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实实 验验 二二 酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验实实 验验 原原 理理1、酶促反应的特性：高效性、高特异性、高不稳定性、可调酶促反应的特性：高效性、高特异性、高不稳定性、可调节性。节性。v反应体系的条件必须严格控制。反应体系的条件必须严格控制。2、酶活性测定的基础是化学反应速度的比较，即酶催化的化、酶活性测定的基础是化学反应速度的比较，即酶催化的化学反应速度与无酶或酶失活情况下化学反应速度的比较。学反应速度与无酶或酶失活情况下化学反应速度的比较。v反应速度通常以测定单位时间内产物生成量或底物的减少量反应速度通常以测定单位时间内产物生成量或底物的减少量来确定。来确定。3、酶催化反应的典型曲线、酶催化反应的典型曲线是随着时间的延长，反是随着时间的延长，反应速度下降，由起初的应速度下降，由起初的直线变为曲线。直线变为曲线。测定酶活性的所有反应测定酶活性的所有反应速率的比较都必须依赖速率的比较都必须依赖该曲线的线性部分，因该曲线的线性部分，因此要测定最初反应速度，此要测定最初反应速度，即底物浓度变化在底物即底物浓度变化在底物起始浓度的起始浓度的5以内的以内的速度。速度。SSV VVmaxVmax4、实验对象：碱性磷酸酶（、实验对象：碱性磷酸酶（AKP）磷酸苯二钠磷酸苯二钠碱性磷酸酶碱性磷酸酶苯酚磷酸氢二钠苯酚磷酸氢二钠4-氨基安替比林氨基安替比林K3Fe（CN）6醌衍生物（红色）醌衍生物（红色）碱性条件碱性条件一、pH对酶促反应速度的影响v碱性磷酸酶（AKP）的最适pH值是10。二、温度对酶促反应速度的影响v碱性磷酸酶（AKP）的最适温度是37。三、底物浓度对酶促反应速度的影响碱性磷酸酶米氏常数的测定VmaxS Km+S 米米-曼氏（曼氏（Michaelis-Menten）方程：）方程：V VmaxmaxV VSSKKmmV Vmaxmax/2 /2 Lineweaver-bulk（林贝氏方林贝氏方程）方程：程）方程：+1/V=1/V=KKmmV Vmaxmax 1/V1/Vmax max 1/S 1/S 1/S 1/S 1/V 1/V -Km KKmm/V Vmm 操作：1、不同浓度基质液的配制：试剂管号（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）0.01 mol/L基质液（ml）011111123蒸馏水（ml）376543220混匀混匀。2、另取试管9支，做酶促反应：试剂管号123456789吸取上表稀释基质液1ml（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）pH10碳酸钠缓冲液（ml）0.90.90.90.90.90.90.90.90.9混匀，37 水浴保温5分钟左右。酶液（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1pH10碳酸钠缓冲液（ml）010/1610/1410/1210/1010/810/610/410/2 加入酶液后立即计时，各管混匀后在37 准确保温15分钟。3、保温结束，立即加入0.5mol/L NaOH 1.0 ml 以中止反应。4、各管分别加入0.3%4-氨基安替比林1.0 ml及0.5 铁氰化钾 2.0 ml，充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510 nm处比色。v酶活性计算及酶活性计算及Km值求取值求取1、在37C下保温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放的酚量（ug），以此计算处各管的酶活性（v）。2、以1/v为纵坐标、1/S为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值。Av1/v1/SKm？四、抑制剂对酶促反应的影响抑制剂抑制剂 无抑制剂无抑制剂 1/V 1/S 竞争性抑制作用竞争性抑制作用抑制剂抑制剂 1/V 1/S 无抑制剂无抑制剂 非竞争性抑制非竞争性抑制抑制剂抑制剂 1/V 1/S 无抑制剂无抑制剂 反竞争性抑制反竞争性抑制实验所用的抑制剂是磷酸氢二钠。实验所用的抑制剂是磷酸氢二钠。操作1、不同浓度基质液的配制：试剂管号（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）0.01 mol/L基质液（ml）011111123蒸馏水（ml）376543220混匀混匀。2、另取试管9支，做酶促反应：试剂管号123456789吸取上表稀释基质液1ml（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）0.04mol/L磷酸氢二钠（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1pH10碳酸钠缓冲液（ml）0.90.90.90.90.90.90.90.90.9混匀，37 水浴保温5分钟左右。酶液（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1pH10碳酸钠缓冲液（ml）010/1610/1410/1210/1010/810/610/410/2 加入酶液后立即计时，各管混匀后在37 准确保温15分钟。3、保温结束，立即加入0.5mol/L NaOH 1.0 ml 以中止反应。4、各管分别加入0.3%4-氨基安替比林1.0 ml及0.5 铁氰化钾 2.0 ml，充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510 nm处比色。v酶活性计算及酶活性计算及Km值求取值求取1、在37C下保温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放的酚量（ug），以此计算处各管的酶活性（v）。2、以1/v为纵坐标、1/S为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值，并判断该抑制剂属于何种类型。Av1/v1/SKm？该抑制剂为？该抑制剂为？注意事项：v配制的各种试剂及反应液必须混匀。v加酶液要准确快速，以保证各管酶促反应同时开始。v加入酶液后要立即计时，计时要准确。v0.3%4-氨基安替比林1.0 ml及0.5 铁氰化钾 2.0 ml要依次加入，充分混匀，放置10分钟，放置时间不可过长。