5中药制剂分析课件.ppt

第五章中药制剂中各类化学成分分析中药制剂中各类化学成分分析药物分析教研室第一节第一节 生物碱类成分分析生物碱类成分分析一、一、概述概述 生物碱是生物界除生物体必须的含氮化合生物碱是生物界除生物体必须的含氮化合物（如氨基酸、蛋白质和物（如氨基酸、蛋白质和B B族维生素等）之外族维生素等）之外的所有含氮有机化合物，因其结构中氮原子上的所有含氮有机化合物，因其结构中氮原子上的未共享电子对而大多具有碱性。的未共享电子对而大多具有碱性。生物碱绝大多数具有显著的生物活性，且生物碱绝大多数具有显著的生物活性，且活性是多方面的，因此中药制剂中有含有生物活性是多方面的，因此中药制剂中有含有生物碱类成分的中药时，常选择该中药含有的生物碱类成分的中药时，常选择该中药含有的生物碱成分作为定性定量的依据。碱成分作为定性定量的依据。二、二、结构特征和理化性质结构特征和理化性质（一）结构特征（一）结构特征 生物碱大多由生物碱大多由C C、H H、N N、O O元素组成，极少数元素组成，极少数分子中尚含有其他元素；大多结构复杂，结构类分子中尚含有其他元素；大多结构复杂，结构类型较多，主要有杂环类、大环类、萜类、甾类及型较多，主要有杂环类、大环类、萜类、甾类及有机胺类等。有机胺类等。结构中的氮原子有多种形式：脂氮、芳氮；结构中的氮原子有多种形式：脂氮、芳氮；季胺、叔胺、仲胺及伯胺；游离状态和与酸结合季胺、叔胺、仲胺及伯胺；游离状态和与酸结合状态；还有以氮氧配位键形式存在的。状态；还有以氮氧配位键形式存在的。此外，结构中除烷烃、羟基取代外还有羧基、此外，结构中除烷烃、羟基取代外还有羧基、酚羟基等酸性官能团及酯键的取代。酚羟基等酸性官能团及酯键的取代。（二）理化性质（二）理化性质1 1、物理性状、物理性状 多数生物碱为结晶型固体，少数为无定型粉末，多数生物碱为结晶型固体，少数为无定型粉末，还有一些小分子生物碱为液体，例如槟榔碱、菸还有一些小分子生物碱为液体，例如槟榔碱、菸碱等；液体状的生物碱及个别小分子生物碱尚有碱等；液体状的生物碱及个别小分子生物碱尚有挥发性甚至升华性，如麻黄碱具有挥发性、咖啡挥发性甚至升华性，如麻黄碱具有挥发性、咖啡因具有升华性等。因具有升华性等。一般生物碱为无色或白色，但结构中具有较一般生物碱为无色或白色，但结构中具有较长共轭体系，并有助色团的，可显不同颜色。长共轭体系，并有助色团的，可显不同颜色。生物碱结构中如有手性碳原子或为手性分子生物碱结构中如有手性碳原子或为手性分子的具有旋光性，并大多与生物碱的生理活性有关，的具有旋光性，并大多与生物碱的生理活性有关，通常左旋体比右旋体生理活性强。通常左旋体比右旋体生理活性强。2.2.溶解性溶解性 由于生物碱结构复杂，生物碱的溶解性也是多样化。由于生物碱结构复杂，生物碱的溶解性也是多样化。大多数生物碱成分极性较小，游离状态下难溶于水，大多数生物碱成分极性较小，游离状态下难溶于水，易溶氯仿、乙醚、乙醇、丙酮及苯等有机溶剂，易溶氯仿、乙醚、乙醇、丙酮及苯等有机溶剂，与酸结合生成生物碱盐后水溶性增加，但与生物碱结与酸结合生成生物碱盐后水溶性增加，但与生物碱结合的酸不同，生成的盐水溶性也有差异，一般含氧无机酸合的酸不同，生成的盐水溶性也有差异，一般含氧无机酸及小分子有机酸的生物碱盐水溶性较大。及小分子有机酸的生物碱盐水溶性较大。季铵型生物碱、有氮氧配位键的生物碱易溶于水，季铵型生物碱、有氮氧配位键的生物碱易溶于水，液体生物碱及一些小分子固体生物碱则既溶于水也可液体生物碱及一些小分子固体生物碱则既溶于水也可溶于有机溶剂。溶于有机溶剂。含有酸性官能团或酯键的生物碱还可溶于一些碱液或含有酸性官能团或酯键的生物碱还可溶于一些碱液或热苛性碱液。热苛性碱液。此外一些液体状态的生物碱和分此外一些液体状态的生物碱和分子量较小的固体生物碱，如麻黄碱等子量较小的固体生物碱，如麻黄碱等具有挥发性。具有挥发性。因此，以中药制剂中的生物碱为因此，以中药制剂中的生物碱为指标性成分或特征性组分测定时，要指标性成分或特征性组分测定时，要注意结合生物碱成分的不同情况采用注意结合生物碱成分的不同情况采用相应的提取分离及净化方法进行前处相应的提取分离及净化方法进行前处理。理。3.3.沉淀反应沉淀反应 大多数生物碱在酸性水溶液中可以与某些大多数生物碱在酸性水溶液中可以与某些试剂生成不溶于水的复盐或分子复合物，这些试试剂生成不溶于水的复盐或分子复合物，这些试剂称生物碱沉淀试剂。剂称生物碱沉淀试剂。生物碱的沉淀试剂根据其组成有碘化物复生物碱的沉淀试剂根据其组成有碘化物复盐、重金属盐和大分子酸三大类。盐、重金属盐和大分子酸三大类。生物碱的沉淀反应可以检查中药制剂中生生物碱的沉淀反应可以检查中药制剂中生物碱的存在，当某些沉淀试剂与生物碱生成的沉物碱的存在，当某些沉淀试剂与生物碱生成的沉淀组成恒定时，还可以用于中药制剂中生物碱成淀组成恒定时，还可以用于中药制剂中生物碱成分的含量测定。分的含量测定。但须注意的是中药水浸出液中尚有蛋白质、但须注意的是中药水浸出液中尚有蛋白质、多肽和鞣质等成分，也可与生物碱沉淀试剂生成多肽和鞣质等成分，也可与生物碱沉淀试剂生成沉淀，产生假阳性从而导致错误结论。沉淀，产生假阳性从而导致错误结论。因此，用此反应进行中药制剂中生因此，用此反应进行中药制剂中生物碱成分的分析时，要用适宜的方法先物碱成分的分析时，要用适宜的方法先行处理样品供试液，排除干扰。行处理样品供试液，排除干扰。常用的生物碱沉淀试剂有常用的生物碱沉淀试剂有碘碘碘化碘化钾钾、碘化铋钾碘化铋钾、碘化汞钾碘化汞钾、磷钼酸磷钼酸、磷磷钨酸钨酸、苦味酸苦味酸、硫氰酸铬酸硫氰酸铬酸及及四苯硼钠四苯硼钠等。等。4 4显色反应显色反应|生物碱与一些浓无机酸为主的试剂反应产生物碱与一些浓无机酸为主的试剂反应产生不同的颜色，这些呈色反应多用于检识和区生不同的颜色，这些呈色反应多用于检识和区别纯品生物碱，而较少用于中药制剂中生物碱别纯品生物碱，而较少用于中药制剂中生物碱成分的分析。成分的分析。|生物碱在一定生物碱在一定pHpH条件下可与一些酸性染料条件下可与一些酸性染料（多为磺酸肽类）生成有色络合物，可被氯仿（多为磺酸肽类）生成有色络合物，可被氯仿等有机溶剂定量提出；等有机溶剂定量提出；|还有些结构中具有酯键的酯碱如乌头碱等还有些结构中具有酯键的酯碱如乌头碱等可与异羟肟酸铁试剂反应产生紫红色，这些特可与异羟肟酸铁试剂反应产生紫红色，这些特点可用于中药制剂中生物碱成分的分析。点可用于中药制剂中生物碱成分的分析。5 5碱性碱性 大多数生物碱呈碱性反应，能使红色石蕊试纸变蓝。大多数生物碱呈碱性反应，能使红色石蕊试纸变蓝。生物碱之所以能显碱性，是因为它们分子中氮原子上的孤生物碱之所以能显碱性，是因为它们分子中氮原子上的孤电子对对质子有一定程度的亲和力，因而表现出碱性。电子对对质子有一定程度的亲和力，因而表现出碱性。6 6紫外光谱特征紫外光谱特征 结构中具有共轭体系的生物碱均有紫外吸收，其中包结构中具有共轭体系的生物碱均有紫外吸收，其中包括结构母核即为共轭体系的和只有部分结构为共轭系统的。括结构母核即为共轭体系的和只有部分结构为共轭系统的。紫外光谱的吸收峰位置除与其他化合物一样与共轭系紫外光谱的吸收峰位置除与其他化合物一样与共轭系统中助色团的种类、位置、数量有关外，需要特别指出的统中助色团的种类、位置、数量有关外，需要特别指出的是，结构中的氮原子与发色团直接连接或参与发色团的生是，结构中的氮原子与发色团直接连接或参与发色团的生物碱，其吸收峰位置还与测定时溶剂的物碱，其吸收峰位置还与测定时溶剂的pHpH有关。有关。三、供试液制备三、供试液制备 进行中药制剂中生物碱成分分析时，制备样进行中药制剂中生物碱成分分析时，制备样品供试液可根据不同情况选用乙醇、甲醇、酸水品供试液可根据不同情况选用乙醇、甲醇、酸水以及碱化后直接用有机溶剂等溶剂提取，而后进以及碱化后直接用有机溶剂等溶剂提取，而后进行净化除去干扰成分，净化的方法主要有溶剂法、行净化除去干扰成分，净化的方法主要有溶剂法、沉淀法及氧化铝吸附色谱法等。沉淀法及氧化铝吸附色谱法等。一般要根据：一般要根据：分析目的物分析目的物是总碱还是单体生物碱；是总碱还是单体生物碱；主要生物碱的性质主要生物碱的性质是水溶性生物碱还是是水溶性生物碱还是脂溶性生物碱、是强碱还是弱碱等；脂溶性生物碱、是强碱还是弱碱等；欲使用的分析方法欲使用的分析方法经典的化学法、分光经典的化学法、分光光度法还是色谱法等因素选择溶剂和方法。光度法还是色谱法等因素选择溶剂和方法。四、四、定性鉴别定性鉴别 目前，用于中药制剂中生物碱成分定目前，用于中药制剂中生物碱成分定性鉴别的方法主要有性鉴别的方法主要有沉淀法沉淀法、薄层色谱法薄层色谱法、气相色谱法气相色谱法及及高效液相色谱法高效液相色谱法。其中沉淀法和薄层色谱法为中国药其中沉淀法和薄层色谱法为中国药典（典（20052005版）收载方法。版）收载方法。（一）一般理化鉴别（一）一般理化鉴别 沉淀反应是生物碱理化鉴别常用方法，主沉淀反应是生物碱理化鉴别常用方法，主要利用生物碱能与一些试剂生成沉淀这一特要利用生物碱能与一些试剂生成沉淀这一特性。此反应一般在酸性水溶液中进行。性。此反应一般在酸性水溶液中进行。由于中药制剂中成分复杂，有些成分如蛋由于中药制剂中成分复杂，有些成分如蛋白质、多肽和鞣质等也可与试剂生成沉淀而白质、多肽和鞣质等也可与试剂生成沉淀而造成假阳性结果，造成假阳性结果，因此，制备样品供试液时必须净化处理，因此，制备样品供试液时必须净化处理，除去干扰成分，方能用沉淀反应进行中药制除去干扰成分，方能用沉淀反应进行中药制剂中生物碱类成分的鉴别剂中生物碱类成分的鉴别.（二）色谱鉴别（二）色谱鉴别1 1薄层色谱法薄层色谱法 薄层色谱具有分离和鉴定双重作用，对于成分薄层色谱具有分离和鉴定双重作用，对于成分复杂的中药制剂用薄层色谱法进鉴别，可得到满复杂的中药制剂用薄层色谱法进鉴别，可得到满意的、可靠的鉴别效果。意的、可靠的鉴别效果。F 吸附剂吸附剂:硅胶或氧化铝薄层色谱，硅胶或氧化铝薄层色谱，F 展开剂展开剂:多用氯仿、苯等低极性溶剂多用氯仿、苯等低极性溶剂,加入其化溶剂调加入其化溶剂调整展开剂的极性整展开剂的极性.F 由于硅胶显弱酸性由于硅胶显弱酸性,强碱性的生物碱在硅胶色谱板上能强碱性的生物碱在硅胶色谱板上能形成盐形成盐,使使RfRf值很小或拖尾值很小或拖尾,形成复斑形成复斑.F 在硅胶吸附薄层色谱中在硅胶吸附薄层色谱中,常用碱性系统或在碱性环境下常用碱性系统或在碱性环境下展开展开.F 显色剂显色剂:常用改良碘化铋钾试剂常用改良碘化铋钾试剂,有时喷碘化铋钾试剂有时喷碘化铋钾试剂之后再喷硝酸钠试剂之后再喷硝酸钠试剂,可使样品斑点更加清晰可使样品斑点更加清晰.F 亦可用碘蒸气、硫酸铈、碘铂酸等其化的试剂显色亦可用碘蒸气、硫酸铈、碘铂酸等其化的试剂显色.2 2纸色谱法纸色谱法 纸色谱法可用于生物碱盐或游离碱的纸色谱法可用于生物碱盐或游离碱的鉴别，主要是以水为固定相的正相纸层析，鉴别，主要是以水为固定相的正相纸层析，分离效果常取决于流动相的性质。分离效果常取决于流动相的性质。中药制剂中生物碱纸色谱的显色剂基中药制剂中生物碱纸色谱的显色剂基本和薄层色谱法的相同，但含硫酸的试剂本和薄层色谱法的相同，但含硫酸的试剂不适用。不适用。五、含量测定五、含量测定 生物碱成分含量测定的方法早期常生物碱成分含量测定的方法早期常用酸碱滴定法、沉淀法等经典的化学方用酸碱滴定法、沉淀法等经典的化学方法法.近年多采用分光光度法、薄层色谱近年多采用分光光度法、薄层色谱法及高效液相色谱法等法及高效液相色谱法等.（一）总生物碱含量测定（一）总生物碱含量测定化学分析法化学分析法z主要使用酸碱滴定法主要使用酸碱滴定法;z强碱滴定生物碱盐时强碱滴定生物碱盐时,在在70%-90%70%-90%的乙醇介质的乙醇介质中终点比在水中明显中终点比在水中明显,因此常将生物碱盐溶于因此常将生物碱盐溶于90%90%乙醇乙醇,再用标准碱乙醇液滴定再用标准碱乙醇液滴定.z若选择的溶剂及指示终点方法合适若选择的溶剂及指示终点方法合适,还可用非还可用非水滴定法进行水滴定法进行.分光光度法分光光度法 分光光度法分光光度法1 1、直接测定、直接测定 不经过化学反应不经过化学反应,利用生物碱物质利用生物碱物质自身的光吸收直接进行比色测定的方自身的光吸收直接进行比色测定的方法法;一般用于药味较少、干扰不大的一般用于药味较少、干扰不大的中药制剂中总生物碱的含量测定中药制剂中总生物碱的含量测定;2 2、离子对萃取比色法、离子对萃取比色法酸性染料比色法酸性染料比色法应用本法的关键在于介质的应用本法的关键在于介质的pHpH、酸性染料的种类和有机、酸性染料的种类和有机溶剂的选择溶剂的选择;常用的酸性染料有甲基橙、溴麝香草酚兰（常用的酸性染料有甲基橙、溴麝香草酚兰（BTBBTB）和溴）和溴甲酚绿等甲酚绿等;pHpH的选择要根据染料的性质及生物碱的碱性的选择要根据染料的性质及生物碱的碱性(pKapKa)大小大小来确定来确定;选择有机溶剂的原则是根据离子对与有机相能否形成氢选择有机溶剂的原则是根据离子对与有机相能否形成氢键以及形成氢键能力的强弱而定键以及形成氢键能力的强弱而定.氯仿、二氯甲烷与离子对形成氢键氯仿、二氯甲烷与离子对形成氢键,有中等程度的提取有中等程度的提取率率,且选择性也较好且选择性也较好,故是常故是常 用的提取溶剂用的提取溶剂.l苦味酸盐比色法苦味酸盐比色法 在弱酸性或中性溶液中生物碱可与苦味酸定量生成苦在弱酸性或中性溶液中生物碱可与苦味酸定量生成苦味酸盐沉淀味酸盐沉淀,该沉淀可溶于氯仿等有机溶剂该沉淀可溶于氯仿等有机溶剂,也可以在碱也可以在碱性条件下解离释放出生物碱和苦味酸性条件下解离释放出生物碱和苦味酸.l雷氏盐比色法雷氏盐比色法 雷氏盐雷氏盐(NH4Cr(NH3)2(SCN)4H2O)(NH4Cr(NH3)2(SCN)4H2O)在酸性介质中可在酸性介质中可与生物碱类成分定量地生成难溶于水的有色络合物与生物碱类成分定量地生成难溶于水的有色络合物.l 异羟肟酸铁比色法异羟肟酸铁比色法 含有酯键结构的生物碱含有酯键结构的生物碱,在碱性介质中加热在碱性介质中加热,酯健水解酯健水解,产生的羧基与羟胺反应生成异羟肟酸产生的羧基与羟胺反应生成异羟肟酸,再与再与Fe3+Fe3+生成紫红生成紫红色的配合物色的配合物(异羟肟酸铁异羟肟酸铁),),在一定浓度下符合在一定浓度下符合BeerBeer定律定律,可用比色法进行含量测定可用比色法进行含量测定.（二）单体生物碱的含量测定（二）单体生物碱的含量测定1 1、薄层色谱法、薄层色谱法 生物碱不具有紫外吸收或挥发性时可用本生物碱不具有紫外吸收或挥发性时可用本法测定法测定.选用的吸附剂、展开剂及显色方法与鉴别选用的吸附剂、展开剂及显色方法与鉴别相似相似,但要求比鉴别严格但要求比鉴别严格.使用改良碘化铋钾等作为显色剂时使用改良碘化铋钾等作为显色剂时,必须完必须完全挥干展开剂后全挥干展开剂后(尤其在碱性环境下展开时尤其在碱性环境下展开时)才可喷洒才可喷洒,否则背景深否则背景深,反差小反差小,影响测定影响测定.2 2、高效液相色谱法、高效液相色谱法u 以反相高效液相色谱应用较多以反相高效液相色谱应用较多;u 在反相高效液相色谱中在反相高效液相色谱中,由于硅胶表面残留硅由于硅胶表面残留硅醇基的影响醇基的影响,使生物碱分析易产生保留时间延长、使生物碱分析易产生保留时间延长、峰形变宽、拖尾峰形变宽、拖尾.u 可采取改进流动相、固定相等措施以克服游可采取改进流动相、固定相等措施以克服游离硅醇基的影响离硅醇基的影响,满足定量定量分析的要求满足定量定量分析的要求.u 中药制剂中生物碱成分时行高效液相色谱法中药制剂中生物碱成分时行高效液相色谱法测定时测定时,使用较多的是紫外检测器使用较多的是紫外检测器.3 3、气相色谱法、气相色谱法 只适用于有挥发性的、遇热不分解的生物只适用于有挥发性的、遇热不分解的生物碱类碱类;生物碱盐在急速加热过程中产生的酸对色生物碱盐在急速加热过程中产生的酸对色谱柱和检测器不利谱柱和检测器不利,应该注意应该注意;制备供试品溶液时一般应采用冷提取制备供试品溶液时一般应采用冷提取,净净化过程也要避免加热化过程也要避免加热,以防成分流失以防成分流失,最后需最后需用氯仿等低极性有机溶剂为溶媒制备成供试用氯仿等低极性有机溶剂为溶媒制备成供试液液.（三）常见生物碱成分分析（三）常见生物碱成分分析 中药制剂中含有生物碱成分的中药制剂中含有生物碱成分的中药较多，含有的生物碱成分也很中药较多，含有的生物碱成分也很复杂，但作为定性定量的指标性成复杂，但作为定性定量的指标性成分。分。第二节第二节 黄酮类成分分析黄酮类成分分析一、概述一、概述 黄酮类化合物（黄酮类化合物（flavonoidsflavonoids）是广泛存在）是广泛存在于自然界的一大类化合物。多具有颜色，在植于自然界的一大类化合物。多具有颜色，在植物体内大部分与糖结合成苷，一部分以游离形物体内大部分与糖结合成苷，一部分以游离形式存在。黄酮在藻类、菌类中很少发现；苔藓式存在。黄酮在藻类、菌类中很少发现；苔藓植物中大都含有；蕨类植物比较普遍存在；裸植物中大都含有；蕨类植物比较普遍存在；裸子植物中也含有但类型较少；黄酮类化合物最子植物中也含有但类型较少；黄酮类化合物最集中的是被子植物，类型最全，结构最复杂，集中的是被子植物，类型最全，结构最复杂，含量也高。由这些中药参与配伍的中药制剂也含量也高。由这些中药参与配伍的中药制剂也较多见。较多见。二、结构特征及理化性质二、结构特征及理化性质（一）结构特征（一）结构特征 黄酮类化合物是指基本母核为黄酮类化合物是指基本母核为2-2-苯基色原酮类化合物，苯基色原酮类化合物，现在则是泛指两苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系现在则是泛指两苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物。在植物体内大部分与糖结合成苷，一部分以游列化合物。在植物体内大部分与糖结合成苷，一部分以游离形式存在。离形式存在。根据基本结构又可分为黄酮、黄酮醇、双黄酮、异黄根据基本结构又可分为黄酮、黄酮醇、双黄酮、异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查耳酮、橙酮、花青素、黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查耳酮、橙酮、花青素、黄烷等类型。烷等类型。多数黄酮结构中存在有桂皮酰基及苯甲酰基组成的交多数黄酮结构中存在有桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共轭体系，故在叉共轭体系，故在200-400nm200-400nm波长区域内有强烈的吸收带，波长区域内有强烈的吸收带，此是光谱法及色谱此是光谱法及色谱光谱法分析的基础。光谱法分析的基础。大多黄酮及其苷类含有游离酚羟基，可与聚酰胺形成大多黄酮及其苷类含有游离酚羟基，可与聚酰胺形成氢键，可用聚酰胺色谱法进行分析。氢键，可用聚酰胺色谱法进行分析。（二）理化性质（二）理化性质1 1、物理性状、物理性状 黄酮类化合物多为晶性固体，少数（如黄酮类化合物多为晶性固体，少数（如黄酮苷）为无定形粉末。黄酮苷）为无定形粉末。游离的苷元中，除二氢黄酮、二氢黄酮游离的苷元中，除二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇有旋光性外，其余则无。醇、黄烷及黄烷醇有旋光性外，其余则无。苷类由于在结构中引入糖的分子，故均有旋苷类由于在结构中引入糖的分子，故均有旋光性，且多为左旋。光性，且多为左旋。2 2、溶解度、溶解度 黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态（苷或苷元，单糖苷、双糖苷或三糖苷）态（苷或苷元，单糖苷、双糖苷或三糖苷）不同而有很大差异。不同而有很大差异。游离苷元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、游离苷元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中。中。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，但难溶或不溶于苯、氯仿等。极性溶剂中，但难溶或不溶于苯、氯仿等。3 3、酸碱性、酸碱性 酸性：酸性：黄酮类化合物因分子中多有酚羟基，黄酮类化合物因分子中多有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。及二甲基甲酰胺中。碱性碱性氧原子的性质氧原子的性质 黄酮类化合物分子中黄酮类化合物分子中-吡喃酮环上的吡喃酮环上的1-1-位位氧原子，因有未共用的电子对，故表现出微弱氧原子，因有未共用的电子对，故表现出微弱的碱性，可与强无机酸，如浓硫酸、盐酸等生的碱性，可与强无机酸，如浓硫酸、盐酸等生成盐，常表现出特殊的颜色，可用于鉴别。成盐，常表现出特殊的颜色，可用于鉴别。生成的盐极不稳定，加水后即可分解。生成的盐极不稳定，加水后即可分解。4 4、显色反应、显色反应W还原反应：与盐酸还原反应：与盐酸镁粉（或锌粉）反应，镁粉（或锌粉）反应，W金属盐类试剂的络合反应：黄酮类化合物分子金属盐类试剂的络合反应：黄酮类化合物分子中多有下列结构，故常可与铝盐、铅盐、锆盐、中多有下列结构，故常可与铝盐、铅盐、锆盐、镁盐等试剂反应，生成有色络合物。镁盐等试剂反应，生成有色络合物。铝盐：铝盐：常用试剂为常用试剂为1%1%三氯化铝或硝酸铝溶液。三氯化铝或硝酸铝溶液。生成的络合物多为黄色（生成的络合物多为黄色（maxmax=415nm=415nm）,并有荧并有荧光，可用于定性及定量分析。光，可用于定性及定量分析。铅盐：铅盐：常用常用1%1%醋酸铅及碱式醋酸铅水溶液，醋酸铅及碱式醋酸铅水溶液，可生成黄至红色沉淀。据此不仅可用于鉴定，也可生成黄至红色沉淀。据此不仅可用于鉴定，也可用于提取及分离工作。可用于提取及分离工作。锆盐：锆盐：多用多用2%2%二氯氧化锆甲醇溶液。黄酮类二氯氧化锆甲醇溶液。黄酮类化合物分子中有游离的化合物分子中有游离的3-3-或或5-OH5-OH存在时，均可反存在时，均可反应生成黄色的锆络合物。但两种锆络合物对酸的应生成黄色的锆络合物。但两种锆络合物对酸的稳定性不同，当反应液中接着加入枸橼酸后，稳定性不同，当反应液中接着加入枸橼酸后，5-5-羟基黄酮的黄色溶液显著褪色，而羟基黄酮的黄色溶液显著褪色，而3-3-羟基黄酮溶羟基黄酮溶液的呈鲜黄色（锆液的呈鲜黄色（锆枸橼酸反应）。枸橼酸反应）。5 5、紫外光谱特征、紫外光谱特征R 黄酮类由于具有黄酮类由于具有2-2-苯基色原酮的基本结构，苯基色原酮的基本结构，具有特定的紫外吸收峰，常有两个较强的吸收具有特定的紫外吸收峰，常有两个较强的吸收带，带，I I带在带在300400nm300400nm范围内，它是由于范围内，它是由于B B环桂环桂皮酰基引起的，皮酰基引起的，带为带为240285nm240285nm范围内，它范围内，它是由于是由于A A环上的苯甲酰基引起的。环上的苯甲酰基引起的。R 黄酮类化合物当加入一些位移试剂如甲醇黄酮类化合物当加入一些位移试剂如甲醇钠、醋酸钠、氯化铝等，可使最大吸收波长发钠、醋酸钠、氯化铝等，可使最大吸收波长发生位移，选择性提高，还可消除杂质的干扰，生位移，选择性提高，还可消除杂质的干扰，有利于含量测定。有利于含量测定。三、定性鉴别三、定性鉴别（一）显色反应（一）显色反应 黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基及及-吡喃酮环有关。吡喃酮环有关。常用盐酸常用盐酸-镁粉（或锌粉）反应镁粉（或锌粉）反应 与金属盐类试剂的配合反应与金属盐类试剂的配合反应 黄酮类化合物分子中有游离的黄酮类化合物分子中有游离的3-OH3-OH、5-OH5-OH或邻或邻二酚羟基时可与二酚羟基时可与Al3+Al3+、Zr4+Zr4+、Pb2+Pb2+、Sr2+Sr2+等形成络等形成络合物，这些络合物有的产生荧光或颜色加深（如合物，这些络合物有的产生荧光或颜色加深（如Al3+Al3+、Zr4+Zr4+），有的产生沉淀（如），有的产生沉淀（如Pb2+Pb2+、Sr2+Sr2+）（二）色谱鉴别（二）色谱鉴别吸附剂：硅胶、聚酰胺；吸附剂：硅胶、聚酰胺；硅胶色谱分离弱极性化合物较好；硅胶色谱分离弱极性化合物较好；聚酰胺色谱他离含游离酚羟游离羟基的黄酮聚酰胺色谱他离含游离酚羟游离羟基的黄酮及其苷为佳；及其苷为佳；纤维素薄层则适用于分离多糖苷混合物；纤维素薄层则适用于分离多糖苷混合物；显色反应：采用在紫外光下观察荧光和喷显显色反应：采用在紫外光下观察荧光和喷显色剂相配合的方法。色剂相配合的方法。四、黄酮类成分定量分析四、黄酮类成分定量分析 中药制剂中如含有黄酮类成分，可根据要求中药制剂中如含有黄酮类成分，可根据要求测定制剂中的总黄酮含量、黄酮类单体成分的含测定制剂中的总黄酮含量、黄酮类单体成分的含量或二者同时测定。量或二者同时测定。直接测定直接测定:黄酮类化合物具有特定的紫外吸收峰黄酮类化合物具有特定的紫外吸收峰,含黄酮含黄酮类化合物的原料药及部分制剂经一定的提取纯化类化合物的原料药及部分制剂经一定的提取纯化后后,可直接于最大吸收波长处测定其吸收度可直接于最大吸收波长处测定其吸收度,以芦以芦丁等为对照品计算其含量丁等为对照品计算其含量.显色测定显色测定:黄酮类化合物显色以后显色物与背景最大吸黄酮类化合物显色以后显色物与背景最大吸收波长差别较大收波长差别较大,可消除背景可消除背景(即阴性空白即阴性空白)的干扰的干扰,以提高本法的选择性及灵敏度以提高本法的选择性及灵敏度.常用铝盐作显色试常用铝盐作显色试剂剂.（二）黄酮类单体成分的含量测定（二）黄酮类单体成分的含量测定1 1、薄层色谱法、薄层色谱法=样品经有机溶剂或水提取后，可用硅胶、纤样品经有机溶剂或水提取后，可用硅胶、纤维素或聚酰胺进行层析，达到分离目的。维素或聚酰胺进行层析，达到分离目的。=层析后可将含有待测组分的色斑刮下，再用层析后可将含有待测组分的色斑刮下，再用适当的溶剂洗脱后，用紫外适当的溶剂洗脱后，用紫外-可见分光光度法测可见分光光度法测定。定。=更常用的是薄层扫描仪（单波长或双波长法）更常用的是薄层扫描仪（单波长或双波长法）直接在薄层板上扫描测定。直接在薄层板上扫描测定。2 2、高效液相色谱法、高效液相色谱法 由于黄酮类化合物在紫外区有较强的吸由于黄酮类化合物在紫外区有较强的吸收，使用收，使用HPLCHPLC法检测灵敏度较高，故该法在法检测灵敏度较高，故该法在黄酮类单体成分的定量分析中最常用。黄酮类单体成分的定量分析中最常用。黄酮类成分的黄酮类成分的HPLCHPLC条件他为正相和反相条件他为正相和反相色谱两类，反相色谱应用较多。色谱两类，反相色谱应用较多。反相色谱测定多有反相色谱测定多有C18C18键合相固定液，流键合相固定液，流动相常用甲醇动相常用甲醇-水水-乙酸（或磷酸缓冲液）及乙酸（或磷酸缓冲液）及乙腈乙腈-水。检测器主要采用紫外检测器或荧光水。检测器主要采用紫外检测器或荧光检测器。检测器。第三节第三节 三萜皂苷类成分分析三萜皂苷类成分分析 一、概述一、概述 三萜是由三萜是由3030个碳原子组成的萜类化合物，个碳原子组成的萜类化合物，大多数三萜化合物均可看作由大多数三萜化合物均可看作由6 6个异戊二烯单个异戊二烯单位联结而成。位联结而成。游离三萜类化合物通常多不溶于水，而与游离三萜类化合物通常多不溶于水，而与糖结合成苷后，则大多可溶于水，振摇后可生糖结合成苷后，则大多可溶于水，振摇后可生成胶体溶液，并有持久性似肥皂溶液的泡沫，成胶体溶液，并有持久性似肥皂溶液的泡沫，故有三萜皂苷之称。故有三萜皂苷之称。二、理化性质二、理化性质溶解度溶解度v 可溶于水，易溶于热水、含水稀醇、热甲醇可溶于水，易溶于热水、含水稀醇、热甲醇和热乙醇中，几乎不溶于或难溶于乙醚、苯等和热乙醇中，几乎不溶于或难溶于乙醚、苯等极性小的有机溶剂。极性小的有机溶剂。v 在含水丁醇或戊醇中溶解度较好，且又能与在含水丁醇或戊醇中溶解度较好，且又能与水分成二相，可利用此性质从水溶液中用正丁水分成二相，可利用此性质从水溶液中用正丁醇或戊醇提取皂苷，借以与亲水性的糖、蛋白醇或戊醇提取皂苷，借以与亲水性的糖、蛋白质等分离。质等分离。v 三萜皂苷元能溶于石油醚、苯、乙醚、氯仿三萜皂苷元能溶于石油醚、苯、乙醚、氯仿等有机溶剂，而不溶于水。等有机溶剂，而不溶于水。显色反应显色反应 醋酐醋酐-浓硫酸反应（浓硫酸反应（Liebermann-Liebermann-BurchardBurchard反应）；反应）；五氯化锑反应五氯化锑反应(KahlenbergKahlenberg反应反应)；三氯醋酸反应三氯醋酸反应(Rosen-(Rosen-HeimerHeimer反应反应)；冰醋酸冰醋酸-乙酰氯反应乙酰氯反应(TschugaeffTschugaeff反反应应)；氯仿氯仿-浓硫酸反应浓硫酸反应(SalkowskiSalkowski反应反应)。三、定性鉴别：三、定性鉴别：理化鉴别理化鉴别 泡沫反应：多用于检验含有皂苷的原料药；泡沫反应：多用于检验含有皂苷的原料药；化学显色反应：仅在组成药物较少的中药制剂中使用。化学显色反应：仅在组成药物较少的中药制剂中使用。薄层色谱法薄层色谱法 由于皂苷类成分大多无明显的紫外吸收，故经薄层色由于皂苷类成分大多无明显的紫外吸收，故经薄层色谱分离，然后选用适当的显色剂显色观察，是皂苷定性鉴谱分离，然后选用适当的显色剂显色观察，是皂苷定性鉴别中最常用的方法。别中最常用的方法。三萜皂苷类成分进行薄层层析时通常采用硅胶为吸附三萜皂苷类成分进行薄层层析时通常采用硅胶为吸附剂，也有采用氧化铝、硅藻土等为吸附剂。剂，也有采用氧化铝、硅藻土等为吸附剂。薄层层析后，可选用三氯醋酸、氯磺酸薄层层析后，可选用三氯醋酸、氯磺酸-醋酸、醋酸、50%50%及及10%10%硫酸乙醇液、三氯化锑、磷钼酸、浓硫酸硫酸乙醇液、三氯化锑、磷钼酸、浓硫酸-醋酸酐、碘醋酸酐、碘蒸气等显色剂进行显色，其中以不同浓度的硫酸乙醇液为蒸气等显色剂进行显色，其中以不同浓度的硫酸乙醇液为最常用。最常用。四、三萜皂苷类成分的定量分析四、三萜皂苷类成分的定量分析 中药制剂中皂苷类成分的定量分析可分为中药制剂中皂苷类成分的定量分析可分为总皂总皂苷测定苷测定、皂苷元测定皂苷元测定和和单体皂苷测定单体皂苷测定。（一）总皂苷的含量测定（一）总皂苷的含量测定 1 1、提取分离、提取分离 总皂苷的含量测定一般需要用适当的溶剂提取。总皂苷的含量测定一般需要用适当的溶剂提取。由于皂苷在极性溶剂中溶解度较大，因此提取溶剂由于皂苷在极性溶剂中溶解度较大，因此提取溶剂可为各种浓度的甲醇（可为各种浓度的甲醇（70%-95%70%-95%）、乙醇、异丙醇、）、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇。丁醇、戊醇。提取后经分离得到总皂苷成分，分离可用有机提取后经分离得到总皂苷成分，分离可用有机溶剂，如水饱和的正丁醇萃取，溶剂，如水饱和的正丁醇萃取，也可用大孔吸附树脂处理后溶剂洗脱。也可用大孔吸附树脂处理后溶剂洗脱。2 2、测定方法、测定方法重量法重量法J 该方法主要用于含皂苷的原料药质量控制。该方法主要用于含皂苷的原料药质量控制。J 在中药制剂中，如处方中药味含皂苷类成分较在中药制剂中，如处方中药味含皂苷类成分较多时，常用正丁醇作溶剂，测定正丁醇浸出物。多时，常用正丁醇作溶剂，测定正丁醇浸出物。比色法比色法J 常用三萜皂苷显色剂有香草醛常用三萜皂苷显色剂有香草醛-硫酸、香草醛硫酸、香草醛-高氯酸、醋酐高氯酸、醋酐-硫酸、高氯酸、浓硫酸以及亚甲蓝硫酸、高氯酸、浓硫酸以及亚甲蓝等。等。J 用比色法测定中药制剂中总皂苷或总苷元的含用比色法测定中药制剂中总皂苷或总苷元的含量时，可选用单体皂苷或皂苷元作对照品，但要注量时，可选用单体皂苷或皂苷元作对照品，但要注意测定单体皂苷或皂苷元与总皂苷的换算系数。意测定单体皂苷或皂苷元与总皂苷的换算系数。（二）皂苷元的含量测定（二）皂苷元的含量测定皂苷元的获得：皂苷元的获得：得到总皂苷后，加酸（如硫酸、盐酸）加得到总皂苷后，加酸（如硫酸、盐酸）加热水解，得到皂苷元；热水解，得到皂苷元；将样品先行水解，再用有机溶剂从水解后将样品先行水解，再用有机溶剂从水解后的溶液中提取皂苷元。的溶液中提取皂苷元。测定方法：主要有薄层色谱法、高效液相测定方法：主要有薄层色谱法、高效液相色谱法和比色法。色谱法和比色法。(三三)三萜皂苷类单体成分含量测定三萜皂苷类单体成分含量测定1 1、薄层色谱法、薄层色谱法 样品经适当的提取、纯化后，用薄层色谱法分离，样品经适当的提取、纯化后，用薄层色谱法分离，可排除其他组分的干扰，常用于测定中药制剂中的皂苷可排除其他组分的干扰，常用于测定中药制剂中的皂苷元或单体皂苷，定量方法可采用薄层洗脱元或单体皂苷，定量方法可采用薄层洗脱比色法或薄比色法或薄层扫描法。层扫描法。2 2、高效液相色谱法、高效液相色谱法 大多数三萜皂苷类成分，如人参皂苷、三七皂苷等大多数三萜皂苷类成分，如人参皂苷、三七皂苷等可利用其在紫外区的末端吸收来检测，但灵敏度相对要可利用其在紫外区的末端吸收来检测，但灵敏度相对要低。低。若中药制剂中所含三萜皂苷类成分本身具有较强的若中药制剂中所含三萜皂苷类成分本身具有较强的紫外吸收，如甘草酸、远志皂苷等，可用紫外吸收，如甘草酸、远志皂苷等，可用HPLCHPLC分离并用分离并用紫外检测器检测。紫外检测器检测。蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（ELSDELSD）用于高效液相色谱法检）用于高效液相色谱法检测三萜皂苷类成分的应用日渐广泛。测三萜皂苷类成分的应用日渐广泛。第四节第四节 醌类成分分析醌类成分分析一、概述一、概述 中药中醌类化合物主要有苯醌、萘醌、菲中药中醌类化合物主要有苯醌、萘醌、菲醌和蒽醌四种类型。醌和蒽醌四种类型。其中以蒽醌类化合物最为多见，包括蒽醌其中以蒽醌类化合物最为多见，包括蒽醌及其不同还原程度的产物和二聚物，如蒽酚、及其不同还原程度的产物和二聚物，如蒽酚、氧化蒽酚、蒽酮、二蒽酮、二蒽醌等。氧化蒽酚、蒽酮、二蒽酮、二蒽醌等。这些化合物在中药中可游离存在，也可与这些化合物在中药中可游离存在，也可与糖结合成苷，称为蒽苷。糖结合成苷，称为蒽苷。二、结构特征及理化性质二、结构特征及理化性质（一）结构类型及特征（一）结构类型及特征苯醌类苯醌类 苯醌类化合物从结构上可分为邻苯醌及对苯醌类化合物从结构上可分为邻苯醌及对苯醌两大类。因前者不稳定，故天然存在的苯醌两大类。因前者不稳定，故天然存在的苯醌化合物多为对苯醌的衍生物，且在醌核苯醌化合物多为对苯醌的衍生物，且在醌核上多有上多有-OH-OH、-OCH3-OCH3、-CH3-CH3等基团或更长的烃等基团或更长的烃类侧链。类侧链。对苯醌对苯醌 邻苯醌邻苯醌 2 2、萘醌类、萘醌类 萘醌化合物从结构上考虑可以有萘醌化合物从结构上考虑可以有(1,4)(1,4)、(1,2)(1,2)及及amphi(2,6)amphi(2,6)三种类型。但迄今为止从自然界得到的几乎均为三种类型。但迄今为止从自然界得到的几乎均为-萘醌类。萘醌类。-（1 1，4 4）萘醌）萘醌 -（1 1，2 2）萘醌）萘醌 amphi-(2,6)amphi-(2,6)萘醌萘醌 3 3、菲醌类、菲醌类天然菲醌衍生物包括邻醌（天然菲醌衍生物包括邻醌（A A）及对醌（）及对醌（B B）两种）两种类型。类型。（A）（B）4 4、蒽醌类、蒽醌类 蒽醌类成分包括蒽醌衍生物及其不同还原程度的产蒽醌类成分包括蒽醌衍生物及其不同还原程度的产物，如氧化蒽酚、蒽酚、蒽酮及蒽酮的二聚物等。物，如氧化蒽酚、蒽酚、蒽酮及蒽酮的二聚物等。蒽醌蒽醌 氧化蒽酚氧化蒽酚 蒽酮蒽酮 蒽酚蒽酚理化性质理化性质1 1、溶解性、溶解性8 苯醌及萘醌多以游离状态存在；而蒽醌类苯醌及萘醌多以游离状态存在；而蒽醌类则往往结合成苷存在于植物体中；则往往结合成苷存在于植物体中；8 游离的醌类多具有升华性；游离的醌类多具有升华性；8 小分子的苯醌及萘醌类具有挥发性，能随小分子的苯醌及萘醌类具有挥发性，能随水蒸气蒸馏，可据此进行提取、精制工作。水蒸气蒸馏，可据此进行提取、精制工作。8 游离醌类多溶于乙醇、乙醚、苯、氯