5.酵母核糖核酸的分离及组分鉴定.ppt

实实 验验 四四酵酵 母母R N A的的 分分 离离 及及 其其 组组 分分 鉴鉴 定定 （离 心 技 术）实验目的1、学习稀碱法提取酵母RNA粗制品的原理和方法。2、了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。3、学习离心机的使用方法。离心机原理和应用离心机原理和应用离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。rpm revolutions per minute 每分钟转数 RCF-Relative centrifugal force 相对离心力，是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力加速度g的倍数4000rpm 4000g RCF=1.119105(rpm)2 r 其中r 表示离心机转轴中心与与离心管中心的距离单位为cm。由于离心管的位置由转子（rotor）决定，因此r 必须由查阅相关转子的参数而得。使用注意：配平！使用注意：配平！离心参数调节：转头，转速和离心时间核糖核酸核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）由核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸,因含核糖而得名。RNA的种类：mRNA，tRNA和rRNA，另外snRNA（2006年诺贝尔医学奖）。核苷核苷核苷核苷-5-5-磷酸磷酸磷酸磷酸 酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的2.67%-10.0%，而DNA含量仅为0.03%-0.516%。工业上制备RNA多选用成本低、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。应用领域：调味品和食品添加剂实验原理 稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，离心除去蛋白质和菌体后，上清液用乙醇使RNA沉淀，由此即得到RNA粗制品。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分，加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以鉴定上述的组分。RNA组份鉴定（1）嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。（2）苔衣酚显色法：核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与苔衣酚（3，5-二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂。（3）磷酸与定磷试剂中的钼酸铵作用生成磷钼酸，并被Vc还原成蓝色的的复合物钼蓝。实验仪器1.研钵 2.水浴锅 3.量筒 4.滴管 5.试管及试管架 6.烧杯 7.离心机 8.锥形瓶试剂和材料1.0.04mol/L氢氧化钠溶液 6.定磷试剂2.三氯化铁浓盐酸溶液 7.酸性乙醇溶液 3.0.1mol/L硝酸银溶液 8.苔黑酚乙醇溶液4.1.5mol/L硫酸溶液 9.酵母粉5.浓氨水操作步骤（一）酵母RNA粗制品的提取1、将酵母片在研钵中研磨均匀，称取4g酵母粉悬于30mL 0.04mol/L NaOH溶液中(锥形瓶)。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。2、4000r/min离心5分钟后，分成上清和沉淀两层，沉淀主要成分就是变性的蛋白质，RNA包含在上清中。3、将上清液缓缓倾入30mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，离心（4000rpm）5分钟。弃去上清液。注：离心前，离心管（包含转头）一定要对称的两管在天平上配平，第一次用NaOH溶液，第二次用酸性乙醇。两次使用的胶头滴管要分开放置（二）组分鉴定1、水解：提取的核酸溶解于10mL 1.5mol/L硫酸溶液中，在沸水浴中加热10min制成水解液，进行组分的鉴定。2.嘌呤碱：取一只试管，加入1ml水解液，加入过量的浓氨水（用胶头吸管吸2管约2ml），再加入1 ml 0.1 mol/L硝酸银，观察有无白色嘌呤碱的银化合物沉淀生成。嘌呤银络合物在碱性条件下易形成白色絮状沉淀。3.核糖：取一只试管，加入水解液1ml，三氯化铁浓盐酸溶液2ml，加入苔黑酚乙醇溶液0.2ml，放入沸水浴中5min。注意溶液是否变墨绿色。核糖在浓盐酸中，与苔黑酚（3，5-二羟甲苯）及三氯化铁盐酸试剂共热，产生绿色的络合物。4.磷酸：取一只试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml，在沸水浴中加热。观察溶液是否变成蓝色。磷酸与钼酸铵试剂作用产生磷钼酸，磷钼酸在还原剂抗坏血酸(Vc)的作用下形成蓝色复合物钼蓝。1.稀碱法提取的RNA为变性RNA，可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNA生物活性实验材料。2.苔黑酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。因此地衣酚实验不能作为RNA与DNA鉴别的依据。3.试剂瓶中溶液用胶头滴管取用，吸1管约为1毫升，0.2ml用胶头滴管取4滴即可（每滴约为0.05毫升），4.离心：两组配平5.请将试剂瓶放在原处取用，以免其他同学不能找到。注意事项强酸强酸、强碱、强碱、沸水浴，注意安全！沸水浴，注意安全！下次实验：下次实验：蛋白质含量测定（考马斯亮蓝蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）法）