奥赛辅导-蛋白质概述.ppt

生物化学部分知识结构生物化学部分知识结构化学成分：化学成分：水、无机盐、糖类、脂类、水、无机盐、糖类、脂类、蛋白质、核酸、蛋白质、核酸、酶酶、维生素和辅酶、维生素和辅酶 细胞的代谢细胞的代谢异化作用：异化作用：糖的异化糖的异化、脂肪的异化、蛋白质的、脂肪的异化、蛋白质的 异化异化、核酸的异化、核酸的异化同化作用：同化作用：光合作用光合作用、多糖合成、脂类的合成等、多糖合成、脂类的合成等分子生物学：复制、转录、分子生物学：复制、转录、翻译翻译、调控、调控蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能第第 一一 章章一、什么是蛋白质一、什么是蛋白质?蛋蛋白白质质(protein)是是由由许许多多氨氨基基酸酸(amino acids)通通过肽键过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。相连形成的高分子含氮化合物。组成蛋白质的元素组成蛋白质的元素主要有主要有C、H、O、N和和S。有些蛋白质含有少量有些蛋白质含有少量磷磷或金属元素或金属元素铁、铜、锌、铁、铜、锌、锰、钴、钼锰、钴、钼，个别蛋白质还含有，个别蛋白质还含有碘碘。1 1、蛋白质的元素组成：、蛋白质的元素组成：氮氮的的含含量量在在多多种种的的蛋蛋白白质质比比较较接接近近，平平均均为为16%16%，因因此此用用凯凯氏氏（kjelahlkjelahl）法法定定N N，受受检检物物质质中中含含蛋蛋白白质质量量为为N N含含量量的的6.256.25倍倍 。蛋白质含量的测定：蛋白质含量的测定：凯氏定氮法凯氏定氮法(测定氮的经典方法测定氮的经典方法)优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单；优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单；缺点：易将无机氮缺点：易将无机氮,都归入蛋白质中都归入蛋白质中,不精确。不精确。样品含氮量平均在样品含氮量平均在16%，取其倒数，取其倒数100/16=6.25，即，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说元素氮，就说明含有明含有6.25g 蛋白质）；故：蛋白质）；故：蛋白质含量蛋白质含量=氮的量氮的量100/16一、氨基酸一、氨基酸 组成蛋白质的基本单位组成蛋白质的基本单位存存在在自自然然界界中中的的氨氨基基酸酸有有300余余种种，但但组组成成人体蛋白质的氨基酸仅有人体蛋白质的氨基酸仅有20种种.必需氨基酸和非必需氨基酸必需氨基酸和非必需氨基酸：必需氨基酸必需氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、蛋氨酸（甲硫氨酸）、色氨酸、赖氨苏氨酸、蛋氨酸（甲硫氨酸）、色氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸等酸、苯丙氨酸等8种。精氨酸和组氨酸为半必需种。精氨酸和组氨酸为半必需氨基酸。氨基酸。2 2、蛋白质的氨基酸组成、蛋白质的氨基酸组成（1 1）氨基酸的结构天然蛋白质中存在的氨基酸都是）氨基酸的结构天然蛋白质中存在的氨基酸都是L-a-L-a-氨基酸氨基酸 COOH|NH2 C H|R L-a-氨基酸 一种为脯氨酸脯氨酸，它也有类似结构，但侧链与氮原子相接形成亚氨基酸。除甘氨酸甘氨酸外，蛋白质中的氨基酸都具有不对称碳原子，都有L型与D一型之分，为区别两种构型构型，通过与甘油醛的构型相比较，人为地规定一种为L型，另种为D一型。当书写时NH2写在左边为L型，NH2在右为D一型。已知天然蛋白质中的氨基酸都属L型。1.非极性疏水性氨基酸（非极性疏水性氨基酸（7）甘丙缬亮异苯脯）甘丙缬亮异苯脯2.极性中性氨基酸（极性中性氨基酸（8）色丝酪半蛋天谷苏）色丝酪半蛋天谷苏3.酸性氨基酸（酸性氨基酸（2）天谷）天谷4.碱性氨基酸（碱性氨基酸（3）赖精组）赖精组（一）氨基酸的分类（一）氨基酸的分类（二）氨基酸的理化性质（二）氨基酸的理化性质1.两性解离及等电点两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离程度取决氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。于所处溶液的酸碱度。等电点等电点(isoelectric point,pI)在在某某一一pH的的溶溶液液中中，氨氨基基酸酸解解离离成成阳阳离离子子和和阴阴离离子子的的趋趋势势及及程程度度相相等等，成成为为兼兼性性离离子子，呈呈电电中中性性。此此时时溶溶液液的的pH值值称为该氨基酸的称为该氨基酸的等电点等电点。pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性离子氨基酸的兼性离子 阳离子移阳离子移向阴极向阴极阴离子移向阴离子移向阳极阳极2.紫外吸收紫外吸收 色氨酸（色氨酸（Trp W）、）、酪氨酸（酪氨酸（Try Y）的的最大吸收峰在最大吸收峰在 280 nm 附近。附近。大大多多数数蛋蛋白白质质含含有有这这两两种种氨氨基基酸酸残残基基，所所以以 测测 定定 蛋蛋 白白 质质 溶溶 液液280nm的的光光吸吸收收值值是是分分析析溶溶液液中中蛋蛋白白质质含含量量的的快速简便的方法。快速简便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收3.茚三酮反应茚三酮反应 氨氨基基酸酸与与茚茚三三酮酮水水合合物物共共热热，可可生生成成蓝蓝紫紫色色化化合合物物，其其最最大大吸吸收收峰峰在在570nm处处。由由于于此此吸吸收收峰峰值值与与氨氨基基酸酸的的含含量量存存在在正正比比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。氨基酸氨基酸 代谢库代谢库食物蛋白质食物蛋白质消化吸收消化吸收 组织组织蛋白质蛋白质分解分解 体内合成氨基酸体内合成氨基酸(非必需氨基酸非必需氨基酸)-酮酸酮酸 脱氨基作用脱氨基作用 酮 体氧化供能 糖胺胺 类类脱羧基作用脱羧基作用氨 尿素代谢转变代谢转变其它含氮化合物其它含氮化合物(嘌呤、嘧啶等嘌呤、嘧啶等)合成合成 氨基酸代谢概况氨基酸代谢概况一、氨基酸的脱氨基作用一、氨基酸的脱氨基作用脱氨基方式：脱氨基方式：氧化脱氨基氧化脱氨基 转氨基作用转氨基作用 联合脱氨基联合脱氨基 非氧化脱氨基非氧化脱氨基 转氨基和氧化脱氨基偶联转氨基和氧化脱氨基偶联转氨基和嘌呤核苷酸循环偶联转氨基和嘌呤核苷酸循环偶联（一）、氧化脱氨基作用（一）、氧化脱氨基作用 L-谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶+H2O+NH3NAD(P)NAD(P)+NAD(P)H+HNAD(P)H+H+COOHCOOHCHCH2 2CHCH2 2C=OC=OCOOHCOOHCOOHCOOHCHCH2 2CHCH2 2CH NHCH NH2 2COOHCOOH*L-谷氨酸脱氢酶：谷氨酸脱氢酶：活性强，分布于肝、肾及脑组织活性强，分布于肝、肾及脑组织 辅酶为辅酶为NADNAD+或或NADPNADP+专一性强，只作用于谷氨酸专一性强，只作用于谷氨酸（二）、转氨基作用（二）、转氨基作用(transamination)(transamination)特点：特点：*没有游离的氨产生，但改变了氨基酸代谢库中各种氨基没有游离的氨产生，但改变了氨基酸代谢库中各种氨基酸的比例。酸的比例。*大多数氨基酸可参与转氨基作用，但大多数氨基酸可参与转氨基作用，但赖氨酸、脯氨酸、赖氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸羟脯氨酸除外。除外。谷丙转氨酶谷丙转氨酶（GPTGPT）谷草转氨酶谷草转氨酶(GOT)(GOT)谷丙转氨酶（谷丙转氨酶（GPTGPT）和谷草转氨酶（）和谷草转氨酶（GOTGOT）氨基酸氨基酸 谷氨酸谷氨酸 -酮酸酮酸 -酮戊二酸酮戊二酸 H2O+NAD+转氨酶转氨酶 NH3+NADH+H+L-谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶 *此种方式既是氨基酸脱氨基的主要方式，也是体内合成此种方式既是氨基酸脱氨基的主要方式，也是体内合成非必需氨基酸非必需氨基酸的主要方式。的主要方式。*主要在肝、肾组织进行。主要在肝、肾组织进行。1 1、转氨基偶联氧化脱氨基作用转氨基偶联氧化脱氨基作用苹果酸苹果酸 腺苷酸腺苷酸代琥珀酸代琥珀酸次黄嘌呤次黄嘌呤 核苷酸核苷酸 (IMP)(IMP)腺苷酸代琥珀酸合成酶-酮戊酮戊 二酸二酸氨氨基基酸酸 谷氨酸谷氨酸-酮酸酮酸 转氨酶 1草酰乙酸草酰乙酸天冬氨酸天冬氨酸转氨酶 2腺苷酸脱氢酶H2ONH3延胡索酸延胡索酸腺嘌呤腺嘌呤核苷酸核苷酸(AMP)(AMP)2 2、转氨基偶联嘌呤核苷酸循环、转氨基偶联嘌呤核苷酸循环（二）、血氨的去路（二）、血氨的去路 在肝内合成尿素在肝内合成尿素 合成非必需氨基酸及其它含氮化合物合成非必需氨基酸及其它含氮化合物 合成谷氨酰胺合成谷氨酰胺 肾小管泌氨：肾小管泌氨：分泌的分泌的NHNH3 3酸性条件下生成酸性条件下生成NHNH4 4+，随尿排出。，随尿排出。谷氨酸谷氨酸 +NH3谷氨酰胺谷氨酰胺 谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺合成酶ATPADP+Pi尿素的生成尿素的生成1 1、生成部位：、生成部位：主要在肝细胞的主要在肝细胞的线粒体线粒体及及胞液胞液中。中。2 2、生成过程、生成过程 尿素的生成过程由尿素的生成过程由Hans Krebs Hans Krebs 和和Kurt Henseleit Kurt Henseleit 提出，称为提出，称为鸟氨酸循环鸟氨酸循环(orinithine cycle)(orinithine cycle)，又称，又称尿素尿素循环循环(urea cycle)(urea cycle)或或Krebs-HenseleitKrebs-Henseleit循环循环。鸟氨酸循环鸟氨酸循环2ADP+PiCO2+NH3+H2O氨基甲酰磷酸氨基甲酰磷酸2ATPN-乙酰谷氨酸乙酰谷氨酸Pi鸟氨酸鸟氨酸瓜氨酸瓜氨酸精氨酸精氨酸延胡索酸延胡索酸氨基酸氨基酸草酰乙酸草酰乙酸苹果酸苹果酸-酮戊酮戊 二酸二酸谷氨酸谷氨酸-酮酸酮酸精氨酸代精氨酸代 琥珀酸琥珀酸瓜氨酸瓜氨酸天冬氨酸天冬氨酸ATPAMP+PPiAMP+PPi鸟氨酸鸟氨酸尿素尿素线粒体胞 液*原料：原料：2 2 分子氨，一个来分子氨，一个来自于游离氨，另一个来自于游离氨，另一个来自自AspAsp（天冬氨酸天冬氨酸）；）；*过程：先在线粒体中进行，过程：先在线粒体中进行，再在胞液中进行；再在胞液中进行；*耗能：耗能：3 3 个个ATPATP，4 4 个高个高能磷酸键。能磷酸键。蛋白质的结构蛋白质的结构一级结构一级结构(1)组成蛋白质的多肽链数目组成蛋白质的多肽链数目.(2)多肽链的氨基酸顺序，多肽链的氨基酸顺序，(3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础是蛋白质生物功能的基础。蛋白质的结构蛋白质的结构二级结构二级结构-螺螺旋旋：多多肽肽链链中中氨氨基基酸酸残残基基以以1000的的角角度度围围绕绕螺螺旋旋轴轴心心盘盘旋旋上上升升，每每3.6个个残残基基就就旋旋转转一一圈圈，螺螺距距为为0.54nm；右右手手旋旋转转；多多肽肽链链内内的的氢氢键键由由肽肽链链中中一一个个肽肽键键的的-CO的的氧氧原原子子与与第第四四个个肽肽键键的的-NH的的氢氢原原子子组组成成，每每个个氢氢键键所所形形成成的的环环内内共共有有13个原子，这种螺旋称为个原子，这种螺旋称为3.613-折折叠叠：平平行行式式、反反平平行行式式。邻邻近近两两链链以以相相反反或或相相同同方方向向平平行行排排列列成成片片层层状状。两两个个氨氨基基酸酸残残基基之之间间的的轴轴心心距距离离为为0.35nm，-折折叠叠结结构构的的氢氢键键是是由由两两条条肽肽链链中中的的一一条条的的-CO基基与另一条与另一条-NH基之间所形成。基之间所形成。二级结构还有二级结构还有-转角、自由回转（无规卷曲）转角、自由回转（无规卷曲）蛋白质的结构蛋白质的结构三级结构：三级结构：是指多肽链在二级结构、超二级结构、结构域是指多肽链在二级结构、超二级结构、结构域的基础上，进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象的基础上，进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。在内的特征三维结构。四级结构：四级结构：是指由两是指由两 个或两个以上具有三级结构的个或两个以上具有三级结构的亚基亚基按一定方式聚合而成的特定构象的蛋白质分子。按一定方式聚合而成的特定构象的蛋白质分子。通常通常亚基亚基只有一条多肽链，但有的只有一条多肽链，但有的亚基由两条或多条多亚基由两条或多条多肽链组成肽链组成，这些多肽链间多以二硫键相连。亚基单独存在，这些多肽链间多以二硫键相连。亚基单独存在时无生物学活性。时无生物学活性。维系蛋白质一级结构的作用力：维系蛋白质一级结构的作用力：肽键、二硫键肽键、二硫键维系蛋白质二级结构的作用力：维系蛋白质二级结构的作用力：氢键氢键维系蛋白质三级结构的作用力：维系蛋白质三级结构的作用力：范德华力、盐键、氢键、疏水相互作用范德华力、盐键、氢键、疏水相互作用维系蛋白质四级结构的作用力：维系蛋白质四级结构的作用力：范德华力、盐键、范德华力、盐键、氢键、疏水键。其氢键、疏水键。其中疏水键是最主要的作用力。中疏水键是最主要的作用力。（一）蛋白质的两性电离（一）蛋白质的两性电离 一、理化性质一、理化性质 蛋蛋白白质质分分子子除除两两端端的的氨氨基基和和羧羧基基可可解解离离外外，氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链中中某某些些基基团团，在在一一定定的的溶溶液液pHpH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)当当蛋蛋白白质质溶溶液液处处于于某某一一pH时时，蛋蛋白白质质解解离离成成正正、负负离离子子的的趋趋势势相相等等，即即成成为为兼兼性性离离子子，净净电电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。蛋白质的蛋白质的盐溶盐溶、盐析盐析、变性和、变性和复性复性盐盐溶溶是是指指蛋蛋白白质质溶溶液液中中由由于于加加入入低低浓浓度度的的中中性性盐盐后后，使蛋白质溶解度增加的现象称为盐溶。使蛋白质溶解度增加的现象称为盐溶。盐盐析析是是指指高高浓浓度度中中性性盐盐可可使使蛋蛋白白质质分分子子脱脱去去水水化化层层并并中中和和其其电电荷荷而而使使蛋蛋白白质质从从溶溶液液中中凝凝集集出出来来的的现现象象叫叫做盐析。做盐析。蛋蛋白白质质的的变变性性作作用用是是指指天天然然蛋蛋白白质质分分子子由由于于受受到到物物理理或或化化学学因因素素的的影影响响使使次次级级键键破破坏坏，引引起起天天然然构构象象的的改改变变，导导致致生生物物活活性性的的丧丧失失及及一一些些理理化化性性质质的的改改变变，但但未未引引起起肽肽键键的的断断裂裂，这这种种现现象象叫叫做做蛋蛋白白质质的的变变性性作用。作用。蛋蛋白白质质的的复复性性是是指指当当变变性性因因素素除除去去后后，变变性性蛋蛋白白又又可可重新回复到天然构象，这一现象叫蛋白质的复性。重新回复到天然构象，这一现象叫蛋白质的复性。蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收由由于于蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有共共轭轭双双键键的的酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸，因因此此在在280nm波波长长处处有有特特征征性性吸吸收收峰峰。蛋蛋白白质质的的OD280与与其其浓浓度度呈呈正正比比关关系系，因因此此可作蛋白质定量测定。可作蛋白质定量测定。蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction)蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。三酮反应。双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双双缩脲反应缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。程度。蛋白质的分离提纯技术蛋白质的分离提纯技术 一、根据分子大小不同进行分离纯化一、根据分子大小不同进行分离纯化1 1、透析和超过滤、透析和超过滤 透析透析和超过滤都是利用蛋白质分子不能和超过滤都是利用蛋白质分子不能通过通过半透膜半透膜的性质，使蛋白质和其它小分的性质，使蛋白质和其它小分子物质分开。子物质分开。超过滤超过滤是利用是利用压力或离心力压力或离心力，强使水和，强使水和其它小分子溶液透过半透膜，而蛋白质留其它小分子溶液透过半透膜，而蛋白质留在膜上。在膜上。蛋白质的分离提纯技术蛋白质的分离提纯技术 二、根据溶解度差别的分离方法二、根据溶解度差别的分离方法1.1.等电点沉淀和等电点沉淀和PHPH值控制值控制 利用各种蛋白质在等电点时，溶解度最小这一利用各种蛋白质在等电点时，溶解度最小这一性质，可以通过调节蛋白质溶液的性质，可以通过调节蛋白质溶液的PHPH值，将不同值，将不同的蛋白质分开。的蛋白质分开。2.2.蛋白质盐溶或盐析蛋白质盐溶或盐析 中性盐在低浓度时，可以增加蛋白质的溶解度，中性盐在低浓度时，可以增加蛋白质的溶解度，这种现象叫盐溶。当溶液离子强度增加到一定数这种现象叫盐溶。当溶液离子强度增加到一定数值时，蛋白质的溶解度下降开始沉淀，这种现象值时，蛋白质的溶解度下降开始沉淀，这种现象叫盐析。叫盐析。蛋白质的分离提纯技术蛋白质的分离提纯技术 三、根据电荷不同的分离方法三、根据电荷不同的分离方法1.1.电泳电泳 在外界电场的影响下，如果蛋白质不处于等电点状在外界电场的影响下，如果蛋白质不处于等电点状态，它将向电极移动，这种现象称为电泳。纯化中应态，它将向电极移动，这种现象称为电泳。纯化中应用最多的是用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳和和等电聚焦电泳等电聚焦电泳，它，它们既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯度、制们既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯度、制备蛋白质。备蛋白质。2.2.层析层析 层析法是利用被分离样品混合物中各组分的化学性层析法是利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个质的差别，使各组分以不同程度分布在两个“相相”中，中，这两个相中的一个被固定在一定的支持介质上，成为这两个相中的一个被固定在一定的支持介质上，成为固定相，另一个是移动的，成为移动相。固定相，另一个是移动的，成为移动相。根据层析法的原理与方式的不同，层析法有根据层析法的原理与方式的不同，层析法有分配层分配层析析、吸附层析吸附层析、离子交换层析离子交换层析、亲和层析亲和层析等不同类别。等不同类别。