超氧化物歧化酶(SOD)的生产---林志豪.ppt

超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SODSOD）的生产）的生产 生物技术 林志豪目录一.SOD的概况二.SOD的运用三.SOD的生产四.SOD使用及生产时的注意事项五.注意事项一.SOD的概况1.超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶，是生物体内抗氧化酶系中主要成员之一。SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内 6性极强的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)会立即将其分解为完全无害的水。这样，三种酶便组成了一个完整的防氧链条。2.SOD的分类 按其结合的金属离子可分为Fe-SOD、Mn-SOD、CuZn-SOD三种 3.SOD的理化性质 3.1 SOD对氰化物和H2O2的敏感性 3.2 SOD的吸收光谱特性 3.3 SOD稳定性及影响因素4.SOD的作用 1、抗氧化 2、预防慢性病及其并发症 3、抗衰老 4、抗疲劳 5、化疗副作用的消除剂 6、避免手术的二次伤害 7、化解妇女的氧化压力危机 二.SOD的运用1药物类，主要集中在炎症病患者，尤其治疗类风湿关节炎、慢性多发性关节炎、心肌梗塞、心血管病、肿瘤患者以及放射性治疗炎症病患者；2用于生化制药，作为一种生化酶制剂，广泛应用于临床和科研上，具有极强的抗衰老，抗肿瘤、调节人体内分泌系统作用；3用于化妆品类，可添加在化妆品中，具有抗氧化抗腐蚀的优良性能。以 SOD为主要成份的产品风靡世界，引发了化妆品历史上的一场革命，使人类永葆青春美丽梦想成真；4.用作保健食品、饮料、如SOD糖、SOD口服液、SOD干啤等都非常畅销!在饮料、糖果、糕点等食品中加入SOD既可利用其抗腐蚀性延长保质期，又可调节人体内分泌系统。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶人体内的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。全球118位科学家发表联合声明：自由基是百病之源，SOD是健康之本。体内的SOD活性越高，寿命就越长。三.SOD的生产1.SOD酶的提取 称取5克大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞 后，加入pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液 （pH7.8）15ml，继续研磨20min,使SOD酶充分 溶解到缓冲液中，然后6000r/min冰冻离心 15min，放弃沉淀，取上清液。2.去除杂蛋白 上清液中加入0.25倍体积的氯仿乙醇混合液 搅拌15min,6000r/min离心15min，放弃沉淀，得到的上清液即是粗酶液 3.SOD酶的沉淀分离 粗酶液在搅拌下缓慢加入固体硫酸铵至饱和浓 度60%，持续搅拌15min，6000r/min离心 15min，得到SOD酶沉淀4.将沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液 5mL中，然后6000r/min离心15min，放弃沉 淀，取上清液，用凝胶sephacylS-200进行纯 化，然后超滤浓缩。5.用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量6.将浓缩冷冻干燥后即得成品。四、超氧化物歧化酶（SOD）的测定原理 连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放 出O2-,生成带色的中间产物。在自氧化过程的初 始阶段，黄色中间产物的积累在滞后30-45s后 就与时间呈现性关系。中间产物在325nm处有 强烈的光吸收，在有SOD存在时能催化生成O2 和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，通过计 算就可以求出SOD的活力。仪器 紫外分光光度计、pH计,离心机试剂 0.05mol/L连苯三酚溶液：称取3.15g连苯三酚用 0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容至500ml pH=8.3 Tris-HCl缓冲溶液 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液:NH2C(CH2OH)3 121.14 取12.114g,溶解，定容至100ml 0.1mol/L盐酸:取8.6(9)ml浓盐酸，稀释至 1000ml 5 0毫升0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶 液 19.9_毫升0.1mol/L盐酸混匀并稀释至100 毫升。(保存温度:常温密封避光保存)测定步骤 1、称取6g样品，加于现在冰箱中放置的缓冲液60ml(样品的10倍，视情况定)，在冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min 离心20min,取上清液用于酶活测定。2、连苯三酚自氧化速率的测定 取4.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min,加入10 连苯三酚液，迅速摇匀 空白：取4.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min,加入10 缓 冲液，迅速摇匀倒入光径1cm的比色杯中，在325nm波长下于恒温池中每隔30s测A值一次计算线形范围内，每1minA的增值，此即连苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在0.07OD/min3.酶活测定测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同，取1.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min,加入3ml酶液，加入10 连苯三酚液，迅速摇匀空白：取1.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min,加入3ml酶液，加入10 缓冲液，迅速摇匀计算加酶后连苯三酚自氧化速率 4.结果计算样品酶活单位表示，SOD酶活单位（U）/g鲜重样品酶活单位=式中酶样品在325nm处每分钟光密度变化值 V反应液体积 n酶液稀释倍数（若酶液足够多，可不稀释即n为1）五.注意事项1.SOD的安全性大量试验和临床应用表明，无论何种给药方式，除罕见的超敏反应外，SOD对人体无毒性。虽然SOD是Mr在30 000以上的蛋白质，但却未发现具有抗原性，其原因也正在进一步研究中。2.SOD生产时的注意事项 2.1 在破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底 2.2 PH的控制力度很重要，以及在实验中的温度等 2.3 要学会正确使用分光光度计 谢谢！