南方医科大学第一章4.ppt

第四节第四节 结构研究法结构研究法 结构研究的必要性结构研究的必要性 天然药物结构研究中的困难天然药物结构研究中的困难 结构事先很难作出某种程度的预测；结构事先很难作出某种程度的预测；经典的化学方法难于满足研究天然经典的化学方法难于满足研究天然 药物结构的需要；药物结构的需要；天然药物结构研究的主要手段：天然药物结构研究的主要手段：波谱学分析方法波谱学分析方法 一、化合物的纯度测定方法一、化合物的纯度测定方法 1 1、在显微镜下观察晶形、在显微镜下观察晶形 2 2、测熔点、测熔点 3 3、应用、应用TLCTLC检识检识 4 4、应用、应用HPLCHPLC检识检识二、结构研究的主要程序二、结构研究的主要程序 1 1、确定化合物结构的程序、确定化合物结构的程序 先推测被确定成分的结构类型先推测被确定成分的结构类型 然后推测取代基类型、位置和分子式然后推测取代基类型、位置和分子式 确定结构式确定结构式2 2、确定化合物结构常用的方法、确定化合物结构常用的方法 化学法化学法 波谱法（波谱法（UVUV、IRIR、NMRNMR、MSMS）和和CDCD、ORDORD、X-X-射线结晶衍射法等射线结晶衍射法等3 3、未知天然化合物结构研究程序、未知天然化合物结构研究程序 初步推断化合物的类型初步推断化合物的类型 测定分子式，计算不饱和度测定分子式，计算不饱和度 测定分子中含有的官能团，或结构片段，测定分子中含有的官能团，或结构片段，或基本骨架；或基本骨架；推断并确定分子的平面结构；推断并确定分子的平面结构；推断并确定分子的主体结构推断并确定分子的主体结构(构型与构象构型与构象)4 4、已知天然化合物的结构研究程序、已知天然化合物的结构研究程序 研究过程大为简化研究过程大为简化 无固定模式与程序无固定模式与程序5 5、结构研究中文献检索的重要性、结构研究中文献检索的重要性 贯穿于化合物结构研究的全过程贯穿于化合物结构研究的全过程 按植物拉丁学名或中药学名，利用主题索引按植物拉丁学名或中药学名，利用主题索引或通过计算机系统查阅或通过计算机系统查阅C.AC.A；检索内容包含：检索内容包含：同属同种植物的药用部位、使用溶剂名称、同属同种植物的药用部位、使用溶剂名称、提取的部位、分离的方法、单体化合物的性质、提取的部位、分离的方法、单体化合物的性质、分子式、颜色反应、光谱学数据等等。分子式、颜色反应、光谱学数据等等。三、结构研究中采用的主要方法三、结构研究中采用的主要方法（一）确定分子式的常用方法（一）确定分子式的常用方法 1.1.元素分析配合分子量测定元素分析配合分子量测定（1 1）元素分析包括定性分析与定量分析元素分析包括定性分析与定量分析例如：从刺果甘草根中分得某白色晶体，元例如：从刺果甘草根中分得某白色晶体，元素定性分析表明该白色晶体只含素定性分析表明该白色晶体只含C C、H H、O O三三元素元素,元素定量分析的结果如下元素定量分析的结果如下,C:79.35%;C:79.35%;H:10.21%H:10.21%。O O元素的含量元素的含量=(100-79.35-10.21)%=10.44%=(100-79.35-10.21)%=10.44%三种元素在分子结构中所占比例为三种元素在分子结构中所占比例为：C C：79.3512=6.61 79.3512=6.61 H:10.211=10.21 H:10.211=10.21 O:10.4416=0.65 O:10.4416=0.65 化合物分子结构中原子个数比为：化合物分子结构中原子个数比为：6.61:10.21:0.65=10.16:15.58:1 6.61:10.21:0.65=10.16:15.58:1 10 10：1616：1 1 该化合物实验式为：该化合物实验式为：C C1010HH1616O O 分子式为：分子式为：(C C1010HH1616O)O)n n n=1,2,3.n=1,2,3.(2)(2)分子量测定方法有：分子量测定方法有：冰点下降法（固体物质）冰点下降法（固体物质）沸点上升法（液体物质）沸点上升法（液体物质）黏度法黏度法 凝胶滤过法凝胶滤过法 质谱法（最常用）质谱法（最常用）例如：采用电子轰击质谱（例如：采用电子轰击质谱（EI-MSEI-MS）测得上述测得上述化合物的分子离子峰为化合物的分子离子峰为456456。那么，那么，n=456152=3n=456152=3 结合实验式结合实验式 C C1010HH1616O O 得上述化合物的分子式为：得上述化合物的分子式为：C C3030HH4848O O3 3.（C C3030HH4848OO3 3 代表刺果甘草皂苷元）代表刺果甘草皂苷元）2 2、高分辨率质谱（、高分辨率质谱（HR-MSHR-MS）法法 高分辨率质谱仪可将物质的质量精确到小数高分辨率质谱仪可将物质的质量精确到小数点后第三位。点后第三位。例如：例如：C C8 8HH1212N N4 4、C C9 9HH1212N N2 2OO、C C1010H H1212O O2 2、C C1010H H1616N N2 2 四个化合物的分子量同为四个化合物的分子量同为164164，但精，但精确质量则并不相同，在高分辨率质谱仪中很容确质量则并不相同，在高分辨率质谱仪中很容易进行区别。易进行区别。序号序号分子式分子式 精确质量精确质量 MM1 1C C8 8HH1212N N4 4 164.1063 164.1063 MM2 2C C9 9HH1212N N2 2O O 164.0950 164.0950 MM3 3C C1010HH1212OO2 2 164.0837 164.0837 MM4 4C C1010HH1616N N2 2 164.1315 164.1315 3 3、同位素丰度比法、同位素丰度比法 组组成成有有机机化化合合物物的的主主要要元元素素C C、H H、O O、N N等均由相对丰度比一定的同位素所组成。等均由相对丰度比一定的同位素所组成。大大多多数数MSMS图图中中，如如能能见见到到稳稳定定的的分分子子离离子子峰峰 MM+.+.，则则在在高高出出其其1-21-2个个质质荷荷比比处处可可见见到到 M+1M+1+与与 M+2M+2+的同位素峰。的同位素峰。对对于于一一定定的的化化合合物物，分分子子离离子子峰峰与与其其同同位位素素峰的相对强度为一确定值。峰的相对强度为一确定值。同位素同位素原子质量原子质量丰度比（丰度比（%）1 1HH1.0078251.00782599.985599.98552 2HH2.014102.014100.01450.01451212C C12.00000012.00000098.829298.82921313C C13.0033513.003351.10801.10801414N N14.0030714.0030799.63599.6351515N N15.0001115.000110.03650.0365 化合物不饱和度化合物不饱和度u u的的计算计算：一价原子（如：一价原子（如X X、HH）的数目的数目：三价原子（如：三价原子（如N N、P P）的数目的数目：四价原子（如：四价原子（如C C、S S）的数目的数目（二）确定化合物结构类型和取代基的（二）确定化合物结构类型和取代基的主要方法主要方法1 1注意观察试样在提取分离过程中的行为注意观察试样在提取分离过程中的行为 2 2测定其有关理化常数，如不同测定其有关理化常数，如不同pHpH、不同不同 溶剂中的溶解度及色谱行为、灼烧实验、溶剂中的溶解度及色谱行为、灼烧实验、化学定性反应等。化学定性反应等。3.3.结合文献调研。结合文献调研。4 4、官能团定性与定量分析、官能团定性与定量分析5 5、测定并解析化合物的有关光谱学数据、测定并解析化合物的有关光谱学数据（三）红外光谱（三）红外光谱（IRIR）1 1、红外光谱：研究分子运动的吸收光谱，反映、红外光谱：研究分子运动的吸收光谱，反映分子中原子间的振动和变角运动。分子中原子间的振动和变角运动。2 2、红外光谱所涉及的区域为中红外区，波长、红外光谱所涉及的区域为中红外区，波长在在2-252-25mm之间，频率为之间，频率为5000-4005000-400cmcm-1-1.3 3、波长与频率的关系如下：、波长与频率的关系如下：4 4、分子振动类型、分子振动类型（1 1）伸缩振动：分为对称与不对称伸缩振动）伸缩振动：分为对称与不对称伸缩振动（2 2）弯曲振动：分为面内与面外弯曲振动）弯曲振动：分为面内与面外弯曲振动5 5、红外光谱的吸收强度、红外光谱的吸收强度 基团极性越大，吸收强度就越大基团极性越大，吸收强度就越大6 6、红外光谱的分区红外光谱的分区 4000 40001500cm1500cm-1-1为特征频率区，每一为特征频率区，每一红外吸收峰都与一定的官能团相对应。红外吸收峰都与一定的官能团相对应。.例如：例如：3600-3200 3600-3200cmcm-1-1出现强的宽峰，出现强的宽峰，表示有表示有-OHOH存在；存在；2200-2100 2200-2100cmcm-1-1出现吸收峰，出现吸收峰，表示可能有表示可能有CNCN或或CCCC键存在；键存在；1850-1650 1850-1650cmcm-1-1出现强的吸收峰，且受其出现强的吸收峰，且受其他他 峰的影响小，这是峰的影响小，这是-C COO的标志；的标志；1600-1500 1600-1500cmcm-1-1出现弱的吸收峰，出现弱的吸收峰，表示有表示有-C CC-C-存在。存在。1500-600 1500-600cmcm-1-1为指纹区，为指纹区，虽然指纹区内一些吸收峰也与一定的官能团虽然指纹区内一些吸收峰也与一定的官能团对应，但大量的吸收峰并不特定官能团对应。对应，但大量的吸收峰并不特定官能团对应。结构上的细微变化都会引起指纹区吸收的结构上的细微变化都会引起指纹区吸收的变化，不同化合物的指纹吸收是不同的。变化，不同化合物的指纹吸收是不同的。7 7、红外吸收可分为四个区域、红外吸收可分为四个区域 4000-2500cm 4000-2500cm-1-1 X-H X-H伸缩振动区伸缩振动区 2500-2200cm2500-2200cm-1-1 三键伸缩振动区三键伸缩振动区 2000-1500 2000-1500cmcm-1-1 双键伸缩振动区双键伸缩振动区 羰基羰基最强峰或次强峰最强峰或次强峰 双键双键中强峰中强峰 1500-600 1500-600cmcm-1-1 C-H C-H弯曲振动信息弯曲振动信息8 8、有标准物、有标准物IRIR图可资对照查询。图可资对照查询。（四）紫外（四）紫外-可见吸收光谱（可见吸收光谱（UVUV）1 1、原理：是分子中某些价电子吸收了一定波原理：是分子中某些价电子吸收了一定波长（长（200200700700nmnm）的紫外的紫外-可见光，由低能可见光，由低能级跃迁到高能级而产生的一种光谱。级跃迁到高能级而产生的一种光谱。2 2、含有共轭双键、发色团及具有共轭体系的含有共轭双键、发色团及具有共轭体系的助色团分子在紫外助色团分子在紫外-可见光区域可产生吸收。可见光区域可产生吸收。3 3、常用于含共轭双键、常用于含共轭双键、，-不饱和羰基结不饱和羰基结构的化合物以及芳香族化合物的结构鉴定。构的化合物以及芳香族化合物的结构鉴定。（五）质谱（五）质谱 1 1、基本原理：有机化合物在高温真空中受热、基本原理：有机化合物在高温真空中受热汽化，受到汽化，受到5050100100eVeV的电子束轰击后，会失的电子束轰击后，会失去电子变成带正电荷的分子离子去电子变成带正电荷的分子离子。该分子离子该分子离子在电子流进一步轰击下，又会发生键的断裂而在电子流进一步轰击下，又会发生键的断裂而形成各种碎片离子。这些离子在电场和磁场的形成各种碎片离子。这些离子在电场和磁场的综合作用下，按照质荷比的大小顺序被记录下综合作用下，按照质荷比的大小顺序被记录下来，所形成的图谱即来，所形成的图谱即MSMS。2 2、MSMS图图 横坐标是横坐标是m/zm/z，纵坐标是离子峰的相对强度纵坐标是离子峰的相对强度.MSMS图中相对强度最大的离子峰称为基峰，图中相对强度最大的离子峰称为基峰，其强度定为其强度定为100%100%，其他离子峰的强度分别以，其他离子峰的强度分别以 它们对基峰的相对强度百分比来表示。它们对基峰的相对强度百分比来表示。离子峰的强度与对应离子的数量成正比，离子峰的强度与对应离子的数量成正比，离子的数量越多，峰的强度越大离子的数量越多，峰的强度越大。3 3、MSMS中常见的几种离子峰中常见的几种离子峰 分子离子峰分子离子峰 MM+.+.碎片离子峰碎片离子峰 同位素离子峰同位素离子峰 常出现在分子离子峰的右边常出现在分子离子峰的右边1-21-2个质量单位，个质量单位，用用M+1M+1、M+2M+2表示。表示。4 4、容易汽化的小分子，遇热不易分解的化合物容易汽化的小分子，遇热不易分解的化合物多采用多采用EI-MSEI-MS确定其分子量、求算分子式以及确定其分子量、求算分子式以及提供一些结构信息。提供一些结构信息。裂解的一般规律裂解的一般规律1 1、共价键的极化度越大，越容易发生裂解；、共价键的极化度越大，越容易发生裂解；2 2、产生的碎片离子越稳定，越利于裂解；、产生的碎片离子越稳定，越利于裂解；3 3、常见的裂解方式：、常见的裂解方式：（1 1）单纯裂解）单纯裂解只发生共价键的单纯断裂，只发生共价键的单纯断裂，产生一个碎片离子和一个中性碎片基团。产生一个碎片离子和一个中性碎片基团。例如：烯烃分子离子裂解，优先产生稳定的例如：烯烃分子离子裂解，优先产生稳定的 烯丙基型碳正离子。烯丙基型碳正离子。又又例：带有侧链的芳香环化合物，裂解后产生例：带有侧链的芳香环化合物，裂解后产生强度很大的苄基离子峰。强度很大的苄基离子峰。再例：含有杂原子的分子容易发生再例：含有杂原子的分子容易发生-裂解或裂解或-裂解。裂解。（2）重排裂解）重排裂解 在共价键断裂过程中伴随有在共价键断裂过程中伴随有原子或基团的迁移重排。原子或基团的迁移重排。例如：最常见的麦氏重排裂解。凡是具有例如：最常见的麦氏重排裂解。凡是具有-H的醛、酮、链烯、酰胺、酯、腈、芳香环化合的醛、酮、链烯、酰胺、酯、腈、芳香环化合物均可发生麦氏重排裂解物均可发生麦氏重排裂解5 5、场解析质谱、场解析质谱(FD-MS)FD-MS)简介简介（fieldfield desorption desorption ionization ionization）该法中样品无须加热汽化，直接在该法中样品无须加热汽化，直接在1010kVkV高高电压下发生电离，特别适合于对热不稳定、极电压下发生电离，特别适合于对热不稳定、极性大、难挥发化合物的性大、难挥发化合物的MSMS测定。测定。本法灵敏度高达本法灵敏度高达1010-11-11g g，谱图也较单纯。谱图也较单纯。糖苷、氨基酸、肽类、核酸及抗生素等在糖苷、氨基酸、肽类、核酸及抗生素等在FD-MSFD-MS谱中均显示一系列明显的吸收峰谱中均显示一系列明显的吸收峰:M+HM+H+（M+1M+1）、）、M+NaM+Na+（M+23M+23）、）、M+KM+K+（M+39M+39）峰，并随发射丝电流强度峰，并随发射丝电流强度的降低，碎片离子峰越来越少。的降低，碎片离子峰越来越少。糖苷糖苷FD-MSFD-MS谱中可见到由谱中可见到由 M+HM+H+或或 M+NaM+Na+依次脱去糖的碎片。依次脱去糖的碎片。肽类肽类FD-MSFD-MS谱中可见到由谱中可见到由 M+HM+H+或或 M+NaM+Na+依次脱去氨基酸的碎片。依次脱去氨基酸的碎片。6 6、快速原子轰击质谱、快速原子轰击质谱FAB-MSFAB-MS简介简介 (fast atom bombardment)fast atom bombardment)该法中因高速中性粒子撞击试样后使之电该法中因高速中性粒子撞击试样后使之电离，得到分子离子及其进一步裂解的碎片。离，得到分子离子及其进一步裂解的碎片。碎片类型基本与碎片类型基本与FD-MSFD-MS相同。相同。FAB-MSFAB-MS图谱中既包含阳离子质谱，也包图谱中既包含阳离子质谱，也包含阴离子质谱，信息来源广阔，可弥补含阴离子质谱，信息来源广阔，可弥补FD-FD-MSMS的不足。的不足。p41p41表表1-121-12说明说明 FD-MSFD-MS在在高高质质量量区区（分分子子量量与与糖糖的的碎碎片离子）提供的信息比较详尽；片离子）提供的信息比较详尽；FAB-MSFAB-MS不不仅仅提提供供高高质质量量区区的的信信息息（分分子子量量与与糖糖的的碎碎片片离离子子信信息息），还还能能给给出出低低质质量区苷元的结构碎片信息。量区苷元的结构碎片信息。