第二章 菌种的来源(2006).ppt

发酵工程发酵工程精品课程精品课程http:/ 第二章：菌种的来源q 微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求q 一些工业化产品生产菌种的特点一些工业化产品生产菌种的特点q 自然界中有目的微生物分离的原则自然界中有目的微生物分离的原则q 菌种选育、分子育种菌种选育、分子育种菌种的来源菌种的来源http:/ 微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求一、微生物的特性一、微生物的特性q 有些微生物能在厌氧的条件下生长q 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身的生长q 有些微生物能进行复杂的代谢q 有些微生物能利用较复杂的化合物q 有些微生物能在极端的环境下生长菌种的来源菌种的来源v微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求http:/ 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物产物l 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强可操作性要强l 遗传性能要相对稳定遗传性能要相对稳定l 不易感染它种微生物或噬菌体不易感染它种微生物或噬菌体l 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）菌无关）l 生产特性要符合工艺要求生产特性要符合工艺要求菌种的来源菌种的来源v微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求http:/ 已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍菌种的来源菌种的来源v已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍http:/ HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶菌种的来源菌种的来源v已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍http:/ 和地衣牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌菌种的来源菌种的来源v已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍http:/ 沙门氏菌沙门氏菌q 生长迅速、蛋白产量高生长迅速、蛋白产量高;q 表达蛋白的纯化、分离及分析快速；表达蛋白的纯化、分离及分析快速；q 外源基因的导入相对容易；外源基因的导入相对容易；q 已建立了整套表达理论及技术已建立了整套表达理论及技术.菌种的来源菌种的来源v已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍http:/ 酵母酵母(既是微生物又是真核细胞既是微生物又是真核细胞)l 生长迅速，营养要求不高，易培养；生长迅速，营养要求不高，易培养；l 安全性好；安全性好；l 比哺乳动物细胞操作简单；比哺乳动物细胞操作简单；l 具有一定的修饰蛋白的能力。具有一定的修饰蛋白的能力。菌种的来源菌种的来源v已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍http:/ 中国仓鼠卵巢细胞（中国仓鼠卵巢细胞（CHOCHO细胞细胞）表达系统表达系统q 具有准确的转录后修饰功能；具有准确的转录后修饰功能；q 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；q 具有重组基因的高效扩增和表达能力；具有重组基因的高效扩增和表达能力；q 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；q CHO很少分泌自身的内源蛋白。很少分泌自身的内源蛋白。菌种的来源菌种的来源v已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍http:/ lillylilly),),花了花了1010年的年的时间从时间从4040万株万株微微生物中生物中，发现了三种有潜力的新抗生素发现了三种有潜力的新抗生素。例：菌种的来源菌种的来源v已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍http:/ 自然界中有目的微生物分离的原则一、菌种分离的一般过程土样的采取土样的采取 预处理预处理 培养培养 菌落的选择菌落的选择 产品的鉴定产品的鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现如何在后续的操作中使这种可能性实现目的目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物高效地获取一株高产目的产物的微生物问题问题：菌种的来源菌种的来源v自然界中有目的微生物分离的原则自然界中有目的微生物分离的原则http:/ 气候、水分、空气气候、水分、空气l 来源要广来源要广l 结合产品的特点结合产品的特点l 标签：地点、时间、气候等标签：地点、时间、气候等菌种的来源菌种的来源v自然界中有目的微生物分离的原则自然界中有目的微生物分离的原则http:/ 定向培养定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。条件，进行培养。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让让目的微生物在种群中占优势，使筛选变目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。得可能。l 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，类学中考虑，l 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法时只能通过随机分离的办法菌种的来源菌种的来源v自然界中有目的微生物分离的原则自然界中有目的微生物分离的原则http:/ 1、底物、底物2 2、pHpH条件条件3 3、培养时间、培养时间4 4、培养温度培养温度等等一切能提高目的微生物相对生长速一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优连续）后使目的微生物在种群中占优势。势。菌种的来源菌种的来源v自然界中有目的微生物分离的原则自然界中有目的微生物分离的原则http:/ 从产物角度出发从产物角度出发在在培养时以产物的形成有目的的设计培养基培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35）q 从形态的角度从形态的角度 菌菌落落的的外外观观形形态态，是是微微生生物物的的一一个个重重要要表表征征。如如多多糖糖产产生生菌菌在在适适当当的的培培养养基基上上生生长长，从从具具有有粘粘液液性性的的菌菌落落外外观观上就可以初步识别。上就可以初步识别。菌种的来源菌种的来源v自然界中有目的微生物分离的原则自然界中有目的微生物分离的原则http:/ -Journal of biotechnology 94(2002),65-72培养基中含培养基中含0.05%of Z-PAOx 每隔每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，不断分析样品，2-3个月后个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落降低后，稀释分离条菌落菌种的来源菌种的来源v自然界中有目的微生物分离的原则自然界中有目的微生物分离的原则http:/ 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同同 源性分析，基因序列分析及源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等杂交技术等q 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的微生物的 多样性及资源的开发多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。仍然是今后若干年的研究重点。2002,陈文新（科学院院士）陈文新（科学院院士）q In contrast to this traditional approach,modern molecular biology techniques allow for DNA library expression screening,which also enables access to enzymes of nonculturable organisms.By this strategy,for instance,the company Diversa(San Diego,CA,USA)identised 120 unique esterases/lipases from only 16%of the total DNA obtained from an alkaline soil sample.FEMS Microbiology Reviews 26(2002)7381菌种的来源菌种的来源v自然界中有目的微生物分离的原则自然界中有目的微生物分离的原则http:/ 菌株选育、分子改造目的l 提高生产能力提高生产能力l 提高产品质量提高产品质量l 开发新产品开发新产品l 解决生产实际问题解决生产实际问题l 防止菌种退化防止菌种退化菌种的来源菌种的来源v菌株选育、分子改造菌株选育、分子改造http:/ Shuffling等等菌种的来源菌种的来源v菌株选育、分子改造菌株选育、分子改造http:/ 化学诱变剂使用过程的安全性化学诱变剂使用过程的安全性诱变剂量的选择诱变剂量的选择诱变剂的选择诱变剂的选择出发菌株的选择出发菌株的选择（一）、诱变剂的作用原理（略）（一）、诱变剂的作用原理（略）压压硝酸：硝酸：0.07MNa0.07MNa2 2HPOHPO4 4亚亚硝基胍硝基胍：1MNaOH1MNaOH菌种的来源菌种的来源v菌株选育、分子改造菌株选育、分子改造http:/ 随机筛选随机筛选q 形态形态q 理性化筛选理性化筛选从从产产物物形形成成的的生生理理生生化化途途径径着着手手，进进行行有有的的放放矢矢的的筛筛选选。如如结结构构类类似似物物抗抗性性、营营养养缺缺陷陷型型等等，筛筛选选而而产产生生的的这这些特性，称为遗传标记。些特性，称为遗传标记。结结构构类类似似物物：在在化化学学和和空空间间结结构构上上和和代代谢谢的的中中间间物物（终终产产物物）相相似似，因因而而在在代代谢谢调调节节方方面面可可以以代代替替代代谢谢中中间间物物（终终产产物物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。菌种的来源菌种的来源v菌株选育、分子改造菌株选育、分子改造http:/ HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶结构类似物抗性结构类似物抗性：Lys的的类似物类似物AEC,Thr的的类似物类似物AHV营养缺陷型营养缺陷型：如如Thr缺陷型缺陷型菌种的来源菌种的来源v菌株选育、分子改造菌株选育、分子改造http:/ Bervibacterium flavum As 1.495 (leu-)lys.HCl 2.1 g/lF6-16 (leu-,Thr-)20.8 g/lF9-50(leu-,Thr-,AEC r)33.5 g/l菌种的来源菌种的来源v菌株选育、分子改造菌株选育、分子改造http:/ evolution)q 突变 基因突变库的建立基因突变库的建立q 筛选 基因突变库的筛选基因突变库的筛选q 基因复制与遗传步骤：在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。菌种的来源菌种的来源v菌株选育、分子改造菌株选育、分子改造http:/ pHl 温度温度l 有机溶剂有机溶剂生理环境生理环境工业催化环境工业催化环境l 底底物物专一性专一性菌种的来源菌种的来源v菌株选育、分子改造菌株选育、分子改造http:/ 31 57 75 81 905 5次次错位错位PCR 2PCR 2次次定点突变定点突变ReetzReetz(1997)Liebeton(2000)(1997)Liebeton(2000)第二章第二章 菌种的来源菌种的来源菌种的来源菌种的来源v菌株选育、分子改造菌株选育、分子改造http:/ Shuffling:DNA Shuffling:指指DNADNA分子的体外重排，是基因在分子的体外重排，是基因在分子水平上进行有性重组分子水平上进行有性重组(Sexual Recombination)(Sexual Recombination)。菌种的来源菌种的来源v菌株选育、分子改造菌株选育、分子改造http:/ XXX X XX X XX X XXX X XX XX XXX XX X X XX X XXX XX XXX XX X X XX X XXX X XX X XX XXX XXX X X X X X XX X Fragment Reassemble Select bestwith DNAseI fragments recombinantsRepeat for multiple cyclesDNA shuffling菌种的来源菌种的来源v菌株选育、分子改造菌株选育、分子改造http:/ ShufflingDNA Shuffling与常规定向进化的比较与常规定向进化的比较http:/ 型型示示 例例特特 性性活性增加倍数活性增加倍数潜在应用领域潜在应用领域抗抗 体体人源抗体人源抗体亲和性亲和性400生物制药生物制药酶酶天冬氨酸转氨酶天冬氨酸转氨酶催化特异性催化特异性10，000生物制药生物制药-内酰胺酶内酰胺酶抗生素抗性抗生素抗性32，000抗生素抗生素枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶E耐热性耐热性65耐热时间耐热时间17200工业酶工业酶细胞因细胞因子子人类干扰素人类干扰素抗病毒抗病毒285，000基因治疗基因治疗肿瘤抑制因子肿瘤抑制因子P5337半衰期半衰期12基因治疗基因治疗代谢途代谢途径径砷酸盐代谢途径砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒砷酸盐解毒40生物制药生物制药汞代谢途径汞代谢途径汞解毒汞解毒12生物制药生物制药部分DNA Shuffling技术的研究成果菌种的来源菌种的来源v菌株选育、分子改造菌株选育、分子改造http:/ 涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有 特定的特定的微生物微生物(动、植物动、植物)才具有大量表达的潜力；才具有大量表达的潜力；l 传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是 自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证；自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证；l 目前土壤中已分离的微生物不到总数的目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%1%，微生微生 物的多样性仍然是以后若干年的研究重点物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；l 基因重组基因重组、直接进化技术的应用直接进化技术的应用，大大加快了生大大加快了生 物产品开发的进程物产品开发的进程。菌种的来源菌种的来源v小节小节http:/