碱性磷酸酶的分离纯化鉴定.ppt
关于碱性磷酸酶的分离纯化鉴定现在学习的是第1页，共20页分离纯化的一般程序分离纯化的一般程序选择材料选择材料破碎细胞破碎细胞提取提取分离纯化分离纯化分析及鉴定分析及鉴定现在学习的是第2页，共20页 AKP AKP溶于溶于30%30%乙醇、乙醇、33%33%丙酮（丙酮（上清上清中），中），AKPAKP不溶于不溶于60%60%乙醇、乙醇、50%50%丙酮（丙酮（沉淀沉淀中），中），原理：现在学习的是第3页，共20页操操 作作一、取材及匀浆一、取材及匀浆 取兔肝取兔肝2g，剪碎，剪碎，加入加入6ml 0.01mol/L醋酸镁和醋酸钠醋酸镁和醋酸钠混合液，充分匀浆。混合液，充分匀浆。记录体积记录体积 （取（取0.1ml至一新至一新EP管留作管留作A液，测定时稀释液，测定时稀释25倍倍）二、提取二、提取 加入加入2ml正丁醇，搅拌正丁醇，搅拌2min，室温放置，室温放置30min。过滤，。过滤，留上清留上清。计体积。计体积。现在学习的是第4页，共20页三、分离纯化三、分离纯化1、50丙酮沉淀丙酮沉淀AKP 加入加入等体积等体积丙酮，丙酮，3000rpm5min，留沉淀，留沉淀，加加4ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，醋酸镁溶解沉淀，记录体积记录体积。（取（取0.1ml留作留作B液液，稀释，稀释10倍倍）2、30乙醇溶解乙醇溶解AKP 每每ml溶液中加入溶液中加入95乙醇乙醇0.46ml 2000rpm5min，留上清留上清（记录体积记录体积）3、60乙醇沉淀乙醇沉淀AKP 每每ml溶液中加入溶液中加入95乙醇乙醇0.86ml 3000rpm5min，留沉淀，留沉淀，加加3ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，醋酸镁溶解沉淀，记录体积记录体积。（取（取0.1ml留作留作C液，液，使用时稀释使用时稀释5倍倍）现在学习的是第5页，共20页4、33丙酮溶解丙酮溶解AKP 每每ml溶液中加入溶液中加入0.33ml丙酮丙酮 2000rpm5min，留上清留上清（记录体积记录体积）5、50丙酮沉淀丙酮沉淀AKP 每每ml溶液中加入溶液中加入0.36ml丙酮丙酮 3000rpm15min，留沉淀，留沉淀，5ml Ph8.8的的Tris-醋酸镁醋酸镁溶解沉淀溶解沉淀 （D液，不稀释液，不稀释）现在学习的是第6页，共20页四、分析及鉴定四、分析及鉴定1、碱性磷酸酶的活性测定（磷酸苯二钠法）、碱性磷酸酶的活性测定（磷酸苯二钠法）2、碱性磷酸酶蛋白含量测定（、碱性磷酸酶蛋白含量测定（BCA法）法）3、比活性及纯化倍数计算、比活性及纯化倍数计算现在学习的是第7页，共20页分光光度法分光光度法（Spectrophotometry）根根据据物物质质对对不不同同波波长长的的光光线线具具有有选选择择性性吸吸收收（即即可可产产生生吸吸收收光光谱谱）的的特特性性而而建建立立起起来来的的一一种种定定量量、定定性性分分析析的的技技术术。也也称称为为吸吸收收光光谱谱法法（Absorption spectrometry）。）。不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来现在学习的是第8页，共20页（一）基本原理（一）基本原理 光具有波粒二相性。光具有波粒二相性。波波长长和和频频率是光的波率是光的波动动性的特征。性的特征。1、光的基本知识、光的基本知识紫外分光光度计（紫外分光光度计（200400nm）可见光分光光度计可见光分光光度计（400760nm）红外分光光度计红外分光光度计（7601000nm）现在学习的是第9页，共20页2、定量分析的理论基础定量分析的理论基础 LambertBeer定律定律A KLC吸光度吸光度(Aabsorbance,A)消光度消光度(degree of extinction,E)光密度光密度(optical density,D)K-吸光系数吸光系数,是物质的特征性常数。是物质的特征性常数。现在学习的是第10页，共20页o对比法进行定量分析对比法进行定量分析A样样=K L C样样A标标=K L C标标A样样A标标K L C样样K L C标标C样样C标标C样样=A样样 C标标/A标标现在学习的是第11页，共20页o单色光、平行光（单色光、平行光（maxmax）o溶液均匀、清澈、无散射溶液均匀、清澈、无散射o溶液性质稳定，比色皿中无化学反应溶液性质稳定，比色皿中无化学反应o适用于稀溶液（适用于稀溶液（A 0.2-0.7）LambertBeer定律的适用范围：定律的适用范围：现在学习的是第12页，共20页o溶剂空白：溶剂空白：当显色剂及所用其它试剂在测定波长都没有当显色剂及所用其它试剂在测定波长都没有吸收峰时，可用纯溶剂吸收峰时，可用纯溶剂(如蒸馏水如蒸馏水)作参比溶液。作参比溶液。o试剂空白试剂空白：当显色前的样品在测定波长没有吸收峰，当显色前的样品在测定波长没有吸收峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，可用而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，可用不加入样品的不加入样品的“试剂空白试剂空白”作参比溶液，这种方式作参比溶液，这种方式最为常用。最为常用。参比溶液的选择参比溶液的选择 现在学习的是第13页，共20页基本组件及常见分光光度计基本组件及常见分光光度计现在学习的是第14页，共20页分光光度计的使用分光光度计的使用1.打开电源预热打开电源预热15分钟分钟2.选择波长（选择波长（max）3.光标指向光标指向Trans4.打开光门，调节打开光门，调节0；关上光门调节；关上光门调节1005.重复重复4一次一次6.将光标指向将光标指向ABS7.读数读数现在学习的是第15页，共20页磷酸苯二钠磷酸苯二钠碱性磷酸酶碱性磷酸酶苯酚苯酚 +磷酸盐磷酸盐碱性碱性苯酚苯酚 +4-+4-氨基安替吡啉氨基安替吡啉 +铁氰化钾铁氰化钾红色醌式化合物红色醌式化合物AKP活性测定基本原理磷酸苯二钠法活性测定基本原理磷酸苯二钠法现在学习的是第16页，共20页单位（单位（ml）空白管空白管 标准管标准管 A B C D 各阶段稀释液各阶段稀释液酚标准液酚标准液（0.1mg/ml）Tris-醋酸镁醋酸镁复合底物液复合底物液 /0.1 0.1 0.1 0.1 /0.1 /0.1 /3 3 3 3 3 3酶活性单位酶活性单位（U/ml）=A样样 A标标0.1 稀释倍数稀释倍数37保温保温 15分钟分钟各管加入铁氰化钾液各管加入铁氰化钾液2ml，静置，静置15min510nm 比色比色酚标准液浓度酚标准液浓度稀释倍数稀释倍数(PH8.8tris醋酸镁溶液醋酸镁溶液）/25 10 5 1现在学习的是第17页，共20页蛋白含量测定基本原理蛋白含量测定基本原理BCA法法蛋白质蛋白质+Cu 2 碱性碱性BCA试剂试剂紫色化合物紫色化合物Cu二喹啉甲酸，BCA现在学习的是第18页，共20页单位（单位（ml）空白管空白管 标准管标准管 A B C D 各阶段稀释液各阶段稀释液蛋白标准液（蛋白标准液（0.2mg/ml）蒸馏水蒸馏水BCA试剂试剂 /0.1 0.1 0.1 0.1 /0.1 /0.1 /1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5蛋白含量（蛋白含量（mg/ml）=A样样 A标标0.2 稀释倍数稀释倍数37保温保温 30分钟分钟562nm 比色比色蛋白标准液浓度蛋白标准液浓度稀释倍数稀释倍数(PH8.8tris醋酸镁溶液醋酸镁溶液）/50 20 5 1现在学习的是第19页，共20页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第20页，共20页
