实验；细菌培养的基本技术.ppt

实验原理实验原理 根据某种根据某种细菌的营养需要而选择细菌的营养需要而选择多种原料配制而成的培养基多种原料配制而成的培养基，不仅含，不仅含有这种细菌生长繁殖所需要的各种营有这种细菌生长繁殖所需要的各种营养物质，还要有养物质，还要有适宜的适宜的pH。本实验所。本实验所用的用的牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基，应用较广，应用较广泛，适于芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌泛，适于芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌的培养。等多种细菌的培养。培养基培养基液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基的成分：培养基的成分：水、碳源、氮源、无机盐、生长因子水、碳源、氮源、无机盐、生长因子 配制好的培养基必须经过配制好的培养基必须经过灭菌灭菌。灭菌。灭菌是指杀死一定环境中所有微生物的是指杀死一定环境中所有微生物的细胞、细胞、芽孢和孢子芽孢和孢子。对不同的材料，应当采取不。对不同的材料，应当采取不同的灭菌方法。培养基一般采用同的灭菌方法。培养基一般采用高压蒸汽高压蒸汽灭菌法灭菌法，就是将待灭菌的培养基放入密闭，就是将待灭菌的培养基放入密闭的高压蒸汽灭菌锅内，通过加热使锅内的的高压蒸汽灭菌锅内，通过加热使锅内的水沸腾并产生水蒸汽。当水蒸汽将锅内的水沸腾并产生水蒸汽。当水蒸汽将锅内的冷空气排尽以后，关闭排气阀并继续加热，冷空气排尽以后，关闭排气阀并继续加热，这时锅内的压力就会升高，这时锅内的压力就会升高，最终使菌体蛋最终使菌体蛋白质凝固变性白质凝固变性，从而达到灭菌的目的。，从而达到灭菌的目的。接接种环是用火焰烧灼灭菌种环是用火焰烧灼灭菌的。的。将某种细菌接种在彻底灭菌的培将某种细菌接种在彻底灭菌的培养基上，经过一段时间的培养后，就养基上，经过一段时间的培养后，就能够得到生长良好的细菌群体，它们能够得到生长良好的细菌群体，它们在培养基上会呈现出在培养基上会呈现出一定的形态特征。一定的形态特征。目的要求目的要求1通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配 制，制，了解配制培养基的一般步骤和方法了解配制培养基的一般步骤和方法。2了解灭菌的基本原理，以及实验室中了解灭菌的基本原理，以及实验室中常用的灭菌方法常用的灭菌方法。3初步学会初步学会细菌培养的基本技术细菌培养的基本技术。材料用具材料用具 芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌、牛肉膏、蛋白芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌、牛肉膏、蛋白胨、琼脂。胨、琼脂。天平、角匙、天平、角匙、200mL烧杯、试管、漏斗、量烧杯、试管、漏斗、量筒、玻璃棒、滴管、胶管、弹簧夹、铁架台、酒筒、玻璃棒、滴管、胶管、弹簧夹、铁架台、酒精灯、石棉网、三角架、火柴、纱布、棉花、牛精灯、石棉网、三角架、火柴、纱布、棉花、牛皮纸、线绳、标签、接种环、精密皮纸、线绳、标签、接种环、精密pH试纸试纸(或或pH计计)、金属小筐、高压蒸汽灭菌锅、恒温箱。、金属小筐、高压蒸汽灭菌锅、恒温箱。NaCl、1mol/L的的NaOH溶液、体积分数为溶液、体积分数为75的酒精溶液、蒸馏水。的酒精溶液、蒸馏水。方法步骤方法步骤一、培养基的配制一、培养基的配制1称量称量2溶化溶化 向上述烧杯中加入蒸馏水向上述烧杯中加入蒸馏水100 mL，用玻璃棒搅匀后，放到酒精灯上加热。当牛用玻璃棒搅匀后，放到酒精灯上加热。当牛肉膏和蛋白胨溶化后，加入琼脂，并继续用肉膏和蛋白胨溶化后，加入琼脂，并继续用微火加热。在琼脂溶化的过程中，要控制火微火加热。在琼脂溶化的过程中，要控制火力的大小，力的大小，并且不断搅拌，并且不断搅拌，以免培养基溢出以免培养基溢出或烧焦。待琼脂完全溶化后，补加蒸馏水，或烧焦。待琼脂完全溶化后，补加蒸馏水，定容至定容至200mL。3调调pH4培养基的分装培养基的分装 注意：分装时不要将培养基沾在瓶口和锥形瓶注意：分装时不要将培养基沾在瓶口和锥形瓶壁上，以免引起污染。壁上，以免引起污染。5加棉塞加棉塞 培养基分装完毕以后，在瓶口培养基分装完毕以后，在瓶口上加一个棉塞。棉塞能上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保防止杂菌污染，保证通气良好证通气良好。加棉塞时，应使。加棉塞时，应使棉塞长度的棉塞长度的2/3在瓶口内在瓶口内，如下图所示。，如下图所示。用棉塞堵塞试管口时，不宜过紧或过松，用棉塞堵塞试管口时，不宜过紧或过松，以不留缝隙为以不留缝隙为标准标准。棉塞过紧，妨碍空气流通，不易拔出；棉塞过松，。棉塞过紧，妨碍空气流通，不易拔出；棉塞过松，微生物会从缝隙处进入试管，导致培养基被污染。微生物会从缝隙处进入试管，导致培养基被污染。在大在大批制作棉塞以前，应先试制批制作棉塞以前，应先试制1 1个，个，塞在试管口上，塞在试管口上，用手提用手提棉塞，如果试管不脱落下来，就以这个棉塞的大小为准棉塞，如果试管不脱落下来，就以这个棉塞的大小为准制作其余的棉塞。制作其余的棉塞。棉塞的制作过程见图。棉塞的制作过程见图。注意，沾有培注意，沾有培养基的棉塞不能再使用。养基的棉塞不能再使用。6包扎包扎 在瓶口外面包上一层牛皮纸或报纸，在瓶口外面包上一层牛皮纸或报纸，然后，用线绳扎好。贴上然后，用线绳扎好。贴上标签标签，注，注明明培养基名称培养基名称、配制日期配制日期和和制作者制作者姓名姓名 1将扎好的锥形瓶将扎好的锥形瓶瓶口向上竖放瓶口向上竖放在灭菌在灭菌桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。注意：桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。注意：灭灭菌桶内的物品不能放得太菌桶内的物品不能放得太 挤挤，否则会影响，否则会影响灭菌效果。灭菌效果。2加盖，并将排气软管插入灭菌桶的排气槽内。加盖，并将排气软管插入灭菌桶的排气槽内。以两两对称的方式，同时旋紧相对的两个紧固以两两对称的方式，同时旋紧相对的两个紧固螺栓，以防漏气螺栓，以防漏气。二、灭菌二、灭菌3排出锅内的冷空气。接通电源，当压力排出锅内的冷空气。接通电源，当压力 上升到上升到49kPa时，打开排气阀时，打开排气阀放气放气，当压，当压 力降到力降到0时，关闭排气阀。重复上述放气时，关闭排气阀。重复上述放气 过程一次，以过程一次，以彻底排出锅内的冷空气彻底排出锅内的冷空气。4当锅内的压力上升到当锅内的压力上升到98kPa时，控制火时，控制火 力大小，使力大小，使压力维持在压力维持在98kPa左右左右 20min，切断电源。切断电源。5当压力降至当压力降至0以后，打开排气阀，以后，打开排气阀，10min 以后，旋松紧固螺栓，取出锥形瓶。最后，以后，旋松紧固螺栓，取出锥形瓶。最后，将灭菌锅里的水排放干净。将灭菌锅里的水排放干净。注意事项注意事项 第一，紧盖和开盖时，都应采用对角式均匀地转动紧固第一，紧盖和开盖时，都应采用对角式均匀地转动紧固螺栓，并且双手同时操作。切不可采用将紧固螺栓逐个螺栓，并且双手同时操作。切不可采用将紧固螺栓逐个拧紧或松开的方法。拧紧或松开的方法。第二，灭菌结束以后，切勿过早打开排气阀，否则，开第二，灭菌结束以后，切勿过早打开排气阀，否则，开盖时试管内的培养基会由于内外压力不平衡而冲出管口，盖时试管内的培养基会由于内外压力不平衡而冲出管口，使棉塞上沾染培养基而发生污染。使棉塞上沾染培养基而发生污染。三、搁置斜面三、搁置斜面 当培养基当培养基冷却至冷却至50左右时，将试管带左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试斜面的长度不超过试管总长的一半。管总长的一半。四、接种四、接种1用肥皂将双手洗净，擦干，再用用肥皂将双手洗净，擦干，再用 酒精酒精(体积分数为体积分数为75%)棉球棉球擦拭擦拭 双手双手。2当手上的酒精挥发完毕后，点燃当手上的酒精挥发完毕后，点燃 酒精灯。注意：一定要酒精灯。注意：一定要等手上的等手上的 酒精挥发完毕后，再点燃酒精酒精挥发完毕后，再点燃酒精 灯灯，否则，容易将手烧伤。，否则，容易将手烧伤。3接种，操作程序见下图。注意：整个实验操作过接种，操作程序见下图。注意：整个实验操作过程都要非常小心，不要碰翻酒精灯，以免烧伤。程都要非常小心，不要碰翻酒精灯，以免烧伤。（1）用左手大姆指、食）用左手大姆指、食指和无名指夹住菌种试管指和无名指夹住菌种试管和待接种和斜面试管，右和待接种和斜面试管，右手拧松棉塞、不取下。手拧松棉塞、不取下。（2）右手拿接种环，在）右手拿接种环，在火焰上烧灼灭菌，特别是火焰上烧灼灭菌，特别是箍处。箍处。（3）火焰边取下两个棉）火焰边取下两个棉塞，不能放下；烧灼管塞，不能放下；烧灼管口一周。口一周。（4）将接种环伸入试）将接种环伸入试管内，冷却后，轻轻管内，冷却后，轻轻挑取少量菌体，立即挑取少量菌体，立即将接种环抽出。将接种环抽出。（6）抽出接种环后，）抽出接种环后，烧管口，塞棉塞，接烧管口，塞棉塞，接种环灭菌。种环灭菌。（5）火焰旁将沾有菌种的）火焰旁将沾有菌种的接种环迅速伸到斜面培养基接种环迅速伸到斜面培养基的底部，由的底部，由里向外画蛇形细里向外画蛇形细线，线，线要画得细些。线要画得细些。例：例：B图是否正确？图是否正确？如不正确纠正方法是如不正确纠正方法是不正确。接种管宜放在菌种管上面不正确。接种管宜放在菌种管上面 4熄灭酒精灯。实验后的带菌培熄灭酒精灯。实验后的带菌培 养基，如果用的是养基，如果用的是致病菌致病菌，必，必 须经须经高压蒸汽灭菌锅灭菌后方高压蒸汽灭菌锅灭菌后方 能倒掉能倒掉；如果；如果是非致病菌是非致病菌，也，也 要经要经加热后再倒掉加热后再倒掉。5接种完毕，将所接接种完毕，将所接菌种菌种、接种日接种日 期期、接种者姓名填写在标签上接种者姓名填写在标签上。五、培养五、培养 将接种后的试管放入恒温箱将接种后的试管放入恒温箱内，在内，在25下培养下培养57d，或在，或在37下培养下培养24h。结论结论 斜面培养基上的细菌生长状况如斜面培养基上的细菌生长状况如何？将观察到的结果和得出的结论何？将观察到的结果和得出的结论填写在填写在 实验报告上。实验报告上。讨论讨论1在高压蒸汽灭菌开始以前，为什在高压蒸汽灭菌开始以前，为什 么要将灭菌锅内的冷空气排尽？么要将灭菌锅内的冷空气排尽？在高压蒸汽灭菌以前，如果高在高压蒸汽灭菌以前，如果高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，当压力上升到当压力上升到 98 kPa时，锅内的温时，锅内的温度就不会上升到应有的高度，导致度就不会上升到应有的高度，导致灭菌不彻底。灭菌不彻底。2灭菌完毕以后，如果压力未降到灭菌完毕以后，如果压力未降到0就打开排气阀，会出现什么现象？就打开排气阀，会出现什么现象？为什么？为什么？如果压力未降到零就打开排气如果压力未降到零就打开排气阀，试管内的培养基就会冲出管口。阀，试管内的培养基就会冲出管口。这是因为高压蒸汽灭菌锅内外压力这是因为高压蒸汽灭菌锅内外压力不平衡的缘故不平衡的缘故 3接种操作为什么一定要在火焰接种操作为什么一定要在火焰 旁边进行？旁边进行？空气中存在有大量的微生物，空气中存在有大量的微生物，而接种灯的火焰旁能形成一个无菌而接种灯的火焰旁能形成一个无菌区域，在这里操作，可以避免杂菌区域，在这里操作，可以避免杂菌污染污染 练习：练习：1、培养细菌需要根据某种细菌的、培养细菌需要根据某种细菌的_配制特定的配制特定的_.其中其中_培养基应用广泛培养基应用广泛.2、为使培养基呈固体状态，需要在配制好的各营养、为使培养基呈固体状态，需要在配制好的各营养成分的液体加入成分的液体加入_,溶化冷却即可溶化冷却即可.3、调节培养基的、调节培养基的pH值值,用浓度为用浓度为1mol/L的的_或或_溶液进行调节溶液进行调节.营养需要营养需要培养基培养基牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨琼脂琼脂HClNaOH4、对培养基进行灭菌就是要利用高温杀死、对培养基进行灭菌就是要利用高温杀死_.压力要达到压力要达到_KPa,维持维持_分钟分钟.5、搁置斜面时培养基不能温度、搁置斜面时培养基不能温度_否否则培养基会变成则培养基会变成_应趁热将试管放置成应趁热将试管放置成斜面形斜面形,使管内培养基形成的斜面长度不超过试管使管内培养基形成的斜面长度不超过试管总长的总长的_.培养基中的一切微生物培养基中的一切微生物9820太低太低固体固体1/26、微生物接种时各项操作必须在、微生物接种时各项操作必须在_条件条件下进行下进行.因此必须在因此必须在_中操作中操作.接种环境接种环境在在_上用灼烧去灭菌上用灼烧去灭菌,双手用双手用_%的酒精消毒的酒精消毒.7、接种时将灭菌的接种环挑取少许、接种时将灭菌的接种环挑取少许_,迅迅速插入培养基试管里速插入培养基试管里,在斜面上由在斜面上由_向向_连连续划几道连连续划几道_线线,然后将试管然后将试管口在火焰上灼烧口在火焰上灼烧,塞上塞上_.无菌无菌无菌箱无菌箱酒精灯酒精灯75菌体菌体里里外外蛇形细蛇形细棉塞棉塞7、接种后的试管要放入、接种后的试管要放入_箱中在箱中在_0下培养下培养_天天,即可见斜面上出现即可见斜面上出现_.8、接种后塞上棉塞的作用是、接种后塞上棉塞的作用是_.且棉塞要塞进试管的深度为棉塞总长的且棉塞要塞进试管的深度为棉塞总长的_恒温恒温371菌落菌落防止杂菌污染、保证防止杂菌污染、保证通气良好通气良好2/3255-7例例1 1、根据下面、根据下面“枯草杆菌的培养和观察枯草杆菌的培养和观察”的实验步骤，的实验步骤，回答问题回答问题1 1、实验前一周，取少许新鲜的干稻草切成碎段，放入、实验前一周，取少许新鲜的干稻草切成碎段，放入锥形瓶中，加水（水锥形瓶中，加水（水 ：草：草=10=10：1 1）并煮沸）并煮沸3030分钟后，分钟后，即用棉塞塞住瓶口，放在不见光的温暖处，或恒温箱即用棉塞塞住瓶口，放在不见光的温暖处，或恒温箱中。中。3-53-5天后，观察到液体混浊，表面出现一层白色天后，观察到液体混浊，表面出现一层白色薄膜。薄膜。2 2、用玻璃棒挑少量薄膜，涂在载玻片上，盖上盖玻片，、用玻璃棒挑少量薄膜，涂在载玻片上，盖上盖玻片，在高倍镜下可以观察到许多不活动的枯草杆菌群体。在高倍镜下可以观察到许多不活动的枯草杆菌群体。枯草杆菌的芽孢可耐高温而不致被杀死，枯草杆菌的芽孢可耐高温而不致被杀死，而在煮沸的情况下其它菌类会因高温使蛋白而在煮沸的情况下其它菌类会因高温使蛋白质变性而死亡质变性而死亡。问：在煮沸的新鲜干稻草液中为什么会问：在煮沸的新鲜干稻草液中为什么会出现枯草杆菌？出现枯草杆菌？例例2、以下是关于食品的腐败和食品的保存、以下是关于食品的腐败和食品的保存的实验步骤；的实验步骤；1、取标有、取标有A-F的六只锥形瓶，瓶内各放的六只锥形瓶，瓶内各放 入入30mL肉汤澄清液肉汤澄清液2、在、在A瓶中加入瓶中加入3角匙食盐；角匙食盐；B瓶中加入瓶中加入 15mL食醋；用棉塞塞食醋；用棉塞塞 住瓶口，住瓶口，A、B瓶瓶 都放在恒温箱中，温度为都放在恒温箱中，温度为30-370C3、C、D、E、F瓶中不加任何物质，都放瓶中不加任何物质，都放 置于空气中暴露置于空气中暴露1h，然后用棉塞住它们，然后用棉塞住它们 的瓶口。的瓶口。4、将、将C瓶放在瓶放在30-370C恒温箱中，恒温箱中，D瓶瓶 放在室温下，放在室温下，E瓶放在瓶放在40C左右的冰左右的冰 箱冷藏室内，箱冷藏室内，F放在放在-100C的冷冻室的冷冻室 内。内。5、一周后观察，记录实验结果。、一周后观察，记录实验结果。请你根据生物学原理对六瓶中食品的请你根据生物学原理对六瓶中食品的变化情况作一预测，并简述理由。变化情况作一预测，并简述理由。答：答：A、B、F、肉汤不会腐败；因、肉汤不会腐败；因A瓶高浓瓶高浓度盐抑制微生物的生长和繁殖；度盐抑制微生物的生长和繁殖；B瓶高浓度瓶高浓度的有机酸也能抑制微生物的生长和繁殖；的有机酸也能抑制微生物的生长和繁殖；F低温抑制了微生物的生长和繁殖；低温抑制了微生物的生长和繁殖；E肉汤在短时间内基本不会变质；但可肉汤在短时间内基本不会变质；但可能有少许低温型微生物能生长繁殖；能有少许低温型微生物能生长繁殖；C、D两瓶肉汤都会腐败；因有适合微两瓶肉汤都会腐败；因有适合微生物生长繁殖的温度、营养物质等条件。生物生长繁殖的温度、营养物质等条件。例例3 3：在锥形瓶中装入一定量液体培养基，接入：在锥形瓶中装入一定量液体培养基，接入N N0 0个乳酸菌之后密封，放在个乳酸菌之后密封，放在25250 0C C温箱中连续培温箱中连续培养若干小时，其间每养若干小时，其间每3030分钟测定一次菌数，测分钟测定一次菌数，测得数量变化曲线如图。请分析回答。得数量变化曲线如图。请分析回答。总总细菌数细菌数/个个 N0活细菌数活细菌数/个个培养时间培养时间/小时小时0 1 2 3 4 5 6 7 8（1 1）乳酸菌以）乳酸菌以_方式生殖方式生殖,这代表这代表_类生物普遍具有的生殖方式类生物普遍具有的生殖方式.分裂生殖分裂生殖 原核原核(2)(2)用用N N表示总菌数表示总菌数,N,N0 0表示初始菌表示初始菌数数,t,t表示增殖世代数表示增殖世代数,乳酸菌数量增乳酸菌数量增长的数字表达式为长的数字表达式为N=NN=N0 02 2t t.当在理想当在理想条件下条件下,乳酸菌每乳酸菌每3030分钟繁殖一代分钟繁殖一代,按上式算按上式算,当当N N0 0=1000=1000时时,连续培养连续培养5h,5h,总菌数总菌数_个个.10240001024000t=10N=1000210(3)(3)在实际培养条件下在实际培养条件下,乳酸菌增长速度与理想条件乳酸菌增长速度与理想条件下乳酸菌增长速度不同下乳酸菌增长速度不同,如果如果5h5h后活菌数的变化趋势后活菌数的变化趋势用曲线表示出来用曲线表示出来.造成菌群密度变化的外界因素是什造成菌群密度变化的外界因素是什么么?总总细菌数细菌数/个个 N0营养物质减少营养物质减少.代谢产物大量积累代谢产物大量积累.pH.pH发生改变。发生改变。(4)(4)培养基中不断产生的乳酸来自乳酸菌的培养基中不断产生的乳酸来自乳酸菌的_作用作用.(5)(5)实验过程中实验过程中,为什么要在为什么要在25250 0C C条件下进行条件下进行?无氧无氧呼吸呼吸25250 0C C时酶的催化效率最高时酶的催化效率最高.再见再见