦 3.核苷酸的切除修复 第四十八页，讲稿共五十四页哦 重组修复 这是一种复制后修复，参与修复的酶系主要是重组基因recA编码的蛋白质，它具有交换DNA链的能力。recA、recB、聚合酶、连接酶第四十九页，讲稿共五十四页哦 SOS修复 当细胞损伤至难以继续复制的地步，单链缺口很多时，会诱发这种应急的修复方式。参与反应的有重组蛋白RecA和调控蛋白LexA，还有校对功能较差的DNA聚合酶，使复制能在损伤部位进行，但却带来了高的变异率。第五十页，讲稿共五十四页哦 第二节 在RNA指导下的DNA的合成 以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA，称为逆转录(reverse transcription)，逆转录与通常转录过程中遗传信息从DNA到RNA方向相反。中中心心法法则则第五十一页，讲稿共五十四页哦 逆转录酶是一种多功能的酶：1.依赖RNA的DNA聚合酶活性；2.核酸外切酶的活性，可以水解RNA-DNA杂交分子中的RNA；3.依赖DNA的DNA聚合酶活性。第五十二页，讲稿共五十四页哦反转录病毒侵染宿主染色体的过程反转录病毒侵染宿主染色体的过程第五十三页，讲稿共五十四页哦 典型的逆转录病毒的基因组成第五十四页，讲稿共五十四页哦