蛋白质含量测定.ppt

蛋白质含量的测定引言引言蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。一项非常重要的工作。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：白质测定方法：物理性质：物理性质：紫外分光光度法紫外分光光度法。化学性质：凯氏定氮法、化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法双缩脲法、Lowry法法等。等。染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。其他性质：荧光法。其他性质：荧光法。二、比色法：二、比色法：利用蛋白质与不同试剂的呈色反应，利用蛋白质与不同试剂的呈色反应，测定蛋白质的含量，如双缩尿法和测定蛋白质的含量，如双缩尿法和酚试剂法酚试剂法（lowryslowrys method method）。）。三、紫外分光光度法：三、紫外分光光度法：利用蛋白质对利用蛋白质对280nm280nm紫外紫外光有最大的吸光度而采用光有最大的吸光度而采用一、凯氏定氮法：一、凯氏定氮法：根据蛋白质的含氮量来根据蛋白质的含氮量来测定蛋白质的含量测定蛋白质的含量 公式公式:每每g样品中含氮克数样品中含氮克数 6.25 100掌握蛋白质含量测定的原理和方法掌握蛋白质含量测定的原理和方法学会标准曲线的绘制学会标准曲线的绘制熟练使用分光光度计、紫外分光光熟练使用分光光度计、紫外分光光度计。度计。（一）双缩脲法双缩脲法（二）（二）LowryLowry法法（三）（三）紫外分光光度法紫外分光光度法【实验原理实验原理】蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物（双中能与铜离子形成紫色络合物（双缩脲反应），且其呈色深浅与蛋白缩脲反应），且其呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可用于蛋白质的含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。质的定量测定。但必须注意，此反应并非蛋但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物以及分两个以上的肽键的化合物以及分子内有子内有H H2 2NCHNCHNH -CHNH -CH2 2-NH2NH2等结构化合物，双缩脲反应等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。也呈阳性。【实验材料实验材料】1分光光度计分光光度计2试剂试剂（1）标准牛血清清蛋白溶液）标准牛血清清蛋白溶液 10 mg/ml（2）双缩脲试剂：）双缩脲试剂：【实验方法实验方法】1.取12支试管分成两组，编号，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml标准牛血清清蛋白溶液,用水补足到1ml。2.加入双缩脲试剂4 ml，混匀。室温放置30 min。3.以管1（空白管）调零，在540 nm的波长下进行比色，分别记录各管的吸光度读数。4.取两组平均值，以蛋白含量为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。5.用同样方法测定未知样品。【计算计算】蛋白含量蛋白含量722型分光光度计的使用（1）预热仪器将选择开关置于“T”，打开电源开关，使仪器预热20分钟。为了防止光电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切断。（2）选定波长根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。722型分光光度计的使用（3）固定灵敏度档 在能使空白溶液很好地调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度较低的挡，使用时，首先调到“1”挡，灵敏度不够时再逐渐升高。但换挡改变灵敏度后，须重新校正“0%”和“100%”。选好的灵敏度，实验过程中不要再变动。（4）调节T=0%轻轻旋动“0%”旋钮，使数字显示为“00.0”，（此时试样室是打开的）。722型分光光度计的使用（5）调节T=100%将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示正好为“100.0”。722型分光光度计的使用（6）吸光度的测定 将选择开关置于“A”，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中，调节吸光度调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。读数后，打开试样室盖，切断光路。重复上述测定操作1-2次，读取相应的吸光度值，取平均值。（7）浓度的测定 选择开关由“A”旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的浓度值。（8）关机 实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架用软纸擦净。注意事项（1）为了防止光电管疲劳，不测定时必须将试样室盖打开，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。（2）取拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，而不能碰比色皿的光学表面。（3）比色皿不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗涤，也不能用毛刷清洗。比色皿外壁附着的水或溶液应用擦镜纸或细而软的吸水纸吸干，不要擦拭，以免损伤它的光学表面。【思考题思考题】1、干扰本实验的因素有哪些？、干扰本实验的因素有哪些？2、是否所有的肽和蛋白质都能和硫酸铜的碱、是否所有的肽和蛋白质都能和硫酸铜的碱性溶液发生双缩脲反应？性溶液发生双缩脲反应？3、简述蛋白质含量测定在科研及临床疾病诊、简述蛋白质含量测定在科研及临床疾病诊断上的应用。断上的应用。【实验原理实验原理】蛋白质蛋白质呈色试剂呈色试剂:酚试剂酚试剂酚试剂酚试剂磷钼酸磷钼酸磷钼酸磷钼酸-钨酸的混和酸钨酸的混和酸钨酸的混和酸钨酸的混和酸半胱氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、酪氨酸、酪氨酸、酪氨酸、色氨酸色氨酸色氨酸色氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸还原型还原型混和酸混和酸混和酸混和酸 (兰色兰色兰色兰色)蛋白质肽键蛋白质肽键蛋白质肽键蛋白质肽键碱性碱性碱性碱性烯醇化烯醇化烯醇化烯醇化铜离子铜离子铜离子铜离子在在在在pH10pH10条件下螯合在肽键结构中条件下螯合在肽键结构中条件下螯合在肽键结构中条件下螯合在肽键结构中从而使电子转移到混和酸的显色剂上，从而使电子转移到混和酸的显色剂上，从而使电子转移到混和酸的显色剂上，从而使电子转移到混和酸的显色剂上，增强了增强了增强了增强了酚试剂酚试剂酚试剂酚试剂对蛋白质的敏感性。对蛋白质的敏感性。对蛋白质的敏感性。对蛋白质的敏感性。蛋白质与酚试剂呈色蛋白质与酚试剂呈色深浅深浅与蛋白质的与蛋白质的含量含量成正比成正比，利用蛋白质的浓度与呈，利用蛋白质的浓度与呈色的关系，制备标准曲线，来测定样色的关系，制备标准曲线，来测定样品中的蛋白质含量。品中的蛋白质含量。LowryLowry法法优点本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏1020倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。【实验材料实验材料】1器材：分光光度计器材：分光光度计2试剂试剂 试剂甲：试剂甲：4碳酸钠碳酸钠+0.2mol/L氢氧化钠（氢氧化钠（50）1硫酸铜硫酸铜+2酒石酸钾钠酒石酸钾钠 （1）试剂乙：试剂乙：Folin氏试剂氏试剂用已知浓度的标准牛血清白蛋白溶液用已知浓度的标准牛血清白蛋白溶液（浓度为（浓度为250250g/ml）配成一系列不同）配成一系列不同浓度的蛋白质溶液。浓度的蛋白质溶液。取取1414支试管分成两组，编号，按下表支试管分成两组，编号，按下表操作操作 编编号号 1 2 3 4 5 6 7蛋白蛋白质质含量含量（g）标标准液准液(ml)生理生理盐盐水水ml)试剂试剂甲甲(ml)25 50 100 150 200 250 空白空白 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 /1.0 5 5 5 5 5 5 5 混匀，置混匀，置2025水浴十分水浴十分钟钟，冷却至室温，冷却至室温试剂试剂乙乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 立即振立即振摇摇，室温放置三十分室温放置三十分钟钟在波长在波长500nm500nm条件下比色条件下比色,测定其光密度值。以测定其光密度值。以空白管调零空白管调零.标准曲线的绘制以蛋白质的含量（以蛋白质的含量（gg）为横坐标，光为横坐标，光密度值（密度值（ODOD）为纵坐标，绘制出蛋白为纵坐标，绘制出蛋白质含量的标准曲线。质含量的标准曲线。根据样品中的根据样品中的OD500,OD500,从蛋白质标准曲从蛋白质标准曲线中找到样品中蛋白质的线中找到样品中蛋白质的gg数。数。注意事项测定蛋白质的浓度最好在测定蛋白质的浓度最好在25100g之间，故血清稀释倍数一般为之间，故血清稀释倍数一般为200500。各管加酚试剂应快，必须立即混匀，各管加酚试剂应快，必须立即混匀，否则就会出现浑浊。否则就会出现浑浊。2、绘制出标准曲线：要求规范作图、绘制出标准曲线：要求规范作图 铅笔作图、铅笔作图、横、纵坐标名称及单位横、纵坐标名称及单位 日期、作者日期、作者、曲线名称、曲线名称 曲线上体现出待测样品的曲线上体现出待测样品的OD值及值及 ug数。数。3、计算：、计算：100ml血清中的蛋白质含量。血清中的蛋白质含量。要求：要求：写出公式、代入数据、写出结果。写出公式、代入数据、写出结果。1、原始数据原始数据:各管的各管的OD值值 分析实验误差产生的原因分析实验误差产生的原因 总结该方法测定蛋白质含量的优缺点。总结该方法测定蛋白质含量的优缺点。紫外分光光度法测定蛋白质浓度紫外分光光度法测定蛋白质浓度由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。【实验材料实验材料】1器材：分光光度计器材：分光光度计2试剂试剂 标准蛋白质溶液标准蛋白质溶液1.1.标准曲线制定：取标准曲线制定：取8 8支试管，编号分别加支试管，编号分别加0 0，0.50.5，1.01.0，1.51.5，2.02.0，2.52.5，3.03.0，4.0 4.0 mlml标准标准牛血清白蛋白溶液（浓度为牛血清白蛋白溶液（浓度为1 1m mg/mlg/ml），用水补），用水补足到足到4 4 mlml，用光程为，用光程为1cm1cm的比色杯，测定的比色杯，测定OD280OD280，绘标准曲线，绘标准曲线2.2.样品测定样品测定讨论比较三种测定法的灵敏度差异