核酸杂交技术分子生物学.pptx
核酸杂交技术分子生物学核酸杂交技术分子生物学现在学习的是第1页，共58页主主 要要 内内 容容 核酸探针核酸探针 核酸杂交概念及原理核酸杂交概念及原理 核酸杂交的分类核酸杂交的分类Southern blot Northern blotchipChIP on chip现在学习的是第2页，共58页一、核酸分子杂交的概念及原理一、核酸分子杂交的概念及原理核酸杂交核酸杂交:两个两个不同来源的不同来源的、含有、含有互补碱基序列互补碱基序列的单股的单股核酸分子，通过碱基配对形成一个新的、核酸分子，通过碱基配对形成一个新的、稳定的双股分稳定的双股分子子的过程。的过程。现在学习的是第3页，共58页 核酸经核酸经加热变性加热变性后，在低于变性温度后，在低于变性温度20-20-3030时，反应系统中加入的时，反应系统中加入的核酸探针核酸探针与待测核酸样与待测核酸样品中具有品中具有互补序列互补序列的单链的单链DNA或或RNA形成双链结构形成双链结构，通过检测通过检测标记信号标记信号即可检测特定的核酸片段。即可检测特定的核酸片段。核酸分子杂交技术原理核酸分子杂交技术原理现在学习的是第4页，共58页二、核酸探针二、核酸探针 核酸探针核酸探针（nucleic probe）:带有可检测标记，带有可检测标记，能与特定序列的核酸片段互补配对形成双链的一能与特定序列的核酸片段互补配对形成双链的一段核酸。段核酸。核酸探针的质量（核酸探针的质量（标标记效率记效率和和特异性特异性）是核）是核酸分子杂交成功的关键。酸分子杂交成功的关键。现在学习的是第5页，共58页1.1.核酸探针的分类核酸探针的分类根据标记物的性质分：根据标记物的性质分：v 放射性标记放射性标记:3232P,P,3535S,S,125125I,I,3 3H H。v 非放射性标记非放射性标记：化学发光标记、酶标记、荧光标：化学发光标记、酶标记、荧光标记等记等敏感度高，半衰期短敏感度高，半衰期短（3232P 14.3P 14.3天，天，3535S 87.1S 87.1天，天，125125I 60I 60天，天，3 3H H 的半衰期长达的半衰期长达12.312.3年，但它所释放年，但它所释放放射线放射线能量太低，只能用于组织原位杂交），能量太低，只能用于组织原位杂交），有辐射危害有辐射危害。现在学习的是第6页，共58页根据探针中根据探针中核酸的性质核酸的性质分：分：DNA (包括包括cDNA)探针探针RNA探针探针(包括包括cRNA)寡核苷酸探针寡核苷酸探针肽核酸（肽核酸（peptide nucleic acid,PNA）探针）探针现在学习的是第7页，共58页(1)DNA探针（包括探针（包括cDNA探针）的优点：探针）的优点：这类探针多这类探针多克隆在质粒载体克隆在质粒载体中，易于扩增，取之中，易于扩增，取之不尽，制备方法简便。不尽，制备方法简便。DNA探针探针较稳定较稳定（相对（相对RNA而言）。而言）。DNA探针的探针的标记方法较成熟标记方法较成熟，有多种方法可供选，有多种方法可供选择，能用于择，能用于同位素和非同位素标记同位素和非同位素标记。现在学习的是第8页，共58页(2)RNA探针：主要是探针：主要是细胞细胞mRNA和和病毒病毒RNA探针。探针。vRNA探针和探针和cRNA探针的特点：探针的特点：杂交反应效率高、杂交反应效率高、易于降解、标记方法复杂易于降解、标记方法复杂。v用途：用途：用于检测用于检测DNA和和mRNA，以及研究基因表达中，以及研究基因表达中的转录。的转录。vcRNA探针探针：以双链：以双链DNA中与中与mRNA 序列相同的一序列相同的一条链为模板转录得到的条链为模板转录得到的RNA链，其序列与链，其序列与mRNA互补，互补，也称为反义也称为反义RNA。现在学习的是第9页，共58页 采用化学合成的短链寡核苷酸探针采用化学合成的短链寡核苷酸探针,最常用的寡最常用的寡核苷酸探针有核苷酸探针有18-4018-40个碱基。个碱基。(3)寡核苷酸探针特点：特点：链短、序列复杂度低、分子量小链短、序列复杂度低、分子量小，与等，与等量靶位点完全杂交的时间短。量靶位点完全杂交的时间短。寡核苷酸探针可寡核苷酸探针可识别靶序列内识别靶序列内1 1个碱基的个碱基的变化变化。一次可大量合成寡核苷酸探针，使得这种一次可大量合成寡核苷酸探针，使得这种探针价格低廉。探针价格低廉。现在学习的是第10页，共58页2.探针设计的条件 被检基因结构清楚；有明确的基因产物;具备下列条件之一，就可以设计、制备特异具备下列条件之一，就可以设计、制备特异性基因探针。性基因探针。现在学习的是第11页，共58页3.3.核酸探针的常用标记方法核酸探针的常用标记方法 核酸探针的标记几核酸探针的标记几乎总是先将乎总是先将底物底物标记相标记相应的信号，然后利用应的信号，然后利用核核酸合成酸合成的方法合成具有的方法合成具有标记信号的核苷酸链。标记信号的核苷酸链。Pol.substrateprobe现在学习的是第12页，共58页 切口平移法（切口平移法（nick translationnick translation）PCR PCR法法 DNA DNA快速末端标记快速末端标记 T4 T4多核苷酸激酶标记多核苷酸激酶标记DNA 5DNA 5末端末端 随机引物延伸随机引物延伸 放射性探针的标记放射性探针的标记现在学习的是第13页，共58页由由DNase和大肠和大肠杆菌杆菌DNA聚合酶聚合酶共同完成。共同完成。DNase：在双链在双链DNADNA上随机打开若上随机打开若干个单链切口，产干个单链切口，产生生3-OH3-OH端端大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合聚合酶酶：53DNA53DNA聚聚合酶活性；合酶活性；5353核酸外切酶活性核酸外切酶活性(1)(1)切口平移标记法切口平移标记法（nick translation）现在学习的是第14页，共58页随机引物随机引物：含有各种可能排：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合列顺序的寡核苷酸片段的混合物。物。4 46 6=4096=4096DNA聚合酶聚合酶Klenow片段片段：53DNA聚合酶活性聚合酶活性 弱弱35外切核酸酶活性外切核酸酶活性无无53外切核酸酶活性外切核酸酶活性（2 2）随机引物法）随机引物法（random priming）现在学习的是第15页，共58页 产物平均长度为产物平均长度为400-600个核苷酸。个核苷酸。Klenow片段没有片段没有5 3外切酶活性外切酶活性,反应稳定反应稳定,可以获得大可以获得大量的有效探针。量的有效探针。反应时对模板的要求不严格反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒用微量制备的质粒DNA模板也可进模板也可进行反应。行反应。现在学习的是第16页，共58页(3)(3)末端标记法末端标记法用途：制备高比活性探针(1010 cpm/g DNA);DNA末端修饰-缺失 外切酶活性外切酶活性 聚合酶活性聚合酶活性 无无dNTP dNTPT4 DNA聚合酶聚合酶53聚合酶活性，聚合酶活性，1500 nt/min,为为pol I的两倍的两倍 35外切酶活性，可作用于外切酶活性，可作用于ss-DNA和和dsDNA,其切其切除速度分别为除速度分别为40和和 4000nt/min现在学习的是第17页，共58页乙醇沉淀法乙醇沉淀法凝胶过滤法凝胶过滤法（G-50 Spin column）探针纯化现在学习的是第18页，共58页非放射性探针的标记非放射性探针的标记生物素标记核酸生物素标记核酸 酶标核酸酶标核酸半抗原标记核酸半抗原标记核酸 根据标记物的性质分：根据标记物的性质分：根据标记方法分：根据标记方法分：酶促反应标记法酶促反应标记法化学修饰标记法化学修饰标记法现在学习的是第19页，共58页 以以生物素化的脱氧核苷生物素化的脱氧核苷三磷酸三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio-7-dATP、Bio-11-dCTP）等代替）等代替相应脱氧核苷三磷酸，经相应脱氧核苷三磷酸，经DNA聚合酶作用掺入新合成聚合酶作用掺入新合成的的DNA。可以采用切口平移法。可以采用切口平移法和随机引物延伸法进行。和随机引物延伸法进行。生物素标记生物素标记酶促法酶促法基本原理：基本原理：现在学习的是第20页，共58页 光敏生物素分子侧链上连接的芳香基叠氮化合物具光敏感光敏生物素分子侧链上连接的芳香基叠氮化合物具光敏感性，在一定波长的光照射下，光敏基团可活化为芳香基硝基苯，性，在一定波长的光照射下，光敏基团可活化为芳香基硝基苯，很易与腺嘌呤很易与腺嘌呤N7 位氨基特异结合，位氨基特异结合，形成生物素化的核酸探形成生物素化的核酸探针针。生物素标记生物素标记化学修饰法（光敏法）化学修饰法（光敏法）基本原理：基本原理：现在学习的是第21页，共58页酶标法酶标法 使用交联剂戊二醛将使用交联剂戊二醛将辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（）或碱性磷酸酶（AP）标记在标记在DNA上，再通过酶促反应使其无色底物转变成有颜色的产物上，再通过酶促反应使其无色底物转变成有颜色的产物现在学习的是第22页，共58页酶标法酶标法碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AP)：BCIP（5-溴溴-4氯氯-3吲哚磷酸盐吲哚磷酸盐-4-甲基胺蓝）甲基胺蓝）NBT（四氮唑蓝）（四氮唑蓝）现在学习的是第23页，共58页酶标法酶标法辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)：DAB（二氨基联苯胺）（二氨基联苯胺）棕色棕色TMB（四甲基联苯胺）（四甲基联苯胺）蓝色蓝色现在学习的是第24页，共58页 地高辛地高辛（Digoxigenin，DIG）即异羟基洋地黄毒甙，是一种类）即异羟基洋地黄毒甙，是一种类固醇半抗原，来源于植物（固醇半抗原，来源于植物（Digitalis purouren 和和Digitalis lanta）的花）的花和叶中。和叶中。DIG 可以与可以与dUTP反应形成反应形成DIG-dUTP，通过酶促法插入到合，通过酶促法插入到合成的成的DNA探针中。通过酶标记的抗地高辛抗体来实施检测。探针中。通过酶标记的抗地高辛抗体来实施检测。地高辛标记地高辛标记基本原理：基本原理：现在学习的是第25页，共58页现在学习的是第26页，共58页三、核酸分子杂交的类型三、核酸分子杂交的类型 核酸分子杂交可按作用环境大致分为核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交固相杂交和和液相杂交液相杂交两种类型。两种类型。以上两种类型根据具体的杂交方式，反以上两种类型根据具体的杂交方式，反应条件等又可以分成多种类型。应条件等又可以分成多种类型。现在学习的是第27页，共58页 概念：概念：参加反应的一条核酸链被预先固定在参加反应的一条核酸链被预先固定在固固相支持物相支持物上，另一条上，另一条核酸链则游离在溶核酸链则游离在溶液中液中进行的杂交反应。进行的杂交反应。固相支持物：固相支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜、膜、乳胶颗粒、磁珠、微孔板，芯片乳胶颗粒、磁珠、微孔板，芯片等等1.1.固相杂交固相杂交现在学习的是第28页，共58页u分类：分类：杂交后，游离片段杂交后，游离片段容易经漂洗除去容易经漂洗除去；菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、SouthernSouthern印迹杂交、印迹杂交、NorthernNorthern印迹杂交、组织原位杂交和印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。夹心杂交等。u 固相杂交的特点：固相杂交的特点：支持物上留下的支持物上留下的杂交物容易检测杂交物容易检测；能防止能防止靶靶DNA自我复性自我复性。因此，该法最为常用。因此，该法最为常用。现在学习的是第29页，共58页常用杂交方法介绍现在学习的是第30页，共58页基本原理：基本原理：是是1975年由英国人年由英国人Southern创建，在遗传病诊断、创建，在遗传病诊断、DNA图谱分图谱分析及析及PCR产物分析等方面有重要价值。产物分析等方面有重要价值。DNA标标本用限制性内切本用限制性内切酶酶消化后，消化后，经琼经琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳分离，然泳分离，然后将后将DNA从凝胶中从凝胶中转转印至印至滤滤膜上膜上与探针杂交。与探针杂交。通过检测与探针互补通过检测与探针互补DNA条带来确定在众多酶解产物中含某一条带来确定在众多酶解产物中含某一特定序列的特定序列的DNA片段的位置和大小。片段的位置和大小。（一）、（一）、Southern印迹印迹（Southern blot）现在学习的是第31页，共58页提取提取DNA限制性内切酶消化限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳碱变性碱变性转移到转移到NC膜，高温烘烤膜，高温烘烤与与DNA或或RNA探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影预杂交预杂交现在学习的是第32页，共58页tissueSDSPro KPhenolCHCl3ETOH pptSpin1、提取基因组DNA SDS使组织蛋白与使组织蛋白与DNA分子分离分子分离 蛋白酶蛋白酶K消化分解蛋白质消化分解蛋白质 酚、氯仿酚、氯仿/异戊醇抽提除去蛋白质，异戊醇抽提除去蛋白质，乙醇沉淀纯化乙醇沉淀纯化DNA 加入加入EDTA能抑制能抑制DNase的活性，的活性，RNase除去除去RNA，此法可获得，此法可获得100200kb的的DNA片段。片段。现在学习的是第33页，共58页2、限制性核酸内切酶切断DNA基因组基因组DNA很大，需要将其切割成片段后用于杂交分析。很大，需要将其切割成片段后用于杂交分析。一般选择一种限制酶来切割一般选择一种限制酶来切割DNA分子。分子。有时可采用有时可采用部分和充分消化相结合部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。片段。消化消化DNA后，加入后，加入EDTA，65加热灭活内切酶。加热灭活内切酶。样品可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩样品可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品。样品。现在学习的是第34页，共58页3、琼脂糖凝胶电泳和碱变性 先将先将DNA样品样品(含不同大小的含不同大小的DNA片段片段)先按片断长短进行分离，先按片断长短进行分离，然后进行杂交然后进行杂交。琼脂糖凝胶电泳可分辨琼脂糖凝胶电泳可分辨7080000bp的的DNA片段。片段。DNA样品与上样品与上样缓冲液混匀，上样。样缓冲液混匀，上样。DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构 为了有效地实现为了有效地实现DNA片段转移，最好将片段转移，最好将DNA片段控制在片段控制在2kb以以下。若下。若DNA片段大于片段大于15kb，将电泳凝胶浸泡在，将电泳凝胶浸泡在0.25M 的的HCl溶液溶液约约10分钟作脱嘌呤处理，打断分钟作脱嘌呤处理，打断DNA片段。片段。将电泳凝胶移至碱性溶液中浸泡，使将电泳凝胶移至碱性溶液中浸泡，使DNA变性，再用中性变性，再用中性pH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。现在学习的是第35页，共58页4、将DNA转移至尼龙膜将凝胶中单链将凝胶中单链DNA片段片段转移到固相支持物转移到固相支持物上。注意保持各上。注意保持各DNA片段的相对位置不变片段的相对位置不变。用于转膜的固相支持物有多种，包括用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙膜）、尼龙（Nylon）膜）膜、PVDF膜、化学活化膜和滤纸等膜、化学活化膜和滤纸等。a处理膜时应戴手套并用平头镊子操作，处理膜时应戴手套并用平头镊子操作，膜切角膜切角。b去离子水完全润湿膜，去离子水完全润湿膜，浸入变性转移浸入变性转移液至少液至少5分钟。分钟。c.制作转印制作转印“三明治三明治”，用，用玻棒赶出玻棒赶出其间滞其间滞留的留的气泡气泡。d.DNA转移持续进行转移持续进行8-24小时。小时。现在学习的是第36页，共58页重物重物玻璃板玻璃板吸水纸吸水纸滤纸滤纸NC滤膜滤膜凝胶凝胶滤纸滤纸支持物支持物转移缓冲液转移缓冲液n毛细管虹吸转移法现在学习的是第37页，共58页尼龙膜尼龙膜凝胶凝胶滤纸滤纸海绵海绵凝胶支持夹凝胶支持夹缓冲液缓冲液电极电极+滤纸滤纸电极电极n电转移法现在学习的是第38页，共58页n真空转移法现在学习的是第39页，共58页5 5膜的洗涤、固定膜的洗涤、固定1）膜膜置置于于0.5M TrisCl（pH7.2）、1M NaCl中中，室室温温浸泡浸泡15分钟，分钟，除去粘附的琼脂糖除去粘附的琼脂糖。2）将膜平铺于一张纸巾上，）将膜平铺于一张纸巾上，室温干燥室温干燥30分钟分钟以上。以上。3）DNA固固定定：在在真真空空烤烤箱箱或或普普通通烘烘箱箱内内于于80烘烘烤烤0.52小时。小时。现在学习的是第40页，共58页6.6.探针标记探针标记和预杂交预杂交 预杂交：预杂交：将膜上所有能与将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭。结合的位点全部封闭。预杂交液预杂交液：含有鲑鱼精子含有鲑鱼精子DNA（该（该DNA与哺乳动物的同源性极低，不与哺乳动物的同源性极低，不会与会与DNA探针杂交）、牛血清等。探针杂交）、牛血清等。southern印迹杂交炉印迹杂交炉 用用杂交袋杂交袋封装。封装。每平方厘米每平方厘米NCNC膜需膜需预杂交液预杂交液0.2ml0.2ml。鲑鱼精鲑鱼精DNADNA置沸水浴中置沸水浴中10min10min，迅速置冰上冷却，迅速置冰上冷却1-1-2min2min，使使DNADNA变性，保持单链变性，保持单链。变性的鲑鱼精变性的鲑鱼精DNADNA加至加至终浓度终浓度200g/ml200g/ml。4242水浴中温育水浴中温育4h4h。现在学习的是第41页，共58页7 7、杂交、洗膜、杂交、洗膜加入标记的探针加入标记的探针DNA（预先热变性成为单链（预先热变性成为单链DNA分子）。分子）。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行，杂交过夜。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行，杂交过夜。然后在较高温度下用盐溶液洗膜。然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高。离子强度越低，温度越高。现在学习的是第42页，共58页（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。（二）在暗室内，将（二）在暗室内，将2张张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶带固定，光底片放入曝光暗盒，并用透明胶带固定，合上暗盒。合上暗盒。（三）将暗盒置（三）将暗盒置-70低温冰箱中使滤膜对低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在弱决定曝光时间，一般在1-3天）。天）。8 8、放射性自显影检测、放射性自显影检测（四）从冰箱中取出暗盒，置室温（四）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使，使其温度上升至室温，然后冲洗其温度上升至室温，然后冲洗X光底片。光底片。现在学习的是第43页，共58页 Southern blot 是研究是研究DNA图谱的基本技术，在图谱的基本技术，在遗遗传诊断传诊断、DNA图谱分析图谱分析及及PCR产物分析产物分析等方面有重要等方面有重要价值。价值。Southern blot 的应用血迹中的血迹中的DNAnDNA指纹分析指纹分析现在学习的是第44页，共58页基本原理：将基本原理：将RNARNA标本标本经琼脂糖凝胶电泳分离后转印至硝酸经琼脂糖凝胶电泳分离后转印至硝酸纤维素膜上，烘干固定后于探针杂交。纤维素膜上，烘干固定后于探针杂交。（二）、（二）、Northern印迹印迹（northern blot northern blot）注意：注意：A A 甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNARNA变性变性,不能用不能用NaOH NaOH（会使（会使RNARNA水解）。水解）。B B 样品样品RNARNA变性后进行变性后进行电泳分离电泳分离。C C 转印后，烘烤固定前转印后，烘烤固定前不能用低盐缓冲液洗不能用低盐缓冲液洗 D D 胶中不能加胶中不能加EBEB（影响（影响RNARNA与硝酸纤维素膜的结合）与硝酸纤维素膜的结合）现在学习的是第45页，共58页 RNA RNA提取提取甲醛变性电泳甲醛变性电泳 印迹转移印迹转移预杂交预杂交 杂交（变性探针）杂交（变性探针）洗膜洗膜放射自显影或化学发光放射自显影或化学发光甲醛变性电泳：甲醛变性电泳：RNA变性，消除RNA中的二级结构，保证RNA完全按照分子的大小分离。DEPC水处理电泳槽，去除RNA酶。在通风橱中加入甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。现在学习的是第46页，共58页四、核酸分子杂交实验因素的优化v探针的类型、标记方法和浓度探针的类型、标记方法和浓度v杂交反应温度杂交反应温度v杂交反应时间杂交反应时间v杂交促进剂杂交促进剂现在学习的是第47页，共58页根据不同的杂交实验要求，选择不同的探针：1.探针的选择检测检测单个碱基改变单个碱基改变：首选用：首选用寡核苷酸探针寡核苷酸探针；检测检测单链靶序列单链靶序列：选用与其互补的：选用与其互补的DNADNA单链探针（单链探针（M13M13噬菌体）或噬菌体）或RNARNA探针，寡核苷酸探针探针，寡核苷酸探针也可；也可；长的长的双链双链DNADNA探针探针特异性较强，适宜检测复杂的特异性较强，适宜检测复杂的靶靶核酸序列和病原体核酸序列和病原体 ，但不适宜于组织原位杂交，但不适宜于组织原位杂交现在学习的是第48页，共58页 视个人的习惯和可利用条件而定，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。n通常，放射性探针比非放射性探针灵敏度高；n在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法；n在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶检测系统。2.探针的标记方法现在学习的是第49页，共58页3.3.探针的浓度u探针浓度增加，杂交率增加；u在较窄的范围内，探针浓度增加，敏感性增加。膜杂交中，放射性探针与非放射性探针的用量分膜杂交中，放射性探针与非放射性探针的用量分别为别为5-10ng/ml5-10ng/ml和和25-1000ng/ml25-1000ng/ml；原位杂交中，用量均为原位杂交中，用量均为0.5-5.0g/ml0.5-5.0g/ml。现在学习的是第50页，共58页4.杂交温度杂交最重要的因素之一是选择恰当的杂交温度。杂交最重要的因素之一是选择恰当的杂交温度。温度温度 ：温度温度 ：杂交特异性杂交特异性 ，杂交率杂交率 杂交特异性杂交特异性杂交率杂交率 ，如两个同源性在如两个同源性在50%50%左右或更低些的左右或更低些的DNADNA，调整杂交温度可，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化使它们之间的杂交率变化1010倍，因此在实验前必须首先确定倍，因此在实验前必须首先确定杂交杂交温度温度。现在学习的是第51页，共58页最适复性温度：最适复性温度：T Toror=T=Tm m 25 25苛刻复性温度：苛刻复性温度：T Ts s =T=Tm m (10 (10或或15)15)非苛刻复性温度：非苛刻复性温度：T Tnsns=T=Tm m (30 (30或或35)35)通常有三种温度可供参考，即通常有三种温度可供参考，即最适复性温度最适复性温度、苛苛刻复性温度刻复性温度及及非苛刻复性温度非苛刻复性温度。现在学习的是第52页，共58页5.5.杂交反应时间杂交反应时间 在其他条件都得到满足的情况下，杂交的成败取决在其他条件都得到满足的情况下，杂交的成败取决于于保温时间保温时间。时间短了，杂交反应不完成；时间长。时间短了，杂交反应不完成；时间长了会引起非特异结合增多。了会引起非特异结合增多。现在学习的是第53页，共58页常用促进剂：惰性多聚体可促进惰性多聚体可促进250nt250nt以上的探针以上的探针的杂交率。的杂交率。硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖，平均，平均MWMW为为500000500000；聚乙二醇聚乙二醇（PEG），），MW MW 为为6000-80006000-8000、粘度低、价廉，、粘度低、价廉，但它不能完全取代硫酸葡聚糖；但它不能完全取代硫酸葡聚糖；聚丙烯酸聚丙烯酸，用其钠盐，用其钠盐，MWMW约约9000090000，浓度，浓度2-4%2-4%。价廉，。价廉，粘度低。粘度低。6.杂交促进剂现在学习的是第54页，共58页（三）、（三）、DNA芯片（芯片（DNA chip）n1995年斯坦福大学年斯坦福大学Schena M和和 Brown PO等发表第一等发表第一篇基因表达阵列芯片，之后国内外兴起了一股微点阵篇基因表达阵列芯片，之后国内外兴起了一股微点阵（microarrays）技术）技术DNADNA芯片的浪潮。芯片的浪潮。nDNA芯片是将各种芯片是将各种“探针探针”固定在基质上，用于检测固定在基质上，用于检测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。现在学习的是第55页，共58页 基因芯片基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵列技术是指通过微阵列（Microarray）技术将高密度）技术将高密度DNA片段通过高速机器人片段通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如膜、玻璃片等固相表面，以同位素或荧光标记的膜、玻璃片等固相表面，以同位素或荧光标记的DNA探探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的技术。方面研究的技术。1、概念现在学习的是第56页，共58页基基因因芯芯片片工工作作流流程程现在学习的是第57页，共58页（chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip）特异性地富集目的蛋白结合的特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，解交联后对片段，解交联后对目的片段进行纯化、扩增和荧光标记，再用于芯片分析；目的片段进行纯化、扩增和荧光标记，再用于芯片分析；寻找特异性蛋白在基因组中的结合位点，获得蛋白寻找特异性蛋白在基因组中的结合位点，获得蛋白质与质与DNA相互作用的信息。相互作用的信息。四、染色质免疫共沉淀四、染色质免疫共沉淀-芯片芯片现在学习的是第58页，共58页
