实用哺乳动物细胞培养手册.docx

有用哺乳动物细胞培育手册细胞培育是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下,使其生长生殖,并维持其构造和功能的一种培育技术.细胞培育的培育物可以是单个细胞,也可以是细胞群.1、试验室设计细胞培育是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必需保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培育室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清爽，枯燥和无烟尘。细胞培育室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培育于一室，而洗刷消毒在另一室。2、常用设施及设备（1） 超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。（2） 无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三局部组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培育箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。（3） 操作间：一般培育箱、离心机、水浴锅、定时钟、一般天平及日常分析处理物（4） 洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。（5） 分析间：显微镜、计算机及打印机等。3、培育器皿常用细胞培育器皿有培育瓶、培育板、培育皿等。常预备量是使用量的三倍。器皿应选择透亮度好、无毒、利于细胞粘附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面几种。（1） 液体储存瓶：用于储存各种配制好的培育液、血清等液体，常用规格有 500ml 、250ml 、100ml 等几种。（2） 培育瓶：依据培育细胞种类要求不同培育瓶的形态各异，用于细胞传代培育的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观看，瓶口要大小全都，口径一般不小于 1cm ，允许吸管伸入瓶内任何部位， 规格有 200ml 、100ml 、50ml 、25ml 、10ml 等几种。（3） 培育皿：用于开放式培育及其它用途。分直径30mm 、60mm 、120mm等几种。（4） 吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。其改进后管上部有球型刻度称改进吸管， 刻度吸管用于移动液体。 常用 1ml 和10ml 两种。短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。（5） 离心管：离心管是细胞培育中使用最广泛的器皿，依据用途不同形态各样，常用于细胞培育的离心管有大腹式尖底离心管和一般尖底离心管两类。前者分别为 50ml 、30ml 、15ml ；后者则多为 10ml 和 5ml。（6） 其它：如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。5、细胞培育目的与用途科学争辩 :药物争辩开发与根底争辩1. 药物争辩与开发(1) 药筛选 :如化学合成药物药效争辩 ,中药有效成分筛选与鉴定等.(2) 疫苗争辩与开发 :如病毒性疫苗的争辩与开发 (肝炎病 ,艾滋病疫苗等 ),肿瘤疫苗 (多肽疫苗 )等.(3) 基因工程药物争辩与开发 :如干扰素争辩与开发 ,细胞生长因子争辩与开发等 .(4) 细胞工程药物争辩与开发 :生物活性多肽争辩与开发 ,人参皂甙 ,紫杉醇等生物活性成分争辩与开发 .(5) 单克隆抗体制备 :包括诊断用单克隆抗体 ,治疗用单克隆抗体 .根底争辩(1) 药物作用机理(2) 基因功能(3) 疾病发生气理2, 生物制药(1) 疫苗生产 :如病毒性疫苗 (肝炎病 ,艾滋病疫苗等 ),肿瘤疫苗(多肽疫苗 )等.(2) 基因工程药物生产 :如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素 ,粒细胞生长因子 ,胸腺肽等 (3) 诊断用和药用单克隆抗体生产(4) 细胞工程药物生产 :生物细胞内的一些生物活性多肽 ,生物活性物质等细胞培育根本条件1,适宜的细胞培育基适宜的细胞培育基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一 ,培育基不仅供给细胞养分 和促使细胞生长增殖的根底物质 ,而且还供给培育细胞生长和生殖的生存环境 .2,优质血清目前,大多数合成培育基都需要添加血清 .血清是细胞培育液中最重要的成分之一 ,含有细胞生长所需的多种生长因子及其它养分成分.3,无菌无毒细胞培育环境无菌无毒的操作环境和培育环境是保证细胞在体外培育成功的首要条 件.在体外培育 的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防范力量,一旦被微生物或有毒物质污染 ,或者自身代谢物质积存 ,可导致细胞中毒死亡 .因此, 在体外培育细胞时 ,必需保持细胞生存环境无菌无毒 ,准时去除细胞代谢产物.4,恒定的细胞生长温度维持培育细胞旺盛生长 ,必需有恒定适宜的温度 . 5,适宜的气体环境气体是哺乳动物细胞培育生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和 二氧化碳 . 细胞培育基种类与根本成分细胞培育基的种类很多 ,按其来源分为合成培育基和自然培育基 (目前使用的培育基绝大局部是合成培育基),按其物质状态分为干粉培育基和液体培育基两类.干粉培育基需由试验者 自己配制并灭菌 ,液体培育基由专业商家供给 ,用户可直接使用 ,格外便利 . 每种细胞都有其适宜的培育基 ,合成培育基的主要成分有氨基酸氨基酸是组成蛋白质的根本单位 .不同种类的细胞对氨基酸的要求各异,但有几种氨基酸细胞自身不能合成 ,必需依靠培育液供给 ,这几种氨基酸称为必需氨基酸 .其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸, 在缺少谷氨酰胺时 ,细胞生长不良而死亡 .因此,各种培育液中都有较大量的谷氨酰胺 .但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定 ,应置于-20冰箱中保存,在使用前参加培育液内 .已含谷氨酰胺的培育液在 4冰箱中储存 2 周以上时,还应重参加原来量的谷氨酰胺 .碳水化合物碳水化合物是细胞生长主要能量来源 ,其中有的是合成蛋白质和核酸的成分.主要有葡萄糖 ,核糖,脱氧核糖 ,丙酮酸钠和醋酸等 .无机盐培育液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡.此外,通过供给钠,钾和钙离子 ,帮助细胞调整细胞膜功能 .培育液的渗透压是一个格外重要的因素 , 细胞通常可耐受 260mOsm/kg 320 mOsm/kg. 标准培育液的渗透压在此范围内波动 .特别留意 :向培育液中参加其它物质有可能会明显转变培育液的渗透压 ,特别是溶于强酸或强碱中的物质 .向培育液中添加 HEPES时需按以下方法调整钠离子浓度 .缓冲系统大多数细胞所需 pH 在 7.2 - 7.4. 但是,细胞培育最适 pH 值随培育的细胞种类不同而不同 .成纤维细胞宠爱较高 pH (7.4 - 7.7), 而传代转化细胞系则需要偏酸 pH (7.0 - 7.4). 由于多数培育液靠碳酸氢钠 (NaHCO3) 与CO2 体系进展缓冲 ,因此,气相中的 CO2 浓度应与培育液中碳酸氢钠浓度相平衡.假设气相或培育箱空气中 CO2 浓度设定在 5%, 培育 3 液中 NaHCO3 的参加量为 1.97g/L; 假设 CO2 浓度维持在 10%, 培育液中 NaHCO3 的参加量为 3.95g/L. 细胞培育瓶盖不应拧得太紧 ,以保证气体交换 . HEPES 是一种非离子缓冲液 ,在 pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲力量 ,但是格外昂贵,在高浓度时对一些细胞可能有毒 .HEPES 缓冲液可与低水平的碳酸钠(0.34g/L) 共用,以抵消因额外参加 HEPES 引起的渗透压增加 .在这种培育条件下,细胞培育瓶的盖子应拧紧 ,以防止培育液中所需的少量碳酸盐散入空气中.大多数培育液中含有酚红作为 pH 指示剂,酸性培育液呈橙黄色 ,碱性培育液呈深红色 .维生素在细胞培育中 ,尽管血清是维生素重要来源 , 但是很多培育基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长 .其它成分在一些较为简单的培育液中还包括其它一些成分.如在杂交瘤技术中常用的 DMEM 培育液,使用时还需要补加丙酮酸钠和 2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol,2-Me).2-Me对细胞生长有很重要的作用 .有人认为它相当于胎牛血清 ,有直接刺激细胞增殖作用 .2-Me 的活性局部是硫氢基 , 其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物复原成谷胱甘肽,能诱导细胞的增殖,为非特异性的激活作用 .同时避开过氧化物对培育细胞的损害 .另一个重要作用是促进分裂原的反响和DNA 合成,增加植物凝集素 (PHA) 对淋巴细胞的转化作用 ,已广泛应用于杂交瘤技术 ,另外,也开头用于一些难以培育的细胞 .2-Me 是一种小分子复原剂 ,极易氧化 .分子量为 78.13, 纯的2- Me 是一种无色有刺激味的液体 ,比重为 1.110-1.120(Do20), 常用终浓度为 5×10 -5M. 常配制成 0.1M 的储存液 ,用时每升培育液加 0.5ml.液体培育基保存液体培育基应于 4冰箱避光保存 ,试验前放入 37预热 .未加血清液体培育基有效期为 12 个月.液体培育基中的 L-谷氨酰胺会随着储存时间的延长而渐渐分解 .假设细胞生长不良 ,可以再添加适量 L-谷氨酰胺 . 干粉培育基保存:4冰箱避光保存 ,有效期 36 个月.血清细胞培育液中添加的血清有牛血清 ,马血清,人血清等 ,其中牛血清是最常用的血清 ,分为胎牛血清和生小牛血清 .胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分别出的血清 ,价格昂贵 .生小牛血清是从刚诞生的尚未哺乳的小牛中分别出来的血清 ,如厂家能做到这一点 ,生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大 .如小牛诞生后已哺乳 ,从这种小牛中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质 ,其质量明显不如前两种 . 血清的质量 ,种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长 ,而不同批次的血清支持细胞生长的力量也不同 ,尤其是对克隆细胞的生长 ,某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质 .因此,在购置大量血清之前 ,必需对血清支持细胞生长力量进展检测 ,然后再,然后大量购置质量好的同一批号的血清 ,并留意以下几点:(1) 需要长期保存的血清必需储存于 -20 - 70 低温冰箱中.4冰箱中保存时间切勿超过 1 个月.由于血清结冰时体积会增加约 10%, 因此,血清在冻入低温冰箱前 ,必需预留肯定体积空间 ,否则易发生污染或玻璃瓶冻裂.(2) 一般厂商供给的血清为无菌 ,无需再过滤除菌 .如觉察血清有悬浮物,则可将血清参加培育液内一起过滤 ,切勿直接过滤血清 .(3) 瓶装血清解冻需承受逐步解冻法 :-20 至 - 70 低温冰箱中的血清放入 4冰箱中溶解 1 天.然后移入室温 ,待全部溶解后再分装 .在溶解过程中需不断轻轻摇摆均匀 (留神勿造成气泡 ),使温度与成分均一 ,削减沉淀的发生 .切勿直接将血清从 -20进入 37解冻 ,这样因温度转变太大 ,简洁造成蛋白质凝集而消灭沉淀 .(4) 热灭活是指 56, 30 分钟加热已完全解冻的血清 .加热过程中须规章摇摆均匀 .此热处理的目的是使血清中的补体成分 (complement) 灭活.除非必需,一般不建议作此热处理 ,由于热处理睬造成血清沉淀物显著增多 ,而且还会影响血清的质量 .补体参与反响有 :细胞毒作用 , 平滑肌细胞收缩 ,肥大细胞和血小板释放组胺 , 增加吞噬作用 , 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化 .(5) 切勿将血清在 37放置太久 ,否则血清会变得浑浊 ,同时血清中的有效成分会破会而影响血清质量 .(6) 血清中的沉淀物絮状物:主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身的质量 .可用离心 3000rpm, 5 分钟去除 ,也可不用处理. 显微镜下 “小黑点“:经过热处理过的血清 ,沉淀物的形成会显著增多.有些沉淀物在显微镜下观看象 “小黑点“,常误认为血清受污染 .一般状况下,此小黑点不会影响细胞生长 ,但假设疑心血清质量 ,则应马上停顿使用,更换另一批号的血清 .细胞培育环境1,试验室设计细胞培育是一种无菌操作技术 ,要求工作环境和条件必需保证无微生物污染和不受 其它有害因素的影响 .细胞培育室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响 ,要求工作环境清洁 ,空气清爽 ,枯燥和无烟尘 .细胞培育室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作和封闭培育于一室 ,而洗刷消毒在另一室 .2,常用设施及设备(1) 超净工作台 :也称净化工作台 ,分为侧流式 ,直流式和外流式三大类.(2) 无菌操作间 :一般由更衣间 ,缓冲间和操作间三局部组成 .操作间放置净化工作台及二氧化碳培育箱 ,离心机,倒置显微镜等 .缓冲间可放置电冰箱,冷藏器及消毒好的无菌物品等 .(3) 操作间:一般培育箱 ,离心机,水浴锅,定时钟,一般天平及日常分析处理物(4) 洗刷消毒间 :烤箱,消毒锅,蒸馏水处理器及酸缸等 .(5) 分析间:显微镜,计算机及打印机等 . 3,培育器皿常用细胞培育器皿有培育瓶 ,培育板,培育皿等 .常预备量是使用量的三倍.器 皿应选择透亮度好 ,无毒,利于细胞粘附和生长的材料 ,常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品 .常用的器皿有下面几种 .(1) 液体储存瓶 :用于储存各种配制好的培育液 ,血清等液体 ,常用规格有 500ml,250ml, 100ml 等几种.(2) 培育瓶:依据培育细胞种类要求不同培育瓶的形态各异,用于细胞传代培育的细胞要求瓶壁厚簿均匀 ,便于细胞贴壁生长和观看 ,瓶口要大小全都,口径一般不小于 1cm, 允许吸管伸入瓶内任何部位 ,规格有200ml,100ml,50ml,25ml,10ml 等几种.(3) 培育皿:用于开放式培育及其它用途 .分直径 30mm,60mm,120mm 等几种.(4) 吸管:常用的有长吸管和短吸管两类 ,长吸管也称刻度吸管 .其改进后管上部有球型刻度称改进吸管 ,刻度吸管用于移动液体 .常用 1ml 和 10ml 两种.短吸管也叫滴管 ,分弯头和直头两种 .(5) 离心管:离心管是细胞培育中使用最广泛的器皿 ,依据用途不同形态各样,常用于细胞培育的离心管有大腹式尖底离心管和一般尖底离心管 两类.前者分别为 50ml,30ml,15ml; 后者则多为 10ml 和 5ml.(6) 其它:如三角烧瓶 ,烧杯,量筒,漏斗,注射器等 . 4,细胞培育温度维持培育细胞旺盛生长 ,必需有恒定而适宜的温度 .不同种类的细胞对培育温度要求也不同 .人体细胞培育的标准温度为 36.5±0.5,偏离这一温度范围 ,细胞的正常代谢会受到影响 ,甚至死亡 .培育细胞对低温的耐受力较对高温强 ,温度上升不超过 39时,细胞代谢与温度成正比 ;人体细胞在 39- 401 小时,即能受到肯定损伤 ,但仍有可能恢复 ;在 40- 411 小时,细胞会普遍受到损伤 ,仅小半数有可能恢复;41- 421 小时,细胞受到严峻损伤 ,大局部细胞死亡 ,个别细胞仍有恢复可能;当温度在 43以上 1 小时,细胞全部死亡 .相反,温度不低于 0时,对细胞代谢虽有影响 ,但并无损害作用 ;把细胞放入 25- 35时,细胞仍能生存和生长,但速度减慢 ;放在 4数小时后 ,再回到 37培育 ,细胞仍能连续生长.细胞代谢随温度降低而减慢 .当温度降至冰点以下时 ,细胞可因胞质结冰受损而死亡 .但是,假设向培育液中参加肯定量的冷冻保护剂 (二甲亚砜或甘油),可在深低温下如 -80或-196(液氮 )长期保存 .5,适宜的气体环境气体是哺乳动物细胞培育生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和 二氧化碳 .氧气参与三羧酸循环 ,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分 .开放培育时一般把细胞置于 95% 空气加 5%二氧化碳混合气体环境中 .二氧化碳既是细胞代谢产物 ,也是细胞生长生殖所需成分 , 它在细胞培育中的主要作用在于维持培育基的pH 值.大多数细胞的适宜 pH 为 7.2-7.4, 偏离这一范围对细胞培育将产生有害的影响.但细胞耐酸性比耐碱性大一些 ,在偏酸环境中更利于细胞生长 .但有一些细胞也宠爱偏碱环境中生长 ,如成纤维细胞最适合 pH 是 7.4-7.6. 每种细胞都有其最适 pH 值.细胞培育无菌操作根本技术无菌操作技术分为三个局部 :工作环境及外表的处理 ,细胞培育所用玻璃及塑料制品的处理及培育液与培育细胞的处理.工作环境的处理使用层流超净工作台是最经济有效的手段 .超净工作台正常工作时 ,向下的气流可阻挡外界空气污染物进入超净台.(1) 试验前,无菌室及无菌操作台用紫外灯照耀30-60 分钟灭菌 ,用 70%酒精擦拭无菌操作台面 ,并开启无菌操作台风机运转 10 分钟后,才可开头实验操作.每次操作只处理一株细胞 ,以免造成细胞穿插污染 .试验完毕后 ,将试验物品带出工作台 .如需要连续进展下一个试验 ,则用 70% 酒精擦拭无菌操作台面 ,再让无菌操作台风机运转 10 分钟后,才可进展下一个试验操作 .(2) 无菌操作工作区域应保持清洁与宽阔 ,必要物品 ,如试管架 ,移液器或吸管头等可以临时放置 ,其它试验用品用完后应准时移出 ,以利气体流通 . 试验用品要用 70% 酒精擦拭后才能带入无菌操作台内 .试验操作应在操作台中心无菌区域内进展 ,勿在边缘非无菌区域操作 .(3) 留神取出无菌试验用品 ,避开造成污染 .切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口 ,不要在翻开的容器正上方操作试验 .容器翻开后 ,用手夹住瓶盖并握住瓶身 ,倾斜约 45°角取用 ,尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上 .(4) 工作人员应留意自身的安全 ,必需穿戴试验衣与手套后才进展试验.对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别留神 ,并选择适当等级的无菌操作台(至少两级 ).操作过程中 ,应避开引起气溶胶的产生 ,留神有毒性试剂,例如 DMSO 及 TPA 等,并避开锋利物品伤人等 .(5) 定期检查以下工程 :CO2 钢瓶内的 CO2 压力;CO2 培育箱内的 CO2 浓度,温度,及水盘是否有污染 ;无菌操作台内气流压力是否正常 ,定期更换紫外灯管及 HEPA 过滤器滤膜 ,预滤网300 小时/预滤网,3000 小时/HEPA). 培育细胞生长过程 :埋伏期指数增生期停滞期埋伏期(latent phase) 细胞接种后 ,先经过一个在培育液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩 , 胞体呈圆球形 .然后细胞贴附于载体外表 ,称贴壁,悬浮期完毕 . 细胞贴壁速度与细胞种类 , 培育基成分 ,载体的理化性质等亲热相关 .一般状况下 , 原代培育细胞贴壁速度慢 ,可达 10-24 小时或更多 , 而传代细胞系贴壁速度快, 通常 10-30 分钟即可贴壁 .细胞贴壁后还需经过一个埋伏阶段 ,才进入生长和增殖期 .原代培育细胞埋伏期长 ,约 24-96 小时或更长 , 连续细胞系和肿瘤细胞埋伏期短 ,仅需 6-24 小时.(2) 指数增生期 (logarithmic growth phase)这是细胞增殖最旺盛的阶段 ,分裂相细胞增多 .指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志.通常以细胞分裂相指 数(Mitotic index, MI) 表示,即细胞群中每 1000 个细胞中的分裂相数 .一般细胞的分裂指数介于 0.1%-0.5%, 原代细胞分裂指数较低 ,而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达 3%-5%. 指数增生期的细胞活力最好时期 ,是进展各种试验最正确时期 ,也是冻存细胞的最好时机 .在接种细胞数量适宜状况下,指数增生期持续 3-5 天后,随着细胞数量不断增多 ,生长空间削减 ,最终细胞相互接触集合成片 .正常细胞相互接触后能抑制细胞运动 ,这种现象称接触抑制现象 (contact inhibition). 而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象 ,能连续移动和增殖 ,导致细胞向三维空间扩展 ,使细胞发生积存 (piled up). 细胞接触集合成片后 ,虽然发生接触抑制 ,但只要养分充分 ,细胞仍能进展增 殖分裂,因此细胞数仍旧在增多 .但是,当细胞密度进一步增大 ,培育液中营养成分削减 ,代谢产物增多时 ,细胞因养分枯竭和代谢产物的影响 ,导致细胞分裂停顿 ,这种现象称密度抑制现象 (Density Inhibition).(3) 停滞期(Stagnate phase)细胞数量到达饱和密度后 ,如不准时进展传代 ,细胞就会停顿增殖 ,进入停顿期 .此时细胞数持平 ,故也称平台期 (Plateau phase). 停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动 .如不进展分别传代 ,细胞会因培育液中养分耗尽 , 代谢产物积聚 ,pH 下降等因素中毒 ,消灭形态转变 ,贴壁细胞会脱落 ,严峻的会发生死亡 ,因此,应准时传代 . 培育细胞根本形态 培育细胞随贴附支持物外形不同而形态各异 ,最常见的是贴附于平面支持物细胞 .在一般光镜下生存中的细胞是均质而透亮的 ,构造不明显 .细胞在生长期常有 1-2 个核仁. 在细胞机能状态不良时 ,细胞轮廓会增加 ,反差增大 .假设胞质中时而消灭颗粒,脱滴和腔泡等 ,说明细胞代谢不良 . 体外培育细胞依据它们在培育器皿是否能贴附于支持物上生长特征 ,可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类 . 贴附型细胞在培育时能贴附在支持物外表生长.如羊水细胞为贴附型细胞 , 常表现为成纤维型细胞和上皮细胞生长 .悬浮型细胞在培育中悬浮生长 .(1) 成纤维型细胞在培育中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时,皆可称之为成纤维细胞 . 本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相像而得名,细胞在支持物外表 呈梭形或不规章三角形生长 ,细胞中心有卵园形核 ,胞质向外伸出 2-3 厘米个长短不同的突起 ,除真正的成纤维细胞外 ,凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长 .(2) 上皮型细胞此类型细胞在培育器皿支持物上生长具有扁平不规章多角形特征,细胞中心有园形核 ,细胞严密相连单层膜样生长 .起源于内 ,外胚层细胞如皮肤,表皮衍生物 ,消化管上皮等组织细胞培育时 ,皆呈上皮型形态生长 .(3) 游走型细胞本型细胞在支持物上散在生长 ,一般不连成片 .细胞质经常伸出伪足或突起,呈活泼的游走或变形运动 ,速度快且不规章 .此型细胞不很稳定 ,有时亦难和其它型细胞区分 .在肯定的条件下 ,由于细胞密度增大联成片后 ,可呈类似多角型或成纤维细腻包形态 .常见于羊水细胞培育的早期 . 细胞培育所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒清洗在组织细胞培育中 ,体外细胞对任何有害物质都格外敏感 .微生物产品附带杂物 ,上次细胞残留物及非养分成分的化学物质 ,均能影响培育细胞的生长.因此对使用玻璃器皿和重使用的培育器皿都要严格彻底的清洗, 且要依据器皿的组成材料不同 ,选择不同的清洗方法 .玻璃器皿的清洗组织细胞培育中 ,使用量最大的是玻璃器皿 ,故工作最最大的是玻璃器皿的清洗 .一般玻璃器皿的清洗包括浸泡 ,刷洗,浸酸和冲洗四个步骤 .清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透亮无油迹 ,而且不能残留任何物质 .(1) 浸泡:初次使用和培育使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡,以使附着物软化或被溶液掉 .的初次使用的玻璃器皿 ,在生产及运输过程中 , 玻璃外表带有大量的干固的灰尘 ,且玻璃外表常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等 .瓶使用前应先用自来水简洁刷洗 ,然后用稀盐酸液浸泡过夜,以中和其中的碱性物质 .再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质,干固后不易洗掉 ,故用后要马上浸入水中 ,且要求完全浸入 ,不能留有气泡或浮在液面上 .(2) 刷洗:浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗,以除去器皿外表附着较牢的杂质 .刷洗要适度 ,过度会损害器皿外表光泽度 .(3) 浸酸:清洁液是由重铬酸钾 ,浓硫酸和蒸馏水按肯定比例配制而成 , 其处理过程称为浸酸 .清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用 ,而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质 .清洁液去污力量很强 .是清洗过程中关键的一环 . 浸泡时器皿要布满清洁液 ,勿留气泡或器皿露出清洁液面 .浸泡时间一般为过夜,不应少于 6 小时. 清洁液可依据需要 ,配制成不同的强度 ,常用的以下三种: 重铬酸钾 (g) 浓硫酸(ml) 蒸馏水(ml) (A) 强清洁液63:1000:202300 (B) 次强清洗液 120:200:1000 (C) 弱清洁液 100:100:100.清洁液配制时应留意安全 ,须穿戴耐酸手套和围裙 ,并要保护好面部及身体暴露局部 .配制过程中可使重铬酸钾溶于水中 ,然后渐渐加浓硫酸 .并不停的用玻璃棒搅拌 ,使产生的热量挥发 ,配制过程中可使重铬酸钾溶于水中 , 然后渐渐加浓硫酸 .并不停的用玻璃棒搅拌 ,使产生的热量挥发 ,配制溶液应选择塑料制品 .配成后清洁液一般为棕红色 .(4) 冲洗:玻璃器皿在使用后 ,刷洗及浸泡后都必需用水充分冲洗 .使之尽量不留污染或洁液的残迹 .冲洗最好用洗涤装置 .即省力,效果又好 .如用手工操作 ,则需流水冲洗十次以上 ,每天水须灌满及倒干净 ,最好用蒸馏水清洗 3-5 次,晾干备用 .胶塞的清洗细胞培育中所用的橡胶制品主要是瓶塞 .购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质 ,应先用自来水冲洗 ,再做常规处理 ,常规清洗方法是 :每次用后马上置入水中浸泡 ,然后用 2% NaOH 或洗衣粉煮沸 10-20 分钟,以除掉培育中的蛋白质 .自来水冲洗后 ,再用 1%稀盐酸浸泡 30 分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20 分钟,晾干备用 .塑料制品的清洗塑料自制品现多是承受无毒并已经特别处理的包装 ,翻开包装即可用 , 多为一次性物品 .必要时用 2% NaOH 浸泡过夜 ,用自来水充分冲洗 ,再用 5% 盐酸溶液浸泡 30 分钟,最终用自来水和蒸馏水冲洗干净 ,晾干备用 .消毒细胞培育的最大危急是发生培育物的细菌 ,真菌和病毒等微生物的污染.污染主要是由于操作者的疏忽而引起 ,常见的缘由有操作间或四周空间的不洁,培育器皿和培育液消毒不合格或不彻底 .由于有关培育的每个环节的失误均能导致培育失败 ,故细胞培育的每个环节都应严格遵守操作常规, 防止发生污染 . 消毒方法分为三类 :物理灭菌法 (紫外线,湿热,干烤,过滤等),化学灭菌法 (各种化学消毒剂 )和抗生素 .(1) 紫外线消毒 :用于空气 ,操作台外表和不能使用其它法进展消毒和培育器皿 .紫外线直接照耀便利 ,效果好,经肯定的时间照耀后 ,可以消灭空气中大局部细菌 ,培育室紫外线灯应距地面不超过 2.5 米,且消毒进物品不宜相互遮档 ,照耀不到的地方起不到消毒作用 .紫外线可产生臭氧 ,污染空气,试剂及培育液都有不良影响 ,对人皮肤也有损害 ,不宜近照耀 .(2) 温热消毒 :即高压蒸气消毒 ,是一种使用最广泛 ,效果最好的消毒方法.温热消毒时 ,消毒物品不能装得过满 ,以防止消毒器内气体堵塞而千百万危急,保证其内气体的流通 .在加热升压之前 ,先要翻开排气阀门排放消毒器内的冷空气 ,冷气空气排出后 ,关闭排气阀门 ,同时检验安全阀活动自如,继后开头升压 ,当到达所需压力时 ,开头记算消毒时间 .消毒过程中 ,操作者不能离开工作岗位 ,要定时检查压力及安全 ,防止消毒及表皮意外大事发生.常用物品消毒压力准时间 :培育液,平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体:121,15 磅, 20 分钟; 布类,玻璃制品 ,金属器械等物品 :先 121, 15 磅, 20 分钟,然后在烘箱中烘干; 玻璃瓶:干热灭菌 170, 4 小时.(3) 化学消毒法 :最常见的是 70% 酒精及 1的洁而灭 ,前者主要用于操作者的皮肤 , 操作台外表及无菌室内的壁面处理 .后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒 .化学消毒法操作简洁 ,便利有效 .(4) 抗生素消毒 :主要用于培育用液灭菌或预防培育物污染 . 细胞培育常用物品细胞培育基目前,市场上可供给干粉培育基和液体培育基 .干粉培育基需使用者自己配制并灭菌 ,其优点是价格廉价 .缺点是配制过程繁琐 ,质量不易把握 .液体培育基是由专业产家按标准规模化生产 ,不仅质量得到保证 ,而且使用格外便利.常用的培育基种类及其应用见下表 :培育基种类 应用细胞RPMI-1640( 标准型) 主要用于悬浮细胞培育DMEM- 高糖(标准型) DMEM- 低糖(标准型)IMDMMcCoys 5A M199F10血清平衡盐液体PBS(Phosphate-Buffered Sallines)DPBS(Dulbecco”s Phosphate-Buffered Sallines)标准型成分 含量(g/L)CaCl2(anhyd.)( 无水氯化钙 ) 0.10 KCl 0.20KH2PO4 0.20MgCl2 6H2O 0.10NaCl 8.00Na2HPO4 7H2O 2.16Hanks” 平衡盐溶液 (Hanks” Balanced Salt Solutions,HBSS)成分 含量(g/L)CaCl2(anhyd.)( 无水氯化钙 ) 0.14 KCl 0.40KH2PO4 0.06MgCl2 6H2O 0.1011MgSO4 7H2O 0.10NaCl 8.00NaCO3 0.35Na2HPO4 0.048D-Glucose 1.00Phenol Red 0.01D-Hanks” 平衡盐溶液 (D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)成分 含量(g/L) KCl 0.40KH2PO4 0.06NaCl 8.00NaCO3 0.35Na2HPO4 0.048D-Glucose 1.00Phenol Red 0.01消化液:分别组织和分散细胞 .常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠 (EDTA)两种溶液 .可以单独使用 ,也可以混合使用 .(1) 胰蛋白酶溶液胰蛋白酶 (简称胰酶 )是一种黄白色粉末 ,易潮解,应放置冷暗枯燥处保存.目前应用的胰蛋白酶主要来自牛或猪的胰腺.胰酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解 ,使细胞相互离散 .胰酶对细胞的分别作用与细胞的种类和细胞的特性有亲热关系 .一般来讲 ,胰酶浓度大 ,作用温度高 ,作用时间长 , 对细胞分别力量也大 ,但超过肯定的限度会损伤细胞 .胰酶溶液在 pH8.0, 温度为 37时,作用力量最强 .留意:钙离子,镁离子和血清蛋白的存在会降低胰酶活力 .因此,胰酶溶液常用无 Ca2+,Mg2+ 的 D-Hanks” 平衡盐溶液配制成0.25% 溶液.消化细胞时 ,参加一些血清或含血清的培育液 ,或胰蛋白酶抑制剂能终止胰蛋白酶对细胞的消化作用 .胰蛋白酶溶液配制 :(1) 称取胰蛋白酶粉末置烧杯中 ,先用少许 D-Hanks 平衡盐溶液 (pH7.2 左右)调成糊状 ,然后再补足 D-Hanks 平衡盐溶液 ,搅拌混匀 ,置室温 4 小时或冰箱过夜 ,并不断搅拌振荡 ;(2) 次日,先用滤纸粗滤 ,再进展过滤除菌 ,分装入瓶中 ,低温冰箱保存备用,常用浓度为 0.25% 或 0.125%. 胰蛋白酶溶液偏酸 ,使用前可调用碳酸氢钠溶液调 pH 至 7.2 左右.保存条件 :配制好的胰蛋白酶溶液必需保存在 -20冰箱中 ,以免分解失效.EDTA 4Na 溶液EDTA 是一种化学螯合剂 ,对细胞有肯定的离觧作用 ,而且毒性小 ,价格低廉,使用便利 .常用工作液浓度为 0.02%. 通常与 0.25% 的胰蛋白酶溶液按1:1 混合使用 (混合液).留意:使用 EDTA 处理细胞后 ,肯定要用 Hanks 液冲洗干净,因残留的 EDTA 会影响细胞生长 . EDTA 溶液配制 :用无钙,镁的 D-HBSS 平衡盐溶液溶解后 ,高压蒸汽灭菌 ,分装成小瓶 ,室温或 4冰箱保存 . 胰蛋白酶 EDTA 4Na 溶液(0.05% 胰蛋白酶 , 0.53mM EDTA 4Na)0.5g 胰蛋白酶 +0.2gEDTA 4Na+1L D-HBSS.- 20冰箱中保存 . pH 调整液(1) NaHCO3 溶液常用浓度为 7.5%. 配制时用三蒸水溶解后 ,过滤除菌 ,分装,4冰箱或室温保存 .当 pH 值超过后 ,可用高压灭菌的 10% 醋酸溶液或通入 CO2 气体方法调整.(2) HEPES( 分子量 238.31) 溶液HEPES 使用终浓度一般为 10-50mM, 但通常配成 1M 储存液:用 200ml 双蒸水溶解 47.6 克 HEPES, 用 1N NaOH 调整 pH 至 7.5-8.0; 然后过滤除菌 ,分装小瓶,室温或 4保存. 抗生素溶液酚红:大多数培育液中使用酚红作为 pH 指示剂.红色表示中性 pH, 黄色代表酸性 pH, 紫色表示碱性 pH. 但是,在一些特别培育液中不含酚红 ,由于已有一些争辩说明 :酚红能模拟类固醇激素 (尤其是雌激素 )样作用.丙酮酸钠 :是细胞液中细胞的另一种碳源 .D- 葡萄糖是细胞优选碳源 ,但是当培育液中 D-葡萄糖耗尽时 ,细胞可以代谢丙酮酸钠猎取碳源 .抗生素哺乳动物细胞冷冻保存主要目的 :(1) 保存种子细胞 ,以便随时取用 .这是保存细胞的最主要目的.(2) 削减细胞被微生物污染的危急性 .(3) 削减细胞之间穿插污染的危急性 .(4) 削减细胞因传代培育而引起的遗传变异和形态转变.(5) 避开有限细胞系消灭年轻或恶性转化 .(6) 降低人力和物力 .冷冻保存要点(1) 冷冻过程要缓慢 .需要冷冻保存的细胞先在 4冰箱中放置 30-60 分钟;然后转入 -20,放置 30 分钟;然后再转入 -80放置 16-18 小时(或过夜);最终放入液氮中长期保存 .有条件的地方 ,可用程控降温仪 ,按每分钟-1 到 - 3速度降温 ,始终到-80以下 ,然后直接放入液氮中长期保存 .(2) 冻存细胞必需处在对数生长期 ,活力大于 90%, 无微生物污染 . (3) 细胞浓度把握在:1×107 -5×107/ml.(4) 使用高浓度血清或蛋白保护剂 .一般状况下 ,用于冷冻保存完全细胞生长培育液中血清浓度大于 20%.(5) 使用适宜的细胞冷冻保护剂 ,以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏.目前,最常用的冷冻保护剂是 DMSO( 二甲基亚砜 ),使用终浓度为 5-10%. 但是,有些细胞系不能用 DMSO 作为冷冻保护剂 ,如人白血病细胞系 HL-60. 由于,DMSO 能诱导 HL-60 细胞分化 .在这种状况下 ,可选用其它冷冻保护剂 , 如甘油(glycele), 羟乙基淀粉等 .特别留意 :(1) 细胞在冷冻过程中在 -20冰箱内放置时间不行超过 1 小时,以防止冰晶过大而破坏细胞 .也可跳过 -20这一步骤直接放入 -80冰箱中 ,但这样做细胞存活率要低一些 .(2) DMSO 稀释时会释放大量热量 .因此,DMSO 不能直接加到细胞液中 ,必需事先配制 .(3) DMSO 必需是细胞培育级别的 .买的 DMSO 本身处于无菌状态 ,第一