生化工艺——第四章沉淀.ppt

第四章第四章 沉淀技术沉淀技术第一节第一节 蛋白质沉淀的基本原理蛋白质沉淀的基本原理第二节第二节 蛋白质沉淀技术实施蛋白质沉淀技术实施学习目标学习目标n了解蛋白质的基本性质；了解蛋白质的基本性质；n掌握蛋白质沉淀的基本原理；掌握蛋白质沉淀的基本原理；n掌握沉淀技术的基本方法；掌握沉淀技术的基本方法；n能够正确进行蛋白质的沉淀分离操作，并能分能够正确进行蛋白质的沉淀分离操作，并能分析影响沉淀的有关因素。析影响沉淀的有关因素。沉淀的定义沉淀的定义 沉淀技术沉淀技术是通过加入试剂或改变是通过加入试剂或改变条件，使溶液中的溶质离开溶液生条件，使溶液中的溶质离开溶液生成不溶性颗粒而沉降析出的技术。成不溶性颗粒而沉降析出的技术。沉淀技术的特点及适用范围沉淀技术的特点及适用范围优点优点：操作简便、生产所需的原材料易得、成本低：操作简便、生产所需的原材料易得、成本低廉，在产物浓度越高的溶液中收率越高，既可以用于廉，在产物浓度越高的溶液中收率越高，既可以用于实验室，也可以进行工业规模化生产。实验室，也可以进行工业规模化生产。缺点：缺点：产品质量较低，一般情况需要精制，过滤比产品质量较低，一般情况需要精制，过滤比较困难。较困难。沉淀分离目前广泛应用于沉淀分离目前广泛应用于蛋白质等生物产物蛋白质等生物产物的分离。的分离。过程。过程。第一节第一节 蛋白质沉淀的基本原理蛋白质沉淀的基本原理蛋白质表面特性蛋白质组成蛋白质表面特性蛋白质组成蛋白质组成蛋白质组成蛋白质折叠趋势蛋白质折叠趋势结果结果 在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基暴露于表面，在蛋白质表面形成氨基酸残基暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区一定的疏水区 影响蛋白质溶解度的主要因素影响蛋白质溶解度的主要因素蛋白质性质的因素蛋白质性质的因素溶液性质的因素溶液性质的因素二、蛋白质胶体溶液的稳定性二、蛋白质胶体溶液的稳定性胶体的定义胶体的定义n胶体是一种尺寸在1100 nm以至1000 nm的分散体。它既非大块固体，又不是分子分散的液体，而是具有两相的微不均匀分散体系。-被遗忘了尺寸的世界Wilhelm Friedrich Ostwald(1853 1932)胶体的性质胶体的性质n布朗运动布朗运动n丁达尔现象丁达尔现象n电泳现象电泳现象n粘度大粘度大n不能透过半透膜的性质等。不能透过半透膜的性质等。蛋白质表面特性蛋白质性质蛋白质表面特性蛋白质性质n蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 n蛋白质的两性电离和等电点蛋白质的两性电离和等电点 n蛋白质的变性蛋白质的变性 蛋白质表面特性蛋白质表面特性沉淀屏障沉淀屏障n蛋白质分子周围的水化层蛋白质分子周围的水化层n分子间的静电排斥作用分子间的静电排斥作用-双电层双电层 蛋白质表面特性蛋白质表面特性沉淀策略及方法沉淀策略及方法n策略策略 破坏蛋白质四周水化层破坏蛋白质四周水化层 降低双电层厚度降低双电层厚度 n沉淀方法沉淀方法 改变溶液改变溶液pH值值 加入无机盐或改变无机盐种类加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂添加脱水剂 蛋白质表面特性蛋白质表面特性常用的沉淀技术常用的沉淀技术n盐析沉淀盐析沉淀n有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀n选择性变性沉淀选择性变性沉淀n等电点沉淀等电点沉淀n聚合物沉淀聚合物沉淀n聚电解质沉淀聚电解质沉淀 n金属离子沉淀金属离子沉淀第二节蛋白质沉淀技术的实施第二节蛋白质沉淀技术的实施一、盐析沉淀一、盐析沉淀n定义定义 蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析（发生沉淀的现象称为盐析（Salting-out）n溶解度与溶解度与I I的关系的关系Cohn经验经验方程方程 盐析沉淀盐析沉淀-盐析原理盐析原理n n当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现两种当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现两种情况：情况：（1 1）“盐溶盐溶”现象现象低盐浓度下，蛋白质溶解低盐浓度下，蛋白质溶解度增大度增大 原因原因?（2 2）“盐析盐析”现象现象高盐浓度下，蛋白质溶解高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降度随之下降 原因原因?盐析沉淀盐析沉淀-盐析原理图示盐析原理图示盐析沉淀的影响因素盐析沉淀的影响因素1 1、无机盐的种类和浓度、无机盐的种类和浓度无机盐种类无机盐种类影响到影响到CohnCohn方程中的盐析常数方程中的盐析常数 无机盐的选择无机盐的选择结论：结论：a a 不同种类的盐主要影响盐析常数不同种类的盐主要影响盐析常数KsKs；b b 离离子子半半径径小小，带带电电多多，电电荷荷密密度度高高，盐盐析析效效果果好。好。最常用最常用(NHNH4 4)2 2SOSO4 4优点：溶解度（优点：溶解度（767767g/Lg/L）符合上述要求；符合上述要求；缺点：水解后溶液缺点：水解后溶液pHpH降低，在高降低，在高 pHpH下产氨，下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。次常用次常用NaNa2 2SOSO4 4。缺点：在缺点：在40400 0C C以下溶解度较以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。低，主要用于热稳定蛋白。还有还有NaClNaCl。无机盐的选择无机盐的选择盐析沉淀的影响因素盐析沉淀的影响因素2 2、蛋白质的浓度、蛋白质的浓度 高浓度的蛋白质用低的饱和度即可将其沉淀，但高浓度的蛋白质用低的饱和度即可将其沉淀，但若浓度过高，则易共沉淀作用，除杂效果会明显下降。若浓度过高，则易共沉淀作用，除杂效果会明显下降。低浓度的蛋白质，要使用大的硫酸铵饱和度，但低浓度的蛋白质，要使用大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低.通常认为比较适中的蛋白质浓度是通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.52.53.03.0，相当于相当于25 25 mg/mg/mLmL30mg/30mg/mLmL。盐析沉淀的影响因素盐析沉淀的影响因素3、溶液pHpH影响Cohnx方程中的值。见图pH值值接近蛋白质接近蛋白质pI值时，蛋白质溶解度最小。值时，蛋白质溶解度最小。盐析沉淀的影响因素盐析沉淀的影响因素4、温度 在在低离子强度低离子强度溶液中，溶液中，蛋白质的溶解度在一定的温蛋白质的溶解度在一定的温度范围内随着度范围内随着温度升高而增温度升高而增大大 在在高离子强度高离子强度溶液中，溶液中，温度的升高温度的升高利于蛋白质脱水，利于蛋白质脱水，破坏水化层破坏水化层,导致蛋白质导致蛋白质溶溶解度的降低解度的降低 低温（低温（0-4 0-4）避免失活）避免失活n n饱和度（饱和度（SaturationSaturation）的概念：的概念：以硫酸铵为例：以硫酸铵为例：25250 0C C时，硫酸铵的饱和溶解度是时，硫酸铵的饱和溶解度是767767g/Lg/L定义为定义为100%100%饱和度饱和度其它数据见附录其它数据见附录盐析操作(以硫酸铵为例)目的：目的：确定沉淀目确定沉淀目标蛋白蛋白质所需硫酸所需硫酸铵饱和度（和度（设操作温度操作温度为0）：）：盐析操作盐析操作-溶解度曲线确定溶解度曲线确定各级均离各级均离心分离沉心分离沉淀物，将淀物，将沉淀溶于沉淀溶于2 2倍体积倍体积的缓冲液的缓冲液中，测定中，测定其中总蛋其中总蛋白和目标白和目标蛋白浓度；蛋白浓度；以饱和度以饱和度为横坐标，为横坐标，上清液中上清液中总蛋白和总蛋白和目标蛋白目标蛋白浓度为纵浓度为纵坐标，得坐标，得到蛋白质到蛋白质溶解度曲溶解度曲线线 取料液分成等体积几份，冷却至取料液分成等体积几份，冷却至00方法二见方法二见p63二、有机溶剂沉淀二、有机溶剂沉淀1 1、原理、原理向蛋白质溶液中加入向蛋白质溶液中加入水溶性水溶性有机溶剂：有机溶剂：水的介电常数降低水的介电常数降低有机溶剂对水具有很大的亲和力，能够争夺蛋白质表有机溶剂对水具有很大的亲和力，能够争夺蛋白质表面的水分子。面的水分子。结果：结果：随有机溶剂浓度增大，溶液的介电常数下降，蛋白质随有机溶剂浓度增大，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而发生凝聚和沉淀分子间的静电引力增大，从而发生凝聚和沉淀 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀-原理图示原理图示2 2、特点、特点n优点优点分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀有机溶剂密度较低，易于沉淀分离有机溶剂密度较低，易于沉淀分离与盐析沉淀相比，沉淀产物不需脱盐与盐析沉淀相比，沉淀产物不需脱盐 n缺点缺点易引起蛋白质变性失活，操作需在低温下进行易引起蛋白质变性失活，操作需在低温下进行试剂易燃，有毒。试剂易燃，有毒。耗用大量溶剂，而溶剂来源、贮存都比较困难麻烦；耗用大量溶剂，而溶剂来源、贮存都比较困难麻烦；有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。是乙醇。u乙醇乙醇u丙酮丙酮3 3、有机溶剂的选择、有机溶剂的选择uu温度温度温度温度uu样品浓度样品浓度样品浓度样品浓度uu溶液溶液溶液溶液pHpHpHpH值值值值uu离子强度离子强度离子强度离子强度:离子强度低有利，离子强度低有利，离子强度低有利，离子强度低有利，0.010.050.010.050.010.050.010.05mol/Lmol/Lmol/Lmol/Luu金属离子的助沉析作用：金属离子的助沉析作用：金属离子的助沉析作用：金属离子的助沉析作用：ZnZnZnZn2+2+2+2+、CaCaCaCa2+2+2+2+4 4、影响因素、影响因素三、选择性变性沉淀三、选择性变性沉淀n n利用蛋白质、酶、核酸等生物大分子对某种物利用蛋白质、酶、核酸等生物大分子对某种物理或化学因素的敏感性差异，实现分离。理或化学因素的敏感性差异，实现分离。n n选择性热变性（使用时需慎重！）选择性热变性（使用时需慎重！）n n加入表面活性剂加入表面活性剂n n选择性酸碱变性选择性酸碱变性热变性沉淀（Thermal precipitation)n定义：利用在较高温度下，热稳定性差的蛋白定义：利用在较高温度下，热稳定性差的蛋白质发生变性沉淀的现象，分离纯化热稳定性高质发生变性沉淀的现象，分离纯化热稳定性高的目标蛋白的方法。的目标蛋白的方法。n操作条件：操作条件：n调节调节pH；n加入有机溶剂。加入有机溶剂。n特点：特点：n是一种变性分离法，带有冒险性，需对目标蛋白和是一种变性分离法，带有冒险性，需对目标蛋白和共存杂蛋白的热稳定性有充分了解。共存杂蛋白的热稳定性有充分了解。加入离子型表面活性剂n n十六烷基三甲基季铵盐的溴化物（十六烷基三甲基季铵盐的溴化物（CTABCTAB）主要用于沉淀主要用于沉淀酸性多糖酸性多糖n n十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDSSDS）主要用于沉淀主要用于沉淀膜蛋白膜蛋白和和核蛋白核蛋白选择性酸碱变性 利用蛋白质和酶等在不同pH值条件下的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀，通常是在分离纯化流程中附带进行的一个分离纯化步骤。四、等电点沉淀四、等电点沉淀1 1、定义、定义 利用蛋白质在利用蛋白质在pH值等于其等电点的溶液中值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法等电点沉淀法 uu原理：原理：蛋白质是两性电解质，当溶液蛋白质是两性电解质，当溶液pHpH值处于等电值处于等电点时，分子表面净电荷为点时，分子表面净电荷为0 0，双电层和水化膜结构，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。而产生沉淀。2 2、等电点沉淀、等电点沉淀-沉淀条件沉淀条件n较低的溶液离子强度较低的溶液离子强度 n溶液的溶液的pH值接近等电点值接近等电点 3 3、等电点沉淀、等电点沉淀-操作特点操作特点n无需脱盐无需脱盐 n结合使用结合使用n调节方便调节方便五、五、有机（非离子型）聚合物沉淀法有机（非离子型）聚合物沉淀法 某某些些聚聚合合物物，如如聚聚乙乙二二醇醇（PEGPEG）、聚聚乙乙烯烯吡吡咯咯烷烷酮酮（PVPPVP）和和葡葡聚聚糖糖等等，具具有有沉沉淀淀蛋蛋白白质质的的作作用用。其其中中最最常常用用的的是是PEGPEG，相相对对分分子子质质量量从从200200D D到到2020KDKD的的不不同同聚聚合合程程度度的的产产品品都都是是有有效效的的，通通常常在在蛋蛋白白质质沉淀中使用沉淀中使用PEG-6000PEG-6000或或PEG-4000PEG-4000。特点优点：优点：A、体系的温度只需控制在室温条件下；B、沉淀的颗粒往往比较大，产物比较容易收集；C、PEG非但不会使pro变性,而且可以提高它的稳定性；D、PEG无毒，优先使用在临床产品的加工过程中被。缺点：缺点：A、PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去为此需用超滤和液-液萃取来解决；B、价格较昂贵。六、聚电解质沉淀n聚电解质n沉淀机理：与絮凝类似，在蛋白质间起架桥作用，同时还兼有盐析作用。n应用：主要用于酶和食品蛋白的回收，常用的聚电解质有酸性多糖和羧甲基纤维素等。七、高价金属离子沉淀n沉淀机理：可与蛋白质分子上的某些残基发生作用而使蛋白质沉淀。如Ca2+和Mg2+能与羧基结合，Mn2+和Zn2+能与羧基、含氮化合物以及杂环化合物结合。n优点：可使浓度很低的蛋白质沉淀；沉淀后金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除去。沉淀工艺及操作沉淀工艺及操作以盐析为例：（1 1）硫酸铵使用前的预处理：）硫酸铵使用前的预处理：将硫酸铵配成浓溶液，然后通入H2S气体至饱和。放置过夜后用滤纸滤除重金属沉淀物，滤液在瓷蒸发皿中浓缩结晶，再在100下干燥即可使用。（2）硫酸铵饱和度的调整：）硫酸铵饱和度的调整：当盐析要求饱和度高而又不宜增大溶液的体积时，可直接加入硫酸铵的固体盐，不同的饱和度应加入的硫酸铵用量可查附录一或二。当盐析要求的饱和度不高，又必须防止局部浓度过高时，通常是采用加入饱和硫酸铵溶液法。（3）盐析操作：）盐析操作：计算好硫酸铵用量后，可对含蛋白的溶液进行盐析操作。一般是在搅拌的条件下，缓慢将所需的硫酸铵溶液或固体盐加入至待沉淀的溶液中。（4）后处理操作：）后处理操作：蛋白质经过盐析沉淀分离后，产品中夹带有盐分，需脱盐处理。比如食品工业用酶的法规，食品酶制剂中不允许混有多量的食盐以外的无机盐类。因此盐析得到的产品需通过脱盐方能获得较纯的产品。常用的脱盐处理方法有：透析法、电渗析法和葡聚糖凝胶过滤法。