痛风宁颗粒治疗痛风的药效学实验研究.pdf

痛风宁颗粒治疗痛风的药效学实验研究痛风宁颗粒治疗痛风的药效学实验研究专业：中医骨伤科学研究生：刘晓平导师：苏友新副教授中文摘要背景：痛风(g o u t)是一组嘌呤代谢紊乱致尿酸生成增多和或尿酸排泄减少所引起的一组疾病，其临床特点为高尿酸血症(h y p e r u r i c e m i a)及由此引发的痛风性急性关节炎反复发作、痛风石沉积、痛风石性慢性关节炎和关节畸形，常累及肾脏引起慢性间质性肾炎和尿酸性肾结石形成。随着我国人民生活水平的提高，饮食结构的改变，痛风的发病率有明显上升的趋势，对人民的健康已构成潜在的威胁。目前痛风的西药治疗都是对症处理，不利于整体治疗，且西药有诸多毒副作用及不良反应。传统中医药治疗痛风具有许多优势，可以进行全身调节，标本兼治，防治并举，临床和实验研究均显示有较好的疗效，且无明显毒副反应。因此研究防治痛风的中药制剂意义重大。“痛风宁颗粒”课题组前期研究发现痛风宁颗粒具有较好抗炎、消肿、活血、镇痛、降低黄嘌呤氧化酶活性及降血尿酸、尿素氮、肌酐等作用，临床疗效好且无明显毒副作用。本课题是在前期研究基础上，规范制剂工艺，参考中华人民共和国卫生部药政局1 9 9 3 年颁布新药临床前研究指导原则汇编(药学、药理学、毒理学)中规定的有关痛风药效学的研究方法规范进行痛风宁颗粒临床前的药效学研究，为该药的中药新药报批打下基础。目的：通过本课题研究完成痛风宁颗粒中药新药申报规定的临床前药效学研究，为该药的中药新药报批打下基础。方法：1 通过对大、小鼠高尿酸血症模型的实验研究观察痛风宁颗粒对血尿酸代谢的影响：2 通过对二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型、尿酸钠致大鼠足跖肿胀模型的实验研究观察痛风宁颗粒的消肿作用；3 通过对尿酸钠致新西兰兔痛风性关节炎模型的实验研究观察痛风宁颗粒对痛风性关节炎症的影响。结果：1 小鼠高尿酸血症模型：痛风宁高、中剂量组与模型对照组比较有非常湿著性差异(尸以0 1)，痛风宁低剂量组与模型对照组比较有显著性差异(尸以0 5)，痛风宁高、中剂量组与正常对照组比较无显著性差异(现0 5)，痛风宁低剂量组与证常对照组比祸建中医学院硕十学位论文较有非常显著性差异(P g O 0 1)；大鼠高尿酸血症模型：痛风宁高、中剂量组与模型对照组比较有非常显著性差异(尸以0 1)，痛风宁低剂量组与模型对照组比较无显著性差异(现0 5)，痛风宁高、中剂量组与正常对照组比较无显著性差异(侈口0 5)，痛风宁低剂量组与正常对照组比较有非常显著性差异(尸以刃)；2 小鼠耳廓肿胀模型：痛风宁高、中剂量组与正常对照组比较有非常显著性差异(p 汜们)，痛风宁低剂量组与正常对照组比较无显著性差异(砂现0 5)；大鼠足跖肿胀模型：造模后各组大鼠足跖肿胀明显，肿胀度均呈上升趋势，4 h 时各组肿胀度达到峰值，随后呈下降趋势，故选造模后4 h 时肿胀度进行评价能有效反映药物的消肿作用。4 h 时：痛风宁高、中剂量组与模型对照组比较有非常显著性差异(p 以们)，痛风宁低剂量组与模型对照组比较无显著性差异(侈现0 5)，痛风宁高、中剂量组与正常对照组比较无显著性差异(侈统彻，痛风宁低剂量组与正常对照组比较有非常显著性差异(P 4 0 0 1)；3 新西兰兔痛风性关节炎模型：关节液中性粒细胞数：痛风宁高、中剂量组与模型对照组比较有非常显著性差异(P 4 0 0 1)，痛风宁低剂量组与模型对照组比较无显著性差异(陟现0 5)，痛风宁高、中、低剂量组与正常对照组比较有非常显著性差异(尸以0 1)；关节液I L lf 3 值：痛风宁高、中剂量组与模型对照组比较有显著性差异(尸汜0 5)，痛风宁低剂量组与模型对照组比较无显著性差异(玖彻，痛风宁高、中剂量组与正常对照组比较无显著性差异(9)0 0 5)，痛风宁低剂量组与正常对照组比较有非常显著性差异(P 4 0 刃)；关节液T N F d 值：痛风宁高、中剂量组与模型对照组比较有非常显著性差异(P g O 们)，痛风宁低剂量组与模型对照组比较无显著性差异(现卿，痛风宁高、中剂量组与正常对照组比较无显著性差异(侈现卿，痛风宁低剂量组与正常对照组比较有非常显著性差异(舰0 1)；滑膜组织病理：正常对照组：滑膜组织正常，滑膜细胞排列规则，无中性粒细胞浸润；模型对照组：滑膜组织明显水肿，滑膜细胞排列不规则，大量中性粒细胞浸润；痛风宁高剂量组：滑膜组织轻度水肿，滑膜细胞排列尚规则，少量中性粒细胞浸润；痛风宁中剂量组：滑膜组织轻度水肿，滑膜细胞增生排列尚规则，少量中性粒细胞浸润；痛风宁低剂量组：滑膜组织中度水肿，滑膜细胞排列不规则，较多中性粒细胞浸润；结论：1 痛风宁颗粒对大、小鼠高尿酸血症模型具有降低血尿酸作用，高、中剂量组作用更强；2 痛风宁颗粒对小鼠耳廓肿胀模型、大鼠足跖肿胀模型具有消肿作用，高、中剂量组作用更强；3 痛风宁颗粒通过降低关节液中性粒细胞数、关节液I L-11 3、T N F Q 含量、改善关节滑膜组织水肿、滑膜细胞排列、中性粒细胞浸润等方而达到对新西兰兔痛风性关节炎模型的抗炎作用，高、中剂量组作用更强。关键词：痛风中医药疗法高尿酸瓶症中医药疗法抗痛风药(中药)药理学中性粒细胞尿酸血液4 白细胞介素l 肿瘤坏死因子a 痫风宁颗粒2痈风j 颗粒治疗痛风的药效学实验研究痛风宁颗粒治疗痛风的药效学实验研究专业：中医骨伤科学研究生：刘晓平导师：苏友新副教授1 上j L刖百痛风(g o u t)川是一组嘌呤代谢紊乱致尿酸生成增多和或尿酸排泄减少所引起的一组疾病，其临床特点为高尿酸血症(h y p e r u r i c e m i a)及由此引发的痛风性急性关节炎反复发作、痛风石沉积、痛风石性慢性关节炎和关节畸形，常累及肾脏引起慢性问质性肾炎和尿酸肾结石形成。随着我国人民生活水平的提高，饮食结构的改变，痛风的发病率有明显上升的趋势，对人民的健康已构成潜在的威胁心刮。目前痛风的西药治疗都是对症处理。西医认为痛风的治疗目的p 1 是：(1)迅速终止痛风性关节炎的急性发作；(2)预防痛风性关节炎的发生；(3)预防和治疗尿酸盐沉积于关节和肾实质引起的损害；(4)预防尿酸性肾结石的形成；(5)防止和治疗高血压、高血脂、肥胖等痛风易发因素。并将痛风治疗的药物大约分为四类；(1)作用于急性痛风性关节炎的药物，如秋水仙碱、非甾体抗炎药中的保泰松、消炎痛、双氯灭痛、布洛芬以及萘普生等；(2)促进尿酸排泄的药物如水杨酸类、丙磺舒、苯磺唑酮、痛风利仙、碱性药物等；(3)抑制尿酸生成的药物如别嘌呤醇：(4)具有双重作用的药物如乙酰苯磺酰环已脲、降脂酰胺等。其他还有针对急性痛风性关节炎症状的治疗，如局部关节封闭等。在具体痛风的西药治疗方面，存在诸多毒副作用及不良反应阳叫，如：秋水仙碱在治疗时常有恶心、呕吐、腹泻等副作用，大剂量使用可引起骨髓抑制，肝细胞破坏及神经毒性，长期应用还能引起精子减少，伸舌样白痴，躯体畸形等，再加上中老年痛风患者还常伴有高m 压、糖尿病、高脂血症、冠心病、脂肪肝等，亦大大限制了对秋水仙碱的用量及使用时间；丙磺舒在应用时也会出现胃肠道反应、皮疹、发热等，治疗的初期还常使痛风加重或出现转移性急性痛风性关节炎发作；别嘌I 岭醇应用除了有发热、皮疹等外，还会出现严重的肝肾损害，抑制胃髓，上消化道出血；痛风N 4 i h 有腹泻、肾绞痛和诱发急性痛风性关节炎发作等不良反应。再者，目前我国使用的一些痛风药物依赖进口，价格较昂贵，故急需发掘一些新的有效、安全、副作用少的药物。课题来源：本课题受“福建省科技厅科技攻关(三项)重点课题：中药乏类新药痛风j 颗粒剂的研制歹1=发，编号：2 0 0 3 Y 0 2 3”项目经费资助。5http:/ 内经，属祖幽医学中“痹证”、“历节”、“白虎风”、“脚气”、“痛风”等证的范畴。现代中医多认为痛风的发病机制主要与湿浊、痰瘀、热毒等蕴结体内有关，辨证论治根据患者实际情况而进行，故临床报道的分型也囚人各异n 2 删。现一般按照国家中医药管理局1 9 9 5 年颁布实施痛风证候分型，分为四利，证候类型进行辨证论治n 引，即湿热蕴结、瘀热阻滞、痰浊阻滞和肝肾阴虚。传统中医药治疗痛风具有许多优势，可以进行全身调节，标本兼治，防治并举，有诸多临床和实验研究报道均有较好的疗效，且无明显毒副作用。但中医药治疗痛风的研究，目前多偏临床病案报道，实验研究不多，关于作用机理及对照实验研究方面的报道较少，系统中药新药开发研究的更少。痛风宁颗粒是在我院许书亮教授3 0 多年来治疗痛风经验方的基础上，结合现代痛风临床学与现代药理学研究结论，针对课题组调查的痛风发病时“湿热瘀浊、痹阻肢节”的证候特点，精心择苍术、萆薜、土茯苓等组方而成的，具有清化湿浊、祛瘀通络、活血止痛之功效。本课题组前期研究n 铲别发现痛风宁颗粒具有较好抗炎、消肿、活血、镇痛、降低黄嘌岭氧化酶活性及降赴尿酸、尿素氮、肌酐等作用，临床疗效好且无明显毒副作用。本课题是在前期研究基础上，规范制剂工艺，参考中华人民共和国卫生部药政局1 9 9 3 年7 月颁布新药临床前研究指导原则汇编(药学、药理学、毒理学)中规定的有关痛风药效学的研究方法嘲进行规范的痛风宁颗粒临床前的药效学研究，为该药的中药新药报批打下基础。6http:/ 动物：清洁级昆明种小鼠7 0 只，雄性，2 0 9 _ 2 9，上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号：S C X K(沪)2 0 0 3-0 0 0 3。福建中医学院实验动物中心饲养，医学实验动物环境设施合格证号：医动字第2 3 0 1 4 号。2 药物：痛风宁颗粒：福州辰星药业有限公司加工制备，批号0 6 1 0 2 4，每克含生药0 7 5 9，9 9 包；痛风利仙：德国赫曼大药厂(H e u m a n nP C SG m b H)生产，进口药品注册证号H 2 0 0 5 0 4 3 2，批号0 6 0 3 1 4 6，江苏省昆山龙灯瑞迪制药有限公司分装销售，国药准字j 2 0 0 4 0 0 0 l，分装批号0 6 0 9 0 1，5 0 m g 片；别嘌呤醇：江苏方强制药厂，国药准字H 2 0 0 3 3 6 8 3，批号2 0 0 6 0 1 2 2，l O O m g 片；黄嘌呤(X a n t h i n e)：国药集团化学试剂有限公司，批号W L 2 0 0 6 1 2 1 0；血尿酸检测试剂盒：上海荣盛生物技术有限公司，批号2 0 0 6 11 1 3。3 主要仪器：全自动生化仪A U 2 7 0 0同本O L Y M P U S 公司(二)实验方法1 昆明种小鼠进实验室后随机分为七组，即正常对照组、模型对照组、痛风宁高剂量组、痛风宁中剂量组、痛风宁低剂量组、痫风利仙组和别嘌呤醇组，每组1 0 只，称重并编号；2 适应性喂养1 W 后，各组分别灌胃给予蒸馏水、蒸馏水、痛风宁颗粒高剂量混悬液(相当生药1 6 9 6 0 m t)、痛风宁颗粒中剂量混悬液(相当生药8 9 6 0 m 1)、痛风宁颗粒低剂量混悬液(相当生药4 9 6 0 m 1)、痛风利仙混悬液(2 0 m g 6 0 m 1)、别嘌呤醇混悬液(1 2 0 m g 6 0 m 1)；均按体重0 3 m l l O g 灌胃，每天2 次，连续3 天；3 末次灌胃后1 h，用l m l 注射器币常对照组腹腔注射生理盐水0 1 m l l O g，其余六组腹腔注射1 0 黄嘌呤混悬液0 1 m l l O g 进行造模，0 5 h 后用摘眼球法取血，送福建省中医药研究院检测m 尿酸值。4 血尿酸检测：血样本3 0 0 0 r p m 离-5,1 5 m i n，取m L 清，采用氰化酶法按试剂盒测定方法检测。5 数据统计处理：数据以均数(茹标准差(S)表示，应用S P S S1 2 0 进行统计学分析处理，行F 榆验及q 检验。7http:/ 痛风宁颗粒对小鼠高尿酸血症模型血尿酸的影响(n=l O，i s)注：表示与正常对照组比较有显著性差异P(00 5；表示与正常对j c【组比较有非常显著性差异P Oo l；表示与模型对照组比较有显著性差异P O0 5：表示与模型对j 组比较有非常显著性差异P(00 1。下同表1 及图l 显示：各实验组小鼠血尿酸值均升高，模型对照组与正常对照组比较有非常显著性差异(户 口0 1)表明小鼠高尿酸血症模型成功；痛风利仙组、别噤岭醇组与模型对照组比较有非常显著性差异(尺移0 1)，与正常对照组比较无显著性差异(丹n0 5)。表明痛风利仙、别嘌呤醇能降低小鼠高尿酸血症模型血尿酸值；痛风宁高、中剂量组与模型对照组比较有非常显著性差异(户以0 1)，痛风宁低剂量组与模型对照组比较有显著性差异(R n0 5)，痛风宁高、中剂量组与正常对照组比较无显著性差异(P)n0 5)，痛风宁低剂量组与正常对照组比较有非常显著性差异(尸m0 1)，表明痛】c L宁颗粒对小鼠高屎酸血症模型有降血尿酸作用，高、中剂量组作用更强。http:/ 动物：清洁级S D 大鼠7 0 只，雄性，1 8 0 9 3 0 9，上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号：S C X K(沪)2 0 0 3 0 0 0 3。福建中医学院实验动物中心饲养，医学实验动物环境设施合格证号：医动字第2 3-0 1 4 号。2 药物：痛风宁颗粒：福州辰星药业有限公司加工制备，批号0 6 1 0 2 4，每克含生药0 7 5 9，9 9 包：痛风利仙：德国赫曼大药厂(1 t e u m a n nP C SG m b l l)生产，进口药品注册证号H 2 0 0 5 0 4 3 2，批号0 6 0 3 1 4 6，江苏省昆山龙灯瑞迪制药有限公司分装销售，国药准字J 2 0 0 4 0 0 0 l，分装批号0 6 0 9 0 1，5 0 m g 片；别嘌呤醇：江苏方强制药厂，国药准字1 1 2 0 0 3 3 6 8 3，批号2 0 0 6 0 1 2 2，L O O m g 片；腺嘌呤(A d e n i n e)：北京拜尔迪生物公司，批号2 0 0 6 1 0 2 1；盐酸乙胺丁醇：沈阳红旗制药有限公司，国药准字1 1 2 1 0 2 2 3 4 9，批号0 5 11 0 5 1，2 5 0 m g 片；血尿酸榆测试剂盒：上海荣盛生物技术有限公司，批号2 0 0 6 111 3。3 主要仪器：全自动生化仪A U 2 7 0 0日本O L Y M P U S 公司(二)实验方法：1 S D 大鼠进实验室后随机分为七组，即正常对照组、模型对照组、痛风宁高剂量组、痛风宁中剂量组、痛风宁低剂量组、痛风利仙组和别嘌呤醇组，每组1 0 只，称重并编号：2 适应性喂养1 w 后，各组上午分别灌胃给予蒸馏水、蒸馏水、痛风宁颗粒高剂量混悬液(相当生药8 9 1 0 m 1)、痛风宁颗粒巾剂量混悬液(相当生药4 9 l O m l)、痛风宁颗粒低剂量混：悬液(相当生药2 9 l O m l)、痛风利仙混悬液(1 0 m g l O m l)和别嘌呤醇混悬液(6 0 m g l O m l)，下午证常对照组灌胃蒸馏水，其余各组均灌胃腺嘌呤+乙胺丁醇混悬液(腺嘌呤l O O m g+?,胺丁醇2 5 0 m g，溶于1 0 m l 水中配制而成)造模，均按体重l m l l O O g灌胃，每天1 次，连续7 天。3 于末次给药后1 h，用摘眼球法取血，送福建省中医药研究院检测瓶尿酸值。4 血尿酸检测：血1 样本3 0 0 0 r p m 离一0 1 5 m i n，取血清，采用氧化酶法按试剂盒测定方法检测。5 数据统计处理：数据以均数(茹标准筹(S)表示，应用S P S S1 2 0 进行统计学分析处理，行F 检验及q 枪验。(三)实验结果9http:/ 学竹论文表2 痛风宁颗粒对大鼠高尿酸血症模型血尿酸的影响(n=1 0，；S)图2 大鼠血尿酸值口正常对照组口模型对照组口痛风宁高剂量组口痛风宁中剂量组痛风宁低剂量组口痛风利仙组口别膘呤醇组表2 及图2 显示：各实验组大鼠血屎酸值均升高模型对照组与正常对照组比较自非常显著性差异(户m 口，)，表叫大鼠高尿酸咖症模型成功；痛风利仙组、别嘌呤醇组与模型对照组比较有非常显著性差异(，化0 1)，与证常对照组比较无显著性差异(肜n0 5)，表明痛风利仙、别噤岭醇能降低大鼠高尿酸血症模型血碌酸值；痛风宁高、中剂量组与模型对照组比较有非常显著性差异(P m0)，痛风宁低剂量组与模型对照组比较无显著性差异(乃n0 5)，痛风宁高、中剂量组与正常对照组比较无显著性差异(尸)n0 5)，痛风宁低剂量组与正常对照组比较有非常显著性差爿=(P p，)，表明痛风宁颗粒对大鼠高尿酸血症模型有降血尿酸作用，高、中剂量组作用更强。http:/ 动物：清洁级昆明种小鼠6 0 只，雄性，2 0 9+2 9，上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号：S C X K(沪)2 0 0 3-0 0 0 3。福建中医学院实验动物中心饲养，医学实验动物环境设施合格证号：医动字第2 3-0 1 4 号。2 药物：痛风宁颗粒：福州辰星药业有限公司加工制备，批号0 6 1 0 2 4，每克含生药0 7 5 9，9 9 包；秋水仙碱：云南省玉溪望子龙生物制药有限公司，国药准字H 5 3 0 2 1 9 0 4，批号2 0 0 6 0 7 0 1，0 5 m g 片：醋酸泼尼松：浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字H 3 3 0 2 1 2 0 7，批号0 5 0 9 3 3，5 m g 片；二甲苯：上海联试化工试剂有限公司，批号2 0 0 6 0 8 2 5。(二)实验方法：1 昆明种小鼠进实验室后随机分为六组，即J 下常对照组、痛风宁高剂量组、痛风宁中剂量组、痛风宁低剂量组、秋水仙碱组和醋酸泼尼松组，每组1 0 只，称重并编号；2 适应性喂养1 w 后，各组分别灌胃给予蒸馏水、痛风宁颗粒高剂量混悬液(相当生药1 6 9 6 0 m 1)、痛风宁颗粒中剂量混悬液(相当生药8 9 6 0 m 1)、痛风宁颗粒低剂量混悬液(相当生药4 9 6 0 m 1)、秋水仙碱混悬液(1 2 m g B O m l)、醋酸泼尼松混悬液(6 m g 6 0 m 1)；均按体罩O 3 m l l O g 灌胃，每天2 次，连续3 天。3 末次灌胃后l h，用二甲苯均匀涂于小鼠右耳前后两面，1 h 后颈椎脱位处死，用打孔器(D=7 m m)于左、右耳同一部位取下网耳片，电子秤称重，以两耳重量差值作为肿胀度。4 数据统计处理：数据以均数(x-3 标准差(S)表示，应用S P S S1 2 0 进行统计学分析处理，行F 检验及q 榆验。(三)实验结果http:/ 痛风宁颗粒埘二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型的影j 冉(n1 0；s)表3 及图3 显示各实验组小鼠耳廓肿胀明显，表明小鼠耳廓肿胀模型成功；秋水仙碱组、醋酸渡尼松组与正常对照组比较有非常显著性差异(P m0 1)，表明秋水仙碱、醋酸泼尼松组对小鼠耳廓肿胀模型有消肿作用；痛风宁岛、中剂量组与止常对照纽比较有非常显著性差异(尸mO Z)，痛风宁低剂量组与正常对照组比较尤显著性差异(丹n0 5 3，表明痛风宁颗粒对小鼠耳廓肿胀模型有消肿作H j，高、中剂量组作用更强。http:/ 动物：清洁级s D 太鼠6 0 只，雄性，1 8 0 9+3 0 9，i-海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号：S C X K(沪)2 0 G 3 0 0 0 3。福建中医学院实验动物中心饲养，医学实验动物环境设施合格证号：医动字第2 30 1 4 号。2 药物：痛风宁颗粒：福州辰星药业有限公司加工制备，批号0 6 1 0 2 4，每克含生药0 7 5 9，9 9 包：尿酸钠(M S U)：S i g m aa l d r i c h 公司(美国)，批号1 2 0 K 5 3 0 5，5 E 瓶；秋水仙碱：云南省玉溪望子龙生物制药有限公司，国药准字1 5 3 0 2 1 9 0 4，批号2 0 0 6 0 7 0 1 05 m g 片l生理盐水：福州海王福药制药有限公司，国药准字H 3 5 0 2 0 2 8 9，批号0 6 1 0 2 0 A 1 0，5 0 0 m l 瓶。3 仪器：自制容积仪；2 0 m l 注射器，5 m l 移液管，5 m l 注射器，医片jj 通管，橡皮管，实验铁架台组成，如图4 所示：图4 自制容积仪(二)实验方法：1 s D 大鼠进实验室后随机分为六组，即正常剥照组、模型对照组、痛风宁高剂量组、痛风宁中剂量组、痛风宁低剂量组和秋水仙碱组，每组l o 只，称重并编号：2 适应性喂养1 w 后，各组分别灌胃给予蒸馏水、蒸馏水、痛风宁颗粒高剂量混悬液(相当生药8 9 I O m l)、痛风宁颗粒中剂量混悬液相当生药4 9 1 0 m 1)、痛风宁颗粒低http:/ 9 l O m l)、秋水仙碱混：悬液(0 6 m g l O m l)；均按体重l m l l O O g灌胃，每天1 次，连续3 天。3 于术次给药后l h，正常对照组右后足跖皮下注射生理盐水0 1 m l，其余五组均右后足跖皮下注射尿酸钠混悬液(1 0 0 m g m 1)0 1 m l，用自制容积仪分别于皮下注射后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h 测量大鼠双后足容积差为肿胀度，并记录。4 数据统计处理：数据以均数(茹标准差(S)表示，应用S P S S1 2 O 进行统计学分析处理，行F 检验及q 检验。(三)实验结果：表4 痛风宁颗粒对尿酸钠致大鼠足跖肿胀模型的影响(n=l O，i S)续表4正常对照组0 2 0 0 0 70 1 8 0 0 60 1 4 0 0 90 1 4 0 0 7模型对照组0 6 6 _+0 1 8 0 6 4 _+0 2 0 0 5 7 O 1 4 0 4 9+0 1 2 痫风宁高剂量组O 3 2 0 2 1 0 3 0 4-0 1 90 2 8+0 1 60 2 7 4-0 1 5痛风宁中剂量组O 3 4 O 1 7 0 3 3 0 1 50 3 0 O 1 30 2 8+0 1 7痫风宁低剂量组0 6 3 O 1 4 0 6 0 _+O 1 7 0 5 7 0 2 0 0 5 2 0 1 4 秋水仙碱组0 2 8 _+0 1 2 0 2 7 0 1 30 2 4+0 1 00 2 1 0 1 11 4http:/ j 颗粒治疗痛风的药教学实验研究袁4 及图5 显示：造模后备组大鼠足跖肿胀明显，肿胀度均呈L 升趋势，造模后2、3、4、5、6、7 h 时模型对照组与正常对照纽比较有非常显著性差异(R 诅O f)，表明大鼠足跖肿胀模型成功；4 h 时各组肿胀度达到峰值随后旱下降趋势，故选造模后1 h 时肿胀度进行评价能有效反映药物的消肿作用。4 h 时：秋水仙碱组与模型对照组比较有非常显著性芹异(P 4 0 0 1)，与正常剥照组比较无硅著性差异(p 醴0 5)，表明秋水仙碱对人鼠足跖肿胀模型有消刖，作用；痛风宁高、中剂量组与模型对照组比较有非常器著性尊异(尺n0 1)。痛风宁低剂量组与模型对照组比较无显著性差异(侈口，痛风宁高、中剂昔组与I F 常对照组比较无硅著性差异(眇n 彻，痛风宁低剂量组与J E 常对照组比较有非常显著性差异(尺n0 1)，表明痛风宁颗辛证对大鼠足跖肿胀模型有消肿作用高、巾剂量组作用更强。http:/ 2 只，雄性，3 O k g+_ O 5k g，上海生旺实验动物养殖有限公司提供，合格证号：S C X K(沪)2 0 0 2 0 0 1 1。福建中医学院实验动物中心饲养，医学实验动物环境设施合格证号：医动字第2 3-0 1 4 号。2、药物：痛风宁颗粒：福州辰星药业有限公司加工制备，批号0 6 1 0 2 4，每克含生药0 7 5 9，9 9 包；尿酸钠(M S U)：S i g m a-a l d r i c h 公司(美国)，批号1 2 0 K 5 3 0 5，5 9 瓶；秋水仙碱：云南省玉溪望子龙生物制药有限公司，国药准字H 5 3 0 2 1 9 0 4，批号2 0 0 6 0 7 0 1，0 5 m g 片；乌拉坦(氨基四酸乙酯)：中国医药(集团)上海化学试剂公司，批号2 0 0 6 0 7 0 8,4 0 甲醛溶液：上海化学试剂总厂，批号2 0 0 6 0 8 1 5；生理盐水：福州海王福药制药有限公司，国药准字H 3 5 0 2 0 2 8 9，批号0 6 1 0 2 0 A 1 0，5 0 0 m l 瓶。I L l1 3 试剂盒：北京普尔伟业生物科技有限公司，批号2 0 0 6 1 2 0 3；T N F-Q 试剂盒：北京普尔伟业生物科技有限公司，批号2 0 0 6 1 2 1 9；3、主要仪器：恒温箱P Y X D H S上海跃进医疗器械厂石蜡切片机C U T 4 0 6 0德国L e i c a 公司光学显微镜B H 2日本O L Y M P U S 公司真空干燥箱1 0 1 A 一2上海实验仪器总厂Y 放射免疫计数器F J 2 0 0 8 P S西安二六二厂(二)实验方法1 新西兰兔进实验室后随机分为六组，即正常对照组、模型对照组、痛风宁高剂量组、痛风宁中剂量组、痛风宁低剂量组和秋水仙碱组，每组7 只，称重并编号；2 适应性喂养1 W 后，各组分别灌胃蒸馏水、蒸馏水、痛风宁颗粒高剂量混悬液(相当生药4 9 3 0 m 1)、痛风宁颗粒中剂量混悬液(相当生药2 9 3 0 m 1)、痛风宁颗粒低剂量混悬液(相当生药l g 3 0 m 1)、秋水仙碱混悬液(0 3 m g 3 0 m 1)，均按体重3 0 m l k g 灌胃，每天1 次，连续3 天；3 末次灌胃给药l h 后，用兔固定器固定新西兰兔，J 下常对照纽新西兰兔右后膝关节腔内用l m l 注射器注射0 3 m 生理盐水，其余1 i 组注射0 3 m l 尿酸钠混悬液1 6http:/ 0 0 m g m 1)：4 5 h 后用2 0 乌拉坦溶液注射于耳缘静脉麻醉，剪除兔右后膝关节附近兔毛，然后刚碘伏常规消毒皮肤，铺巾，用l m l 生理盐水冲洗关节腔，然后抽取关节液，滴l 滴于玻片上进行涂片，福尔马林溶液固定，送福建中医学院中西医结合研究院，H E 染色后4 0 倍镜下计算中性粒细胞数；5 其余关节液装入E P 管，-7 0 冰箱保存，送福建中医学院中西医结合研究院，采用平衡法(R I A 法)按试剂盒测定方法检测I L-IB、T N F-n。6 手术切开兔右后膝关节，切取0 5XI c m 大小的关节滑膜组织，送福建中医学院中西医结合研究院制作病理标本。6 1 组织块的固定将组织块立即投入1 0 福尔马林液中固定2 天，中间换液一次。6 2 组织块的脱水将组织块用自来水冲洗后，依次浸入7 0 酒精2 小时一8 0 酒精2 小时-9 0 酒精2 小时-*9 5 酒精2 小时一9 0 酒精2 小时-1 0 0 酒精3 次，2 小时次。6 3 组织块的透明入二甲苯透明2 次，2 0 分钟次。6 4 组织块的浸蜡和包埋将组织块浸入熔化的石蜡(5 6)2 次，3 小时次一石蜡包埋。6 5 组织块的切片用石蜡切片机进行6 岫连续切片一放入真空干燥箱7 0 C4 小时。6 6 染色(H E 染色法)、透明和封片二甲苯脱蜡2 次，2 0 分钟次一浸入1 0 0 酒精1 5 秒钟一9 5 酒精1 5 秒车中-8 0 酒精1 5 秒钟一7 0 酒精1 5 秒钟一入水冲洗5 分钟一放入C a r a z z i s 氏苏木素(苏木素3 9，钾明矾5 9，蒸馏水8 0 0 m l，碘酸钠0 6 9，甘油2 0 0 m l，无水酒精5 m l，先用无水酒精5 m l 研磨苏木素，将蒸馏水加热9 5 溶解钾明矾，将苏木素加入钾明矾内，同时加入碘酸钠，流水冷却后加入甘油，振荡l 小时后可用)2 0 分钟一自来水水冲洗5 秒钟一7 0盐酸一酒精分化3 秒钟一自来水反蓝1 0 分钟一放入伊红1 分钟一浸入8 0 酒精1 0秒钟一9 0 酒精1 0 秒钟一无水酒精1 0 秒钟，2 次一入二甲苯2 次，分别为2 分钟、5分钟一巾性树胶封片。7 组织块切片光镜的观察内容主要观察滑膜组织水肿、滑膜细胞t t Y,l、中性粒细胞浸润等炎症反应的程度。8 数据统计处理：数据以均数(妁标准差(s)表示，应用S P S S1 2 O 进行统计学分析处理，行F 检验及q 枪验。(三)实验结果http:/ 中性粒细胞教测定结果：(以下图片均为H E 染色4 0 倍光镜下所见)图6 正常对照组P _。：一图7模型对照组图8 痛风宁高剂量组图9 痛风宁中剂量组日0口6图1 0 痛风宁低剂量组图儿秋水仙碱组一http:/ 痛风宁颗粒对新西兰兔痛风性关节炎模型关节液中性粒细胞数的影响(n=7，5-s)图1 2 新西兰兔关节液中性粒细胞数表5 及吲61 2 显示；各实验组新西兰免关节渡中性粒细胞数均升高，模型对照组与j F 常对照组比较有非常显著性差异(P 以甜)，表明新西兰兔痛风性关节炎模型成功；秋水仙碱组与模型对照组比较有非常显著性差异(让0 1)，与正常对照组比较无显著性差异(侈nd D 表明秋水仙碱对新西兰兔痛风性关节炎模型关节液中性粒细胞数有抑制作用；痛风宁高、中剂量组与模型对照组比较有非常显著性差异(P m0 1)，痛风宁低剂量组与模型对照组比较无显著性差异(乃n0,5 3，痛风宁高、中、低荆量组与正常对照组比较有非常显著性差异(尸m 讲)，表明痛风宁颗粒对新西兰兔痛风性关节炎模型关节液巾性粒细胞数有抑制作用高、中剂量组作用更强。http:/ I L 一1B 测定结果：表6 痛风宁颗粒对新西兰兔痛风性关节炎模型关节液I L 一1B 的影响(n=7，；s)表6 及国1 3 显示：各实验组新西兰兔关节液I L-lB 值均升高，模型对照组与正常对照组比较有非常显著性差异(A 让0 1)，表明新西兰兔痛飙性关节炎模型成功；秋水仙碱组与模型对照组比较有非常显著性差异(尸m0 1)，与正常对照组比较无显著性差异(P 3 0 0 5)，表明秋水仙碱对新西兰兔痛风性关节炎模型关节液IL lf 3 有降低作用；痛风宁高、中剂量组与模型对照组比较有显著性差异(尸(n 彻，痛风宁低剂量组与模型对照组比较无显著性差异(p n0 5)，痛风宁高、中剂量组与正常对照组比较无显著性差异(丹n0 5)，痛风宁低剂量组与正常对照组比较有非常显著性差异(尸m0 1)，表明痛风宁颗粒对新西兰兔痛风性关节炎模型关节液I【，一1B 有降低作用，高、中剂量纽作用更强。http:/ T N F Q 测定结果：表7 痛风宁颗粒对新西兰兔痛风性关节炎模型关节液T N F-n 的影响(n=7，；s)*图1 4 新西兰兔关节液_ I N Fo 值口正常对照组H 模型对照组I 痛风宁高剂量绑口痛风宁r 1 剂量组-痛风宁低剂量凯1 j 秋水仙碱组表7 及图1 4 显示：备实验组新西兰兔关节液T N F O 值均升高，模型对照组与正常对照组比较有非常显著性差异(P 以0 1)，表明新西兰兔痛风性关节炎模型成功；秋水仙碱组与模型对照组比较有非常显著性差异(尸以0 1)，与正常对照组比较无显著性差异(砂n0 5)，表明秋水仙碱对新西兰免痛风性关节炎模型关节液中T N F n 有降低作用；痛风宁高、中剂量组与模型对照组比较有非常显著性差异(，0 1)，痛风宁低剂量组与模型对照组比较无显著性差异(丹n0 5)，痛风宁高、中剂量组与正常对照组比较无显著性差异(p n0 5)，痛风宁低剂量组与j F 常对照组比较有非常显著性差异(尺n 洲)，表明痛风宁颗粒对新西兰兔痛风性关节炎模型关节液T N F a 有降低作用，高、r r l 剂量组作用更强。98765432，0宅蔷chttp:/ 滑膜组织病理结果t(以下图片均为H E 染色4 0 倍光镜下所见)j，、I图1 5 正常对照组奠；l、!孥娩邀1。f，。豪建一每笔；一。u，I I、图1 6 模型对照组t!j十、l，：，、一，_ 一：!l：日?j：_、莰i：K?、：r、-氏|璺|1 8 痛风宁颗粒中剂量组、二-；二。C 过、哼攀杂7 r、图】9 痛风宁颗粒低剂量组图2 0 秋水仙碱组正常对照组：滑膜组织正常，滑膜细胞排列规则，无中性粒细胞浸润；模型对照组：滑膜组织明显水肿，滑膜细胞排列不规则，大量中性粒细胞浸润；痛风宁高剂量组：滑膜组织轻度水肿，滑膜细胞排列尚规则，少量中性粒细胞浸润；痛风宁中剂量组：滑膜组织轻度水肿，滑膜细胞增生排列尚规则，少量中性粒细胞2 2、&气1。http:/ r a t e o x i d a s e)，故它们可以将体内尿酸分解为尿囊素。尿囊素为无毒物质，水溶性良好，易由尿排出体外，很少在体内蓄积，不产生结晶，也不会沉积在组织内形成痛风结石造成损害。它能进一步代谢分解成乙二醛酸或者氨和二氧化碳(代谢示意图如下图所示)。因此，在其它哺乳动物，如大、小鼠上建立高尿酸血症模型相当困难，高尿酸血症标准而可靠的动物模型研制一自困扰着广大医学研究者。其他哺乳动物嘌呤代谢示意图：腺嘌呤歆黄嘌呤上鸟嘌呤威嘌呤原酸，尿囊素!王!尿囊酸尿素乙二醛酸上氨+：=氧化碳根据尿酸代谫，生成过程，国内外有不少学者采用生化方法在小鼠、大鼠、禽类造成岛尿酸血症模型啪删，主要方法如下：(1)人、小鼠：予富含嘌呤饲料、酵母粉(膏)、黄嘌I 冷、次黄嘌呤、腺嘌呤，或者再配合乙胺丁醇、丙I 嗪酰胺等抑制尿酸排泄药物，引起动物体内尿酸生成增多，排出减少；腹腔注射次黄嘌呤、黄嘌呤等尿酸前体或直接腹腔注射尿酸，引起动物体内尿酸增多；予尿酸酶抑制剂氧嗪酸(O A，O x o n i ca c i d)，抑制动物体内尿酸酶活性，使动物体内的尿酸不能分解，或再配合予大量嘌呤，引起尿酸生成增多；(2)禽类(鸡、鹌鹑等)：予大量嘌呤(黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤)或富含嘌呤物质、高蚩白质物质，引起尿酸生成增多。以b J L 种高尿酸血症动物模型的设计思路均为给予大剂量含嘌呤物质，或使用化学尿酸酶抑制剂，或加用抑制尿酸排泄的药物，建立的尿酸生成增多型或伴尿酸排泄障碍的动物模型。国外还有报道。硒1，通过http:/ 周以上，且复制模型过程复杂，难度大，成本高，使得该模型实际应用存在很大问题。故本课题选择“给予大剂量含嘌呤物质”的方法制成高尿酸血症模型。(二)痛风宁颗粒对大、小鼠高尿酸血症模型血尿酸的影响本课题参考诸多文献资料及预实验结果，小鼠采用腹腔注射黄嘌呤造成高尿酸血症模型，结果显示：各实验组小鼠血尿酸值均升高，模型对照组达2 1 4 7 2 2 5 1l am o l L，高于正常对照组1 3 0 4 1 7 3 7l am o l L 水平，二者比较有非常显著性差异(尸m0 1)，表明小鼠高尿酸血症模型成功；痛风宁高、中、低剂量组血尿酸较模型对照组均显著降低(尸以0 1，尸以彻，且痛风宁高、中剂量组血尿酸降至正常对照组水平(炒现彻，痛风宁低剂量组仍高于正常对照组水平(尸以们)，表明痛风宁颗粒对小鼠高尿酸血症模型有降血尿酸作用，痛风宁高、中剂量组较低剂量组作用更强。大鼠采用腺嘌呤+乙胺丁醇法造成高尿酸血症模型，结果显示：各实验组大鼠血尿酸值均升高，模型对照组达1 8 6 4 2 5 0 8l am o l L，高于正常对照组11 3 6 1 2 7 8pm o l L 水平，二者比较有非常显著性差异(尸以刃)，表明大鼠高尿酸血症模型成功；痛风宁高、中剂量组血尿酸较模型对照组显著降低(尸以0 1)，痛风宁(氐i f J J 量组血尿酸较模型对照组降低，但不显著(力现0 5)，且痛风宁高、中剂量组血尿酸降至正常对照组水平(现彻，痛风宁低剂量组仍高于正常对照组水平(尸1 以们)，表明痛风宁颗粒对大鼠高尿酸血症模型有降m 尿酸作用，痛风宁高、中剂量组较低剂量组作用更强。现代药理研究及临床已证实，土茯苓、盒钱草、汉防己、威灵仙、秦艽、牛膝均具有利尿作用，利尿即能促进尿酸的排泄，且青风藤中含有的生物碱，对尿酸有中和作用，从而达到降低血尿酸的作用。痛风宁颗粒能够降血尿酸，与该颗粒中含有以上中药密切相关。二、痛风宁颗粒对二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型、尿酸钠致大鼠足跖肿