1-1实验1-1微生物培养基的配制和灭菌.ppt
实验实验 1-11-1（主要自学）（主要自学）微生物培养基的配制和灭菌微生物培养基的配制和灭菌一、实验目的一、实验目的n了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。程。n掌握加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。掌握加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。微生物培养基的配制和灭菌微生物培养基的配制和灭菌二、实二、实 验验 原原 理理1 1、培养基：、培养基：是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。产生代谢产物用的混合营养料。2 2、培养基营养成分：、培养基营养成分：碳源、氮源、无机盐、生长素以及碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分水分等。等。营养物质的营养物质的浓度浓度要适宜要适宜营养物质之间的营养物质之间的配比配比要适宜要适宜培养基的培养基的pH值、渗透压值、渗透压、水活度水活度和和氧化还原电势氧化还原电势等等物理化学条件要适宜。物理化学条件要适宜。3 3、培养基的种类、培养基的种类 （1 1）培养基按培养基按成分成分可分为：可分为：天天然培养基、合成然培养基、合成培养基和半合成培养基。培养基和半合成培养基。（2 2）按按用途用途可分为：可分为：基础培养基、营养培养基、基础培养基、营养培养基、鉴别培养基和选择培养基鉴别培养基和选择培养基等等。（3 3）按物理按物理状态状态可分为可分为“固体固体培养基、培养基、半固体半固体培养基和培养基和液体液体培养基培养基 。二、实二、实 验验 原原 理理按照培养基的物理状态可分为按照培养基的物理状态可分为 n1.1.液体液体培养基：培养基：不加凝固剂不加凝固剂的液体状态培养基。的液体状态培养基。n2.2.固体固体培养基：在液体培养基中加入培养基：在液体培养基中加入2%2%左右的凝固剂左右的凝固剂的的固体状态的培养基。固体状态的培养基。n3.3.半固体半固体培养基：在液体培养基中加入培养基：在液体培养基中加入0.20.20.5%0.5%凝固凝固剂剂而成的半固体状培养基。而成的半固体状培养基。3 3、培养基的种类、培养基的种类细菌：细菌：pH 7.08.0放线菌：放线菌：pH 7.58.5酵母菌：酵母菌：pH 3.86.0霉菌：霉菌：pH 4.05.8藻类：藻类：pH 6.07.0原生动物：原生动物：pH 6.08.0初始初始pHpH4、通常培养条件：、通常培养条件：二、实验原理二、实验原理 琼脂琼脂是最优良的凝固剂，自是最优良的凝固剂，自18801880年开始用于配制微年开始用于配制微生物培养基以来，至今经久不衰。生物培养基以来，至今经久不衰。5 5、凝固剂、凝固剂细菌：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基；放线菌：放线菌：高氏高氏1 1号号合成培养基培养；合成培养基培养；酵母菌：酵母菌：麦芽汁麦芽汁培养基；培养基；霉菌：霉菌：查氏查氏合成培养基；合成培养基；二、实验原理二、实验原理6 6、实验室的常用培养基、实验室的常用培养基称量称量-配置配置-调节调节pHpH值值-过滤过滤-分装分装-灭菌灭菌 1.1.称量称量 按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状（如肉膏），应用烧杯称量。对于不是粉状（如肉膏），应用烧杯称量。三、培养基配制的基本步骤三、培养基配制的基本步骤 2.2.配调配调 向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。助溶）。如是配制如是配制固体培固体培养基，在琼脂的熔化时养基，在琼脂的熔化时，需不断需不断搅搅拌拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。后，补足所失水分。如果配方中含有淀粉，先将淀粉用少量冷水调成糊如果配方中含有淀粉，先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完全熔化后补足所失水分。全熔化后补足所失水分。三、培养基配制的基本步骤三、培养基配制的基本步骤 3.3.调节调节pHpH值值 培养基溶解均匀并冷却至室温时用培养基溶解均匀并冷却至室温时用pHpH试纸试纸测测pHpH，然后根据要求加酸或碱（一般用然后根据要求加酸或碱（一般用1mol1molHClHCl和和1mol1molNaOHNaOH），），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然为自然pHpH时，不用调节。时，不用调节。4.4.过滤过滤 用滤纸或多层纱布过滤，一般用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可无特殊要求可省去。省去。三、培养基配制的基本步骤三、培养基配制的基本步骤 5.5.分装分装 将制好的培养基分装入将制好的培养基分装入试管试管内或内或三角瓶三角瓶内，管内，管（瓶）口塞上棉塞。（瓶）口塞上棉塞。固体培养基固体培养基要要趁热装趁热装。分装时要分装时要避免避免培养基培养基粘染管（瓶）口粘染管（瓶）口，引起污，引起污染。分装量可分为下面几方面：染。分装量可分为下面几方面：（1 1）斜面：）斜面：装量为管长的装量为管长的1/4-1/51/4-1/5。（2 2）液体培养基、高层培养基、半固体培养基：）液体培养基、高层培养基、半固体培养基：装装载量不超过管长的载量不超过管长的1/31/3。（3 3）三角瓶：）三角瓶：装量不超过容积装量不超过容积1/21/2。三、培养基配制的基本步骤三、培养基配制的基本步骤 分装后，塞棉塞（胶塞），分装后，塞棉塞（胶塞），包扎包扎，灭菌，灭菌。（1 1）培养基的灭菌）培养基的灭菌常用的灭菌的方法有：常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌超高温灭菌、过滤除菌、辐蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌超高温灭菌、过滤除菌、辐射灭菌、化学药品灭菌等方法。射灭菌、化学药品灭菌等方法。本实验培养基的灭菌本实验培养基的灭菌常使用的是常使用的是高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌，它是利，它是利用用高温湿热高温湿热空气使菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的。空气使菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的。6.6.灭菌灭菌三、培养基配制的基本步骤三、培养基配制的基本步骤 高压蒸气灭菌条件：高压蒸气灭菌条件：一般培养基一般培养基:1.05 Kg/cm 1.05 Kg/cm2 2,121.3,15-30 min121.3,15-30 min 含糖培养基含糖培养基:0.56 Kg/cm 0.56 Kg/cm2 2,112.6,15-30 min112.6,15-30 min （1 1）培养基的灭菌）培养基的灭菌6.6.灭菌灭菌（2 2）器皿的灭菌：）器皿的灭菌：干热空气：干热空气：160160，2 2 小时小时（3 3）无菌室的消毒）无菌室的消毒 紫外光紫外光 化学药物化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾熏蒸（苯酚；高锰酸钾+甲醛）甲醛）6.6.灭菌灭菌6.6.灭菌灭菌湿湿热热灭灭菌菌使使用用的的设设备备（4 4）加水加水装锅装锅盖盖盖盖加热加热当压力升为当压力升为0.5kg/cm20.5kg/cm2时时排放冷空气排放冷空气正式升压正式升压保压保压（1.1kg/cm21.1kg/cm2，121121，保持，保持20-30min20-30min）停止加热停止加热自然自然降压至零降压至零排放余汽排放余汽开盖开盖取出灭菌物品取出灭菌物品趁热摆斜面趁热摆斜面检验灭菌效果。检验灭菌效果。（5 5）灭菌的操作过程）灭菌的操作过程牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基的配制1 1、固体培养基（、固体培养基（平板平板制作）制作）2 2、固体培养基（、固体培养基（斜面斜面制作）制作）2 2、半固体半固体培养基培养基3 3、液体液体培养基培养基四、几种培养基的配置方法四、几种培养基的配置方法牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨固体固体培养基培养基配方配方：牛肉膏牛肉膏 0.3g 0.3g 蛋白胨蛋白胨 1g 1g 氯化钠氯化钠 0.5g 0.5g 琼脂琼脂 1.5g 1.5g 水水 100mL 100mL pH 7.2-7.4 pH 7.2-7.4 灭菌灭菌 121121，20min20min牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨半固体半固体培养基培养基配方配方：琼脂琼脂 0.3g0.3g牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨液体液体培养基培养基配方配方：琼脂琼脂 0g0g四、几种培养基的配置方法四、几种培养基的配置方法 1.1.按配方称取一定量的按配方称取一定量的试剂、琼脂试剂、琼脂到到250ml250ml的的 三角瓶中。三角瓶中。2.2.加入加入100mL100mL水。水。3.3.塞上硅胶塞塞上硅胶塞,用牛皮纸包扎好。用牛皮纸包扎好。4.4.高压蒸汽灭菌。高压蒸汽灭菌。5.5.灭菌后灭菌后,当培养基冷却至当培养基冷却至5050左右时左右时,无菌无菌倾注平皿倾注平皿(每每100ml100ml可制备可制备5-65-6个平皿个平皿)。6.6.凝固后放冰箱备用凝固后放冰箱备用 。（一）（一）平板固体平板固体培养基制作培养基制作（二）（二）斜面斜面培养基制作培养基制作1.1.称取一定量的称取一定量的营养琼脂营养琼脂到到100ml100ml的三角瓶中。的三角瓶中。2.2.加入加入100mL100mL水。水。3.3.放入水浴锅内溶解。放入水浴锅内溶解。4.4.在在空试管内倒入空试管内倒入2 23mL3mL已经溶解好的培养基，已经溶解好的培养基，【注意尽量不要让培养基沾到试管口注意尽量不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶塞塞好硅胶塞。5.5.放入烧杯中放入烧杯中,高压蒸汽高压蒸汽灭菌灭菌。6.6.摆斜面摆斜面,凝固后放冰箱备用。凝固后放冰箱备用。用于活化菌种，用于活化菌种，或培养菌种的斜面或培养菌种的斜面用于保存菌种的斜面用于保存菌种的斜面 搁置斜面搁置斜面 当培养基冷却至当培养基冷却至5050左右时，将试管带棉塞的一左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的斜面的长度不超过试管总长的一半一半。半固体半固体培养基制作培养基制作1.1.按牛肉膏蛋白胨半固体培养基按牛肉膏蛋白胨半固体培养基配方配方称取相应成分到称取相应成分到250ml250ml的三角瓶中。的三角瓶中。2.2.加入加入100mL100mL水。水。3.3.放入水浴锅内溶解。放入水浴锅内溶解。4.4.在在空试管空试管内倒入内倒入2 23mL3mL已经溶解好的培养基，已经溶解好的培养基，【注意尽量不要让培养基沾到试管口注意尽量不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶塞塞好硅胶塞。5.5.放入烧杯中放入烧杯中,高压蒸汽高压蒸汽灭菌灭菌。6.6.凝固后放冰箱备用。凝固后放冰箱备用。牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨半固体半固体半固体半固体培养基培养基培养基培养基配方配方n n牛肉膏牛肉膏牛肉膏牛肉膏:0.3g:0.3g:0.3g:0.3gn n蛋白胨蛋白胨蛋白胨蛋白胨:1g:1g:1g:1gn nNaClNaClNaClNaCl:0.5g:0.5g:0.5g:0.5gn n琼脂琼脂琼脂琼脂:0.3g:0.3g:0.3g:0.3gn n水水水水:100ml:100ml:100ml:100mln npH:pH:pH:pH:7.0-7.2 7.0-7.2 7.0-7.2 7.0-7.2n n放入水浴锅内溶解后放入水浴锅内溶解后放入水浴锅内溶解后放入水浴锅内溶解后,分装分装分装分装到试管到试管到试管到试管中中中中,灭菌灭菌灭菌灭菌备用。备用。备用。备用。液体液体培养基制作培养基制作1.1.按牛肉膏蛋白胨液体培养基配方称取相应成分到按牛肉膏蛋白胨液体培养基配方称取相应成分到250ml250ml的三的三角瓶中。角瓶中。2.2.加入加入100mL100mL水。水。3.3.充分溶解。充分溶解。4.4.在在空试管内倒入空试管内倒入2 23mL3mL已经溶解好的培养基，已经溶解好的培养基，【注意尽量注意尽量不要让培养基沾到试管口不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶塞塞好硅胶塞。5.5.放入烧杯中放入烧杯中,高压蒸汽高压蒸汽灭菌。灭菌。6.6.冷却后放冰箱备用。冷却后放冰箱备用。牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨液体培养基液体培养基液体培养基液体培养基按下列按下列配方配方及方法配制及方法配制n n牛肉膏牛肉膏牛肉膏牛肉膏:0.3g:0.3g:0.3g:0.3gn n蛋白胨蛋白胨蛋白胨蛋白胨:1g:1g:1g:1gn nNaClNaClNaClNaCl:0.5g:0.5g:0.5g:0.5gn n水水水水:100ml:100ml:100ml:100mln npH:pH:pH:pH:7.0-7.2 7.0-7.2 7.0-7.2 7.0-7.2n n放入水浴锅内溶解后放入水浴锅内溶解后放入水浴锅内溶解后放入水浴锅内溶解后,分装到试管中分装到试管中分装到试管中分装到试管中,灭菌备用。灭菌备用。灭菌备用。灭菌备用。注注：试管加棉塞试管加棉塞(最好最好)，培养基分装完毕以后，在管口，培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。加棉塞时，应使棉塞长度的加棉塞时，应使棉塞长度的2/32/3在试管口内，如下图所示在试管口内，如下图所示。正确正确不正确不正确不正确不正确观看录像观看录像 培养基的配置培养基的配置 （10分钟）分钟）思考题思考题n培养基配制完成后，为什么必须立即培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌灭菌?n若不能及时灭菌应如何处理若不能及时灭菌应如何处理?n已灭菌的培养基如何进行无菌检查已灭菌的培养基如何进行无菌检查?
