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Lecture 5Sterilization（灭菌）（灭菌）灭菌的概念灭菌的概念所谓灭菌，是指用物理或化学方法杀灭或所谓灭菌，是指用物理或化学方法杀灭或物料或设备中一切有生命物质的过程物料或设备中一切有生命物质的过程培养基灭菌、气体除菌、设备及管道灭菌培养基灭菌、气体除菌、设备及管道灭菌灭菌的方法灭菌的方法化学灭菌：化学灭菌：常用的化学药剂有甲醛、氯（次氯酸常用的化学药剂有甲醛、氯（次氯酸钠）、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐、臭氧钠）、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐、臭氧射线灭菌：射线灭菌：利用紫外线、高能电磁波或放射性物利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的质产生的 射线进行灭菌。射线进行灭菌。紫外线：紫外线：穿透力低，仅用于表面消毒和空气消毒。穿透力低，仅用于表面消毒和空气消毒。微波灭菌微波灭菌 射线灭菌射线灭菌灭菌的方法灭菌的方法干热灭菌：干热灭菌：常用的干热条件为在常用的干热条件为在160160下保温下保温1 1小小时，不如湿热灭菌有效，一些要求保持干燥的实时，不如湿热灭菌有效，一些要求保持干燥的实验器具和材料等可以用干热灭菌。验器具和材料等可以用干热灭菌。湿热灭菌：湿热灭菌：利用饱和水蒸汽进行灭菌。蒸汽有很利用饱和水蒸汽进行灭菌。蒸汽有很强的穿透力，且在冷凝时放出大量冷凝热，易使强的穿透力，且在冷凝时放出大量冷凝热，易使蛋白质凝固而杀灭各种微生物。培养基、发酵设蛋白质凝固而杀灭各种微生物。培养基、发酵设备与管理的灭菌以及实验器材的灭菌，普遍采用备与管理的灭菌以及实验器材的灭菌，普遍采用湿热灭菌。湿热灭菌。121,20-30min121,20-30min湿热灭菌比干热灭菌更有效湿热灭菌比干热灭菌更有效p细菌蛋白质在有水的情况下易于凝固变性细菌蛋白质在有水的情况下易于凝固变性p湿热穿透力强湿热穿透力强p湿热蒸气有潜热存在，水蒸气凝固成水释放潜热，迅速提湿热蒸气有潜热存在，水蒸气凝固成水释放潜热，迅速提高被灭菌物体的温度高被灭菌物体的温度灭菌的方法灭菌的方法过滤除菌：过滤除菌：利用过滤方法截留微生物，达利用过滤方法截留微生物，达到除菌的目的。适用于澄清流体的除菌：到除菌的目的。适用于澄清流体的除菌：空气、热敏性培养基组分；产品提取也可空气、热敏性培养基组分；产品提取也可利用无菌过滤处理料液，获得无菌产品。利用无菌过滤处理料液，获得无菌产品。过滤除菌过滤除菌灭菌的方法灭菌的方法火焰灭菌法火焰灭菌法物理方法：物理方法：超高静压等超高静压等 培养基的湿热灭菌培养基的湿热灭菌对数残留定律：对培养基进行湿热灭菌时，培养对数残留定律：对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比。量成正比。在一定温度下，微生物受热后，其死活细胞个数在一定温度下，微生物受热后，其死活细胞个数的变化如化学反应的浓度变化一样，其热死速率的变化如化学反应的浓度变化一样，其热死速率可以分子反应速率来表示，即微生物个数减少的可以分子反应速率来表示，即微生物个数减少的速率与任一瞬间残存的菌数成正比。速率与任一瞬间残存的菌数成正比。-dN/dt=kN N：培养基中活微生物的个数；：培养基中活微生物的个数；t：为微生物受热时间，：为微生物受热时间，s；k：为比死亡速率，：为比死亡速率，s-1培养基的湿热灭菌培养基的湿热灭菌t=2.303/K t-活菌数在受热过程中减少到原菌数的活菌数在受热过程中减少到原菌数的1/10时所需的时间时所需的时间 温度对温度对k的影响遵循阿仑尼乌斯定律的影响遵循阿仑尼乌斯定律k=Ae-E/RTA为系数，为系数，s-1;E为活化能，为活化能，J/mol;R为气体常数，为气体常数，8.314J/(mol K)；T为绝对温度，为绝对温度，K培养基的湿热灭菌培养基的湿热灭菌 对细菌芽孢来说，并不始终符合对数残留规律，对细菌芽孢来说，并不始终符合对数残留规律，通常必要的灭菌条件是通常必要的灭菌条件是110-130110-130，5-20min5-20min，一，一般为般为121121，20-30min20-30min。培养基的湿热灭菌培养基的湿热灭菌培养基热灭菌时，不仅微生物会死亡，培培养基热灭菌时，不仅微生物会死亡，培养基的一些热敏性物质也会因受热而破坏：养基的一些热敏性物质也会因受热而破坏：糖溶液会焦化变色、蛋白质变性、维生素糖溶液会焦化变色、蛋白质变性、维生素失活、醛糖与氨基化合物反应等失活、醛糖与氨基化合物反应等-dc/dt=kdcc为对热敏性物质的浓度；为对热敏性物质的浓度；kd为分解速率常数为分解速率常数培养基的湿热灭菌培养基的湿热灭菌温度对温度对kd的影响也遵循阿仑尼乌斯定律的影响也遵循阿仑尼乌斯定律kd=Ae-E/RT由于微生物的由于微生物的E比维生素高，因此一般都采比维生素高，因此一般都采用高温短时加热的方式，可以达到彻底灭菌用高温短时加热的方式，可以达到彻底灭菌和把营养分的破坏减少到最低限度的目的和把营养分的破坏减少到最低限度的目的分批灭菌分批灭菌分批灭菌：分批灭菌：将配制好的培养基放在发酵罐或其它窗将配制好的培养基放在发酵罐或其它窗口中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操口中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。作过程，也称实罐灭菌。优点：优点：无需专门的灭菌设备，设备投资少，灭菌效无需专门的灭菌设备，设备投资少，灭菌效果可靠，对蒸汽要求低（果可靠，对蒸汽要求低（0.20.3MPa）缺点：缺点：灭菌温度低、时间长而对培养基成分破坏大，灭菌温度低、时间长而对培养基成分破坏大，操作难于实现自动控制。操作难于实现自动控制。连续灭菌连续灭菌连续灭菌：连续灭菌：以以“高温、快速高温、快速”为特征的连续灭菌，为特征的连续灭菌，是将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热、是将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程，也称之为连消。保温、降温的灭菌过程，也称之为连消。优点：优点：对培养基破坏小，可以实现自动控制、提对培养基破坏小，可以实现自动控制、提高发酵罐的设备利用率、蒸汽用量高发酵罐的设备利用率、蒸汽用量缺点：缺点：蒸汽的要求较高，一般不小于蒸汽的要求较高，一般不小于0.45MPa，同时需要一组附加调和，设备投资大同时需要一组附加调和，设备投资大空气的除菌空气的除菌压缩压缩冷却冷却减湿减湿过滤过滤自然界自然界的空气的空气无菌无菌空气空气进入发酵罐的进入发酵罐的空气温度可比空气温度可比培养温度高培养温度高10103030进入过滤器进入过滤器之前，空气之前，空气的相对湿度的相对湿度7070压缩空气的压缩空气的洁净度要达洁净度要达到到100100级级空气的除菌空气的除菌发酵用无菌空气的质量标准发酵用无菌空气的质量标准：100100级是指每立方米空气中，尘埃粒子数最级是指每立方米空气中，尘埃粒子数最大允许值大允许值 0.50.5m m的为的为3500,3500,的为的为0 0；微生物；微生物最大允许数为最大允许数为5 5个浮游菌个浮游菌/m/m3 3，1 1个沉降菌个沉降菌/m/m3 3空气的过滤除菌空气的过滤除菌按过滤介质孔隙将空气过滤器分为两类按过滤介质孔隙将空气过滤器分为两类第一类为绝对过滤，第一类为绝对过滤，介质孔隙小于被拦截的微生介质孔隙小于被拦截的微生物大小，如用聚四氟乙烯或者纤维素枉费材料做物大小，如用聚四氟乙烯或者纤维素枉费材料做成的微孔滤膜成的微孔滤膜空气的过滤除菌空气的过滤除菌第二类为深层过滤，第二类为深层过滤，介质孔介质孔隙大于被拦截的微生物大小隙大于被拦截的微生物大小但介质层有一定的厚度，机但介质层有一定的厚度，机理是静电、扩散、惯性及拦理是静电、扩散、惯性及拦截作用，如棉花过滤器、超截作用，如棉花过滤器、超细纤维纸、石棉滤板、金属细纤维纸、石棉滤板、金属烧结管烧结管发酵废气废物的安全处理发酵废气废物的安全处理排气经碱液处理后排向大气排气经碱液处理后排向大气若发酵染菌，则应经过灭菌处理后排放若发酵染菌，则应经过灭菌处理后排放