第二章基因工程制药-1.ppt
Biotechnological Pharmaceutics基因工程制药基因工程制药Gene Engineering for Pharmaceutics（一）（一）基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics目的要求 n1 1、掌握基因工程技术的概念及基因工程制药的基本过程。、掌握基因工程技术的概念及基因工程制药的基本过程。n2 2、理解目的基因的获得方法，基因表达体系及不同表达、理解目的基因的获得方法，基因表达体系及不同表达体系的特点及高效表达的措施。体系的特点及高效表达的措施。n3 3、掌握质粒不稳定产生的原因及提高质粒稳定性的方法。掌握质粒不稳定产生的原因及提高质粒稳定性的方法。n4 4、掌握基因工程药物的分离纯化。、掌握基因工程药物的分离纯化。n5 5、了解基因工程药物的质量控制。、了解基因工程药物的质量控制。基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics学习内容n1、基因工程制药概述n2、基因工程制药的基本过程n3、目的基因的获得基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics知识回顾n1、基因？基因？n2 2、基因的一般特性？、基因的一般特性？基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics第一节 基因工程制药概述n基因工程技术：基因工程技术：是通过对Nucleic acid 分子的Insert,Assemble and Recombinant而实现遗传物质（germ plasmid）的重新组合，再借助Virus,bacterium,Plasmid or other Vectors,将Target gene转移到新的 Host Cell System,并使Target Gene在新的Host cell system 进行Replication and Expression的技术。基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceuticsn基因工程主要研究任务：基因工程主要研究任务：Gene isolation,synthesis,Incision,Recombinant,transformation and expression.Gene Manipulation/Gene cloning/DNA recombination 基因工程技术最成功的成就：用于新型生物技术药物的研制基因工程的四大要素？基基因因工工程程制制药药Biotechnological PharmaceuticsnQuestion:为什么将基因工程技术引入制药领域？传统制药存在的问题：传统制药存在的问题：A、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用；B、从动物脏器中提取出来，也因造价太高，或因来源困难而供不应求；C、由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制。基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceuticsn基因工程技术就是能够十分方便、有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceuticsn基因工程技术的应用特点基因工程技术的应用特点：n A、为癌种、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病的预防、治疗和诊断提供新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂。n B、基因工程技术的最大好处在于它能从极端复杂的机体细胞内取出所需要的基因，将其在体外进行剪切拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的蛋白质。基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceuticsna.可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为临床使用提供有效的保障；nb.可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；基因工程技术生产药品的优点基因工程技术生产药品的优点基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceuticsnc.利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；nd.内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；ne.利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。基因工程技术生产药品的优点基因工程技术生产药品的优点基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics第二节第二节 基因工程药物生产过程基因工程药物生产过程n基因工程药物的生产分为n上游阶段 主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。n下游阶段 从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics 制制备备基基因因工工程程药药物物的的一一般般程程序序Get Target GeneConstruction Recombinant PlasmidConstruction Gene Engineering BacteriumCulture Engineering BacteriumSeparate and Purify the Products Filtration Bacteria Free IdentificationSemi-manufactured Goods Identification Finished Products Make up or Packaging基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceuticsn1、基因克隆载体:质粒载体，n2、重组DNA技术的有关工具酶及其应用n3、核酸制备技术：制备纯净、高质量的 载体DNA和待克隆的核酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、连接等分子克隆操作。基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics主要包括:n工程菌大规模发酵最佳参数的确立n新型生物反应器的研制n高效分离介质及装置的开发n分离纯化的优化控制n高纯度产品的制备技术n生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造n计算机的优化控制等。基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics基因工程药物制造的主要步骤目的基因的克隆目的基因的克隆构建构建DNADNA重组体重组体构建工程菌构建工程菌外源基因表达产物的分离纯化外源基因表达产物的分离纯化目的基因的表达目的基因的表达产品的检验产品的检验基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics第三节 目的基因的获得目的基因的获取途径：目的基因的获取途径：一、逆转录法二、反转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）三、化学合成法四、筛选基因五、改造基因为什么不能直接真核基因用于基因表达？基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics 逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA 克隆表达。1、mRNA purificationn细胞内含有三种RNA，mRNA占RNA总量的2%-5%，相对分子量大小不一致，分离困难。但是mRNA的3末端常含有一poly A组成的末端，长达20-250个腺苷酸，足以吸附于Oligo-纤维素上，从而可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离出来，可得到纯度较高的mRNA。逆 转 录 法基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics逆 转 录 法TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT AAAAA AAAAAOligo(dT)纤维素纤维素Poly(A)-Oligo(dT)100mM NaCl洗脱rRNA/tRNA10mM Tris1mM EDTAPoly(A)mRNATotal RNA纤维素柱纯化纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图流程图基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceuticsn2、cDNA第一链的合成：寡聚脱氧胸苷酸为引物，逆转录酶催化，合成互补DNA。n3、cDNA第二链的合成：除去mRNA，cDNA第一链为模板。n4、cDNA cloning：expression vector pUC n5、将重组体导入host celln6、cDNA library identification n7、目的cDNA 克隆的分离和鉴定 （限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的 转录方向、转录起始点等。）逆 转 录 法基基因因工工程程制制药药Biotechnological PharmaceuticsnPolymerase chain reaction 的要求是，对基因片段两侧的序列了解清楚。通过针对这两个已知区域的DNA引物，在Taq酶催化下，进行2n指数递增方式的扩增，获得大量的DNA片段。变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5CRT-PCR基基因因工工程程制制药药Biotechnological PharmaceuticsRT-PCR基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 基本工作原理RT-PCR基基因因工工程程制制药药Biotechnological PharmaceuticsCycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。RT-PCR基基因因工工程程制制药药Biotechnological PharmaceuticsRT-PCR基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceuticsn较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。n化学合成法有个先决条件是化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。化学合成法化学合成法基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceuticsn方法方法：n合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。化学合成法化学合成法基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics各代表什么氨基酸？化学合成法化学合成法基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics人工化学合成基因的限制：n a.不能合成太长的基因。最长50-60bp.只适用于克隆小分子肽的基因。n b.人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难，如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全一致，易造成中性突变。n c.费用太高。化学合成法化学合成法基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics小结n基因工程制药概述n基因工程药物生产过程n目的基因的获得基基因因工工程程制制药药Biotechnological Pharmaceutics思考题n1.基因工程技术的概念n2.为什么将基因工程技术引入制药领域？n3.应用基因工程技术生产药物有何优点？n4.基因工程药物制造的基本过程。n5.目的基因的获得有哪些方法？n6.能否直接分离克隆真核基因用于基因药物生产？基基因因工工程程制制药药
