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拉曼光谱技术在抗生素药物领域的应用拉曼光谱技术在抗生素药物领域的应用 The application of Raman spectroscopy in antibiotic drugs 学科专业：生物医学工程 研 究 生：梁伟姿 指导教师：林旺 副教授 天津大学精密仪器与光电子工程学院学院 二零一二年十二月 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 天津大学天津大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 天津大学天津大学 有关保留、使用学位论文的规定。特授权 天津大学天津大学 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年 月 日 签字日期：年 月 i 摘要摘要 青霉素是最早发现的一类-内酰胺类抗生素，并在上世纪 40 年代首次应用于临床治疗。头孢氨苄也是临床中常用的一种-内酰胺类抗生素。这两类药物均对革兰阳性菌有明显的抑制功效，被认为是许多感染性疾病的有效治疗药物。因其良好的分散性、低毒性和高效性而在临床应用中具有重要的作用。拉曼光谱技术是一种鉴定物质结构的有效测试手段，如今已在材料、化工、石油、生物、环境监测等领域有广泛的应用。表面增强拉曼光谱（Surface Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）是一种很好的表面分析手段，因其较高的表面和界面敏感性以及探测灵敏度而被广泛应用。本文主要开展了拉曼光谱及其表面增强拉曼光谱技术在青霉素和头孢氨苄两类抗生素药物中的检测研究，拓宽了拉曼光谱技术在药物领域的应用。主要工作如下：基于拉曼光谱技术的青霉素药物稳定性研究。该部分内容以研究不同 pH 值条件下的青霉素钠水溶液的稳定性为目的。通过获取实时拉曼光谱，本文从光谱图的角度对这一问题进行了初步的讨论。随后结合主成分分析的方法，本文获得了青霉素钠水溶液降解过程的进一步结果，最终实现青霉素药物稳定性的定性分析。新型表面增强拉曼光谱活性基底的应用。本文利用氧化石墨烯开展了在表面增强拉曼光谱领域中的应用研究。研究结果表明该基底在一定程度上能够增强染料罗丹明 6G、化工原料三聚氰胺以及抗生素头孢氨苄的拉曼信号。另外，本文还针对其增强机理进行了初步的探究和讨论。关键词关键词：青霉素 头孢氨苄 拉曼光谱 主成分分析 表面增强拉曼光谱 氧化石墨烯 ii ABSTRACT Penicillin is the earliest discovered beta-lactam antibiotic and first applied to clinical therapy in the 1940s.Cephalexin is also a kind of beta-lactam antibiotic which is commonly used in clinical.These two drugs have obvious inhibition efficacy against grand positive bacteria,and are considered as effective treatment for many infectious diseases.They both play an important role in clinical application because of good dispersion,low toxicity and high efficiency.Raman spectroscopy is an effective method to study the material structure which has been widely used in materials,chemical,oil,biological,environmental protection,etc.Surface Enhanced Raman Spectroscopy(SERS)is a kind of very good surface analysis method.Its high surface and interface sensitivity and detection sensitivity result in the widely application.This paper mainly carries out a work that about the application of Raman spectrum and surface enhanced Raman spectroscopy in the study of penicillin and cephalexin drugs.This study will broaden the application of Raman spectrum technology in the drugs.The main works are summarized as follows:Apply Raman spectrum to study the stability of penicillin drugs.This part aimed to research the stability of penicillin sodium solution in different pH value.By getting real-time Raman spectrum,this paper carries on the preliminary discussion about this question from the point of spectral image.Combining with principal component analysis method,this paper receives a further result about the degradation process of penicillin sodium solution.Finally,this paper realizes the qualitative analysis of the stability in penicillin drugs.Apply a new active substrate in Surface Enhanced Raman Spectroscopy.By using graphene oxidation,this paper carries out an applied research in the field of Surface Enhanced Raman Spectroscopy.The result shows that this new active substrate can enhance the Raman signal of dye rhodamine 6G,industrial chemical melamine and cephalexin antibiotic to a certain extent.Finally,it carries out a discussion about the enhancement mechanism of graphene oxidation.iii KEY WORDS：Penicillin,Cefalexin，Raman Spectrum,Principal ComponentAnalysis,SERS,Graphene Oxidation iii 目 录 第一章第一章 绪论绪论.1 1.1 拉曼光谱概况.1 1.1.1 拉曼光谱的发展.1 1.1.2 拉曼散射的介绍.2 1.1.3 拉曼光谱的特点.6 1.1.4 拉曼光谱的优越性.6 1.1.5 拉曼光谱的应用.7 1.2 表面增强拉曼光谱概述.10 1.2.1 表面增强拉曼光谱的发现和发展.11 1.2.2 表面增强拉曼光谱的增强机理.11 1.2.3 表面增强拉曼光谱的活性基底制备.13 1.3 本文的研究目的及研究内容.14 第二章第二章 拉曼光谱技术在青霉素钠稳定性研究中的应用拉曼光谱技术在青霉素钠稳定性研究中的应用.15 2.1 引言.15 2.2 主成分分析.17 2.2.1 主成分分析的基本原理.18 2.2.2 主成分分析的计算步骤.18 2.3 实验部分.20 2.3.1 实验样品与试剂.20 2.3.2 实验仪器与软件.21 2.3.3 实验方法.21 2.4 结果与讨论.21 2.4.1 青霉素钠水溶液拉曼光谱研究.21 2.4.2 青霉素钠水溶液降解的主成分分析.26 2.5 本章小结.33 第三章第三章 氧化石墨烯作为表面增强拉曼光谱活性基底在药物检测方面的应用氧化石墨烯作为表面增强拉曼光谱活性基底在药物检测方面的应用.34 3.1 引言.34 3.2 实验部分.36 3.2.1 实验样品与试剂.36 3.2.2 实验仪器.37 iv 3.2.3 金纳米颗粒的制备.37 3.2.4 制备氧化石墨烯分散液.37 3.3 结果与讨论.38 3.3.1 氧化石墨烯的透射电子显微镜表征.38 3.3.2 氧化石墨烯的拉曼光谱表征.39 3.3.3 氧化石墨烯作为表面增强拉曼光谱活性基底的研究.39 3.3.4 氧化石墨烯的表面增强拉曼光谱增强机理研究.46 3.4 本章小结.47 第四章第四章 总结与展望总结与展望.49 4.1 工作总结.49 4.2 展望.50 参考文献参考文献 .51 发表论文和参加科研情况说明发表论文和参加科研情况说明.57 致致 谢谢 .58 第一章 绪论 1 第一章 绪论 1.1 拉曼光谱概况 1.1.1 拉曼光谱的发展 拉曼光谱（Raman spectrum）最早由德国物理学家 A.Smekal 所预言，并于1928 年 3 月由印度物理学家 C.V.Raman 通过液体苯散射光谱的实验观测到。当入射光照射到透明介质时，在光子与介质分子发生碰撞的过程中，部分入射光子的频率将发生改变，这一现象被称为拉曼散射。随后，苏联及法国的研究人员在各自的实验中也相继发现了这一散射现象。C.V.Raman 作为拉曼散射现象的首个发现者及系统的研究人员，故在 1930 年被授予诺贝尔物理学奖。在拉曼光谱的应用初期，作为光源的汞弧灯受到其自身光源强度的限制，它所产生的拉曼效应太弱，故此对实验样品的要求很严格（仅适用于透明的液体样品）；同时实验样品本身所产生的荧光和杂散光都对检测造成了干扰。拉曼光谱在实际应用中的进一步发展受到了上述实际条件的种种限制，因而很快被逐渐发展起来的红外光谱所取代。直到上世纪 50 年代，拉曼光谱仅仅是作为物理学上振动光谱的教学示范，已逐渐退出科学研究与实际应用的舞台。20 世纪 60 年代，随着激光技术的迅速发展，由于激光具有单色性好、能量集中、输出功率大等优点，尤其是光谱辐射密度高、激光光源体积小、重量轻、易自动化操作等优点，故而很快将其用作拉曼光谱仪的激发光源，从而使拉曼光谱获得了新的起点。自此，激光光源的引入、微弱信号检测技术（如 CCD 检测器）的提高和计算机的普及，使拉曼光谱分析在许多领域的应用取得很大的进展1。如今，拉曼光谱技术已发展成为一种成熟的分析测试手段，并在刑侦、制药、高分子、食品安全、医学等多个领域发挥了重要的作用。在国内，有关拉曼光谱技术的研究工作也开展的很早。1934 年，中国科学家郑华积在德国的理化学杂志发表了中国学者的第一篇拉曼光谱研究论文。同年，吴大酞先生在北京大学开始了国内最早的拉曼光谱研究，并于 1935 年完成了第一篇关于拉曼散射的论文“四氯乙烯拉曼线的退极化”（中国化学学会会志）。1939 年，他在西南联大完成了专著多原子分子的振动谱和结构，这是自 C.V.Raman 获诺贝尔奖以来，第一部全面总结分子拉曼光谱研究成果的经典著作。这些都标志着中国在拉曼光谱研究方面的一些早期成果。第一章 绪论 2 1.1.2 拉曼散射的介绍 1.1.2.1 拉曼散射原理介绍 光散射是自然界中常见的现象。当入射光照射到透明介质时，两者之间的相互作用实际是入射光子与介质分子的碰撞。在上述碰撞过程中，入射光子除了被介质分子进行吸收、反射和透射之外，还将发生散射。根据两者之间不同的碰撞方式，我们可将发生在入射光子与介质分子之间的散射分为两种情况：弹性碰撞与非弹性碰撞。如图 1-1 所示，在碰撞前后，散射光的能量与入射光的能量没有发生变化，即介质分子与入射光子之间不存在能量的交换，只发生入射光子运动方向的改变，此即为瑞利散射（Rayleigh Scattering），其强度只有入射光的 10-3倍。而在碰撞前后，散射光的能量与入射光的能量发生变化，即分子与光子之间发生能量交换，这种散射称为拉曼散射，其强度比瑞利散射还要弱得多，约是入射光强度的 10-6-10-8倍。在拉曼散射中会产生斯托克斯（Stokes）及反斯托克斯（Anti-Stokes）两种散射效应。所谓斯托克斯线是散射光的频率比入射光的频率小，即在瑞利散射线0低频一侧的散射线0=-。反斯托克斯线是散射光的频率比入射光的频率大，即在瑞利散射线0高频一侧的散射线0=+。其中为频率差，称为拉曼位移。常温状态下，绝大多数的物质分子均处于振动基态，所以斯托克斯线的强度较反斯托克斯线的要强很多，这也是反斯托克斯线不易观测到的原因。图 1-1 光散射示意图 下图 1-2 由能级图的角度解释了瑞利散射与拉曼散射之间的区别。图中振动基态与激发态分别由2E、1E表示，对应与入射光能量的虚能级由虚线表示。设照射到透明介质表面的入射光频率为0，相应的光子能量为0h，其中h为普朗克常数。瑞利散射即为入射光子与介质分子之间发生的弹性碰撞，在这个过程中不存在能量与入射光子频率的改变，而只改变入射光子的方向。处于振动基态2E第一章 绪论 3 或激发态1E的分子，在能量为0h入射光子的激发下，上述两状态的分子将分别跃迁到20Eh或10Eh的激发虚态。处于激发虚态的分子是不稳定的，将很快返回到相应的初始能级2E或1E，并将吸收的能量以光子的形式释放出来。而拉曼散射是入射光子与介质分子之间发生的非弹性碰撞，在这个碰撞过程中，不仅光子的方向发生改变，频率也会发生变化。这个过程包含两种情况：一是处于振动基态2E的分子被入射光子激发到虚态，随后返回振动激发态1E，此时吸收了EEh的能量，并以散射光的形式释放出来，称为斯托克斯散射过程。二是处于振动激发态1E的分子被入射光子激发到虚态，随后返回到振动基态2E，此时释放了EEh的能量，并以散射光的形式释放出来，称为反斯托克斯散射过程。基于玻尔兹曼分布原理，处于振动基态上的粒子数远大于处于振动激发态上的粒子数，室温时处于振动激发态的概率很小（不足 1%），因此，斯托克斯线的强度要比反斯托克斯线强得多2。图 1-2 瑞利散射和拉曼散射能级图 1.1.2.2 拉曼散射的经典理论 由经典电磁场理论可知，光的本质是由相互垂直的电场E和磁场H组成的电磁波，其方向与电场E和磁场H垂直。频率固定不变的单色光与物质分子相互作用产生的散射现象，可借助光波的光场与分子的相互作用来解释。当入射光照射到物质表面时，物质内部的分子发生震荡，形成偶极子的极化作用3。在弹性碰撞情况下，感生电偶极矩P与极化率满足下式：第一章 绪论 4 PE （1-1）式中E为电场强度。而E可用时间t表示为：00cosEEt （1-2）式中，0为频率，等于02；t为时间。而极化率的改变（即感生偶极矩振幅的改变）是和分子的振动和转动相关联的。对于振动，在很好的一级近似下，可以令：01cos2t振 （1-3）式中0是分子在平衡位置上的极化率，1是振动时极化率改变量的振幅（10）。相应地，对于转动，01cos2 2rrt 转 （1-4）式中，0r是平均极化率，1r是分子绕着所考虑的转动轴转动时极化率改变量的振幅。因为极化率对于外场的两个相反的方向是相同的，所以在分子转动时极化率改变的频率是转动频率的两倍。把式（1-2）和（1-3）代入（1-1）得到，在振动分子的情形中，感生偶极矩是：0010cos2cos2cos2PEtEtt00振 （1-5）相应地，把式（1-2）和（1-4）代入（1-1）得到，在转动分子的情形中，感生偶极矩是：0010cos2cos2cos2rrrPEtEtt00转 （1-6）由此利用熟知的三角函数公式可得到：第一章 绪论 5 00101cos2cos2cos2-2PEtEtt 000振振（1-7）00101cos2cos22cos2-22rrrPEtEtt 000转转（1-8）由上两式可以看到，由于在分子振动或转动时有很小的改变，感生偶极矩不仅以入射光频率0改变着，而且以0振与-0振或者20转与-20转的频率改变着。因此，按照经典理论，在散射光的光谱中，在没有发生位移的谱线两边有两条位移线：在振子情形中移动的距离是振，在转子情形中移动的距离是2转。但是振为一固定值，而根据经典理论，转却可以取任何值。因此，在转子的情形中，我们可以猜测到，在没有位移的谱线两边都有一连续谱。根据公式（1-7）和（1-8），位移谱线的强度（振幅的平方）比没有位移的谱线的强度小很多，但两侧对称的谱线的强度应该是相同的。在振动的情形中，强度也应该与振动的振幅有关，因为1是与振幅有关的。因此，经典理论可定性的导出拉曼效应，即散射光谱中的位移频率。但是在定量方面，这一理论却与实验不符。在实验中，双原子分子并没有连续的拉曼光谱，并且除此之外，当位移较大时，一般只能观测到高频谱线，而找不到相应的低频谱线，虽然根据公式（1-7）这两个谱线有相同的强度。而量子理论却可以很好地解释拉曼光谱及其有关的特征。1.1.2.3 拉曼散射的量子理论 要得到拉曼效应的波动力学理论的数学表达式，必须考察散射矩的各个矩阵元：*nmnmPPd （1-9）式中n和m是所考察系统的两个态的波函数。积分号后的P必须用经典表达式（1-1）代入。因为*n，m和P分别有时间因子2/ni Eh te，2/mi Eh te和2 ite 0，所以nmP 是以/nmEEh0的频率改变的。这可得振幅为 0*nmnmPEd （1-10）如果积分（1-10）对于nE和mE这两个态的值不等于零，则在入射光的影响下，能够发生从n到m的跃迁，同时，散射光量子的频率将为/nmEEh0，第一章 绪论 6 这就是说，将出现频率移动了/nmEEh的拉曼线。积分（1-10）的平方，正比于决定该拉曼线强度的跃迁几率。当nm时，得到的是未发生移动的频率0，此时（1-10）决定瑞利散射的强度。如果散射系统（例如振子或转子）的极化率是常数（与振动或转动无关），则可以把提到（1-10）的积分号的外边。由于本征函数的正交性，除了nm的情形外，所有的积分都等于零，这就是说，当是常数时，只出现瑞利散射，而不出现拉曼效应，这是与经典理论的结果相符的。只有在考察的过程中（即在分子振动或转动时）极化率发生改变时，才可能发生从一个态到另一个态的跃迁，从而发生拉曼位移。1.1.3 拉曼光谱的特点 拉曼光谱属于分子光谱范畴，是分子的振动和转动光谱。特定分子产生的拉曼光谱在谱带数目、位移大小、强度和形状方面均与该分子的振动及转动密切相关。基于这种理论基础，通过特定分子的拉曼光谱进行研究便可获得该分子的结构信息。拉曼效应拥有以下特点4：1)每种物质或分子均拥有唯一的特征拉曼光谱，故可用以表征该物质或分子，属于指纹光谱。2)每种物质的拉曼位移（即散射光相对于入射光的频移）是一绝对值，而与入射光的频率无关。而且拉曼散射具有瞬时性，即拉曼散射在入射光消失后10-11-10-12s 相继消失。3)对于各条拉曼谱线，其强度和偏振性质是不同的。4)拉曼光谱的谱线线宽较窄，并且在瑞利散射线的两侧对称分布，即拥有数值相同的正负频率差。在入射光高频一侧称为斯托克斯线，低频一侧则称为反斯托克斯线。5)拉曼位移表示分子内部转动或振动的频率，有时与红外光谱的部分频移重合，波数范围也是相同的。6)根据量子理论，拉曼效应是由光子与分子的非弹性碰撞所产生的，在拉曼散射发生的同时还有瑞利散射，后者的强度是前者强度的几个数量级，频率与入射光的频率相同。7)无论是固体、气体或液体，其分子中均存在拉曼效应。1.1.4 拉曼光谱的优越性 拉曼光谱作为一种成熟的鉴定物质结构的分析方法，可实现快速便捷、无损伤的定性定量分析，测试样本无需进行前处理，可直接借助于光纤探头或者玻璃、第一章 绪论 7 石英测量。此外：1)由于水具有很微弱的拉曼散射，可以对水溶液进行直接测量，样品处理较为简单。故拉曼光谱是研究水溶液中的生物样品和化学化合物的理想工具5。2)拉曼光谱的测量范围宽，通常为 4000-40 cm-1，低波数段测定容易，非常适用于无机物（如半导体、陶瓷等）和配合物（如金属与氧、氮结合键的振动等）的分析研究。3)拉曼谱峰比较清晰尖锐，适合于识别混合物尤其是识别无机混合物。同时尖锐的谱峰更适合于进行定性定量研究和数据库的搜索。4)因为激光束的聚焦直径通常只有 0.2-2 mm，所以常规拉曼光谱只需要少量的样品即可进行测试，可实现痕量物质的检测。而且，显微拉曼的空间分辨率很高，可将激光束进一步聚焦至 20 m 甚至更小，可实现更小面积样品的测试。1.1.5 拉曼光谱的应用 近些年，随着光学、电子学、仪器制造和数据处理等技术的发展，较早只局限于高水平训练有素的专业人员在实验室使用的拉曼光谱方法，已经走出科学家的实验室，不仅在局限于物理学和化学领域的理论研究，逐渐变成了一种通用的分析手段，在材料、石化、地质、考古、刑事司法、药物和医学等领域得到了越来越重要的应用，且保持着较为强劲的增长势头。1.1.5.1 拉曼光谱技术在考古中的应用 拉曼光谱技术已在宝石学的理论研究和实际鉴定领域发挥了重要的作用6,7。拉曼光谱技术可以对宝石内部的化学成分进行准确的鉴定，进而提供宝石的成因及产地信息。拉曼光谱测试的微区可达 1-2 m，能够探测宝石及其微小的杂质，鉴别用于强化颜色和冲天裂隙的有机或无机参杂物，可实现有效、快速、无损的宝石类别鉴定。拉曼光谱技术已成功用于珍贵艺术品、手稿、颜料、古陶瓷和壁画等领域的考古和鉴定研究8,9。近年来，便携式拉曼光谱仪的出现为许多大尺寸考古样品的原位无损检测提供了许多便利。古生物、古陶瓷、玻璃、宝石、木乃伊等古代文物的拉曼光谱研究已有许多报道，这些结果对于文物年代与归属的判别以及文物的保存和修复提供了坚实的科学依据。拉曼光谱在考古领域中的应用及其发挥的作用见下表 1-110。1.1.5.2 拉曼光谱技术在安检和刑侦中的应用 拉曼光谱技术在安检、刑侦和突发事件处理等领域中的应用正逐渐得到人们的认可，发挥着越来越重要的作用。第一章 绪论 8 表 1-1 拉曼光谱在各种考古制品当中的应用 考古制品 拉曼光谱在其中的主要作用 古代颜料（墙壁绘画颜料、陶瓷玻璃颜料、书画颜料）鉴定颜料结构和成分，可用于古代颜料合成技术研究、文物年代及颜料材料来源、文物保护和修复等方面 古金属制品（青铜器、其他古金属制品）鉴定金属表面及包裹物结构和成分，可以对古金属制品的表面腐蚀、古代冶金技术、古物的防腐保护等方面进行研究 古石和古玉（古石质建筑、装饰材料、石质制品）、古玉器 鉴定石料结构和成分，可用于古建筑和古石质工艺技术及保护研究，以及古玉成分、地域来源及真伪鉴定等方面 古陶瓷、玻璃制品 鉴定陶瓷、玻璃的矿物组成成分，可以鉴定古陶瓷的产地、年代、及对古代陶瓷的烧结工艺技术及发展过程、有色玻璃的工艺技术过程等方面的研究 植物纤维（古纺织品、松香、树脂）鉴定其组成及成分，可以用于鉴定古代纺织品和家庭用品，以及对植物纤维保存状态的方法等方面进行研究 古生物材料（皮肤、头发、牙齿、骨、象牙）可以探知生物材料的保存状态、决定活体死亡的原因和死后尸体处理、解析疾病或是死后皮肤损害的尸体艺术、确定生物材料的动物种类等 在安检方面，便携式拉曼光谱非常适合于机场、码头等口岸对旅客随身携带的瓶装液体或袋装固体物品进行现场检测11,12。拉曼光谱可以在不开启包装情况下快速确定液体和粉末物质的化学成分，判定被测物是否为易燃易爆品，以及是否含有毒品或违禁品。在刑侦方面，借助无损鉴定的优越性，拉曼光谱技术已广泛应用于各类理化物证的鉴定工作，为侦查工作提供线索，为法庭审判提供佐证。目前，在油墨、纸张、爆炸物、射击残留物、纤维、玻璃、泥土、涂料以及化妆品等刑侦鉴定方面已有相关研究报道13,14。在突发事件处理中，拉曼光谱可用于危险品溢洒、生物战剂和化学战剂的快第一章 绪论 9 速识别等方面15,16。采用远距离拉曼光谱仪还可对大气，难以接触到或不能接触的岩矿、艺术品以及生活在极端环境下的微生物进行遥测分析。1.1.5.3 拉曼光谱技术在石油化工行业的应用 有关石油化工行业应用拉曼光谱技术进行研究的报道较少，主要集中在国外研究，而国内相关报道甚少。但表 1-2 展示出拉曼光谱技术拥有在石油化工领域应用的巨大潜力。表 1-2 拉曼光谱技术在石油化工行业应用汇总 项目 烃类组成分析 醇类、醚类、苯、甲苯、乙苯、邻甲苯、间二甲苯和二甲苯定性和定量分析 汽油 醚类汽油氧含量、乙醇汽油氧含量、乙醇汽油乙醇含量、研究法辛烷值（RON）、马达法辛烷值（MON）、抗暴指数、饱和蒸汽压、密度、苯含量、挥发指数、硫含量、烯烃、芳烃、馏程 柴油 十六烷值、十六烷值指数、密度、年度、馏程、硫含量、生物柴油含量 航煤 闪点、馏程、芳烃含量、粘度 输油管线油品混油监控 油品种类鉴别 油品在线调和 汽油调和以及芳烃生产 1.1.5.4 拉曼光谱技术在生物医学中的应用 若生物分子的内部结构或成分（比如 DNA、脂类、蛋白质）发生改变，则会导致细胞或组织发生病变。人体的组织或细胞含有大量的水分，由于水的拉曼散射效应极弱，而对于其他生物物质则带有丰富的拉曼信息。因此，拉曼光谱技术在医学检测和诊断领域的应用已经引起了人们的重视。在癌症诊断方面，拉曼光谱可对组织病理切片、原位组织、患者血清和单细胞进行检测，研究表明拉曼光谱结合化学计量学方法（主成分分析、线性判别函数、支持向量机和神经网络）能够鉴别正常组织、良性病变、癌前病变和恶性肿瘤17-19。第一章 绪论 10 除癌症外，拉曼光谱还用于其他疾病的诊断研究20,21。如，皮肤病、冠状动脉硬化动脉管壁生化结构成分的研究、痴呆症患者脑部组织切片的检测、尿结石和胆结石的化学成分及结石类型等。1.1.5.5 拉曼光谱技术在食品中的应用 在食品真伪和掺假识别方面，拉曼光谱结合化学计量学方法已被应用于酒、果汁、蜂蜜和橄榄油等食品的真伪识别和产地识别。拉曼光谱还用于食用油和油脂种类的识别分析22,23。利用拉曼光谱与多元校正方法可测定食品中某些成分的含量24,25，如鲑鱼肉中的类胡萝卜素的含量、功能食品真能过低聚糖含量、牛奶中的奇数碳链和支链脂肪酸含量以及酒中的乙醇和甲醇含量等。1.1.5.6 拉曼光谱技术在药物中的应用 拉曼光谱在药物分析中的应用较为广泛，设计领域包括原料的鉴别分析、制药过程的监测分析以及药品的真伪识别等。在制药过程中，拉曼光谱结合模式识别和多元校正方法可在线或离线测定药片活性组分含量和包衣厚度及其一致性26,27，在线检测药物混合过程的均匀性，以便及时判断混合过程的终点。拉曼光谱技术已被应用于药物合成过程的检测分析。例如，可以同时测定生化反应器中葡萄糖、乙酸、甲酸和苯基丙氨酸等多组分的浓度。在成品药分析方面，拉曼光谱结合多元校正方法可在不破坏包装的情况下快速测定药物中的有效成分含量28,29。拉曼光谱结合模式识别方法分辨真假药方面已有较多的研究报道30,31。此外，拉曼光谱技术还可用于药品储存时间的预测分析，以及药物组成与其稳定性关系的研究32。1.2 表面增强拉曼光谱概述 1928 年，继德国物理学家 A.Smekal 预言拉曼散射存在之后，印度物理学家 C.V.Raman 在液体苯散射光谱的实验中观察并证实到这一现象的存在33，然而此时的拉曼散射信号极其微弱34。虽然拉曼光谱可以提供分子层面上的结构信息，可以根据不同样品的特点选择不同的激发波长，可以直接进行水溶液的测量，但其最大的缺点是灵敏度不足，空间分辨率受到衍射极限的限制。正因如此，拉曼光谱的应用范围受到了限制，仅是作为红外光谱的补充而使用。随后，表面增强拉曼光谱技术的发现及使用在很大程度上弥补了这种缺陷。表面增强拉曼光谱克服了拉曼光谱灵敏度低的缺点，可以获得常规拉曼光谱所不易得到的结构信第一章 绪论 11 息，被广泛用于界面和表面科学、材料分析、生物、医学和环境等领域。在界面和表面科学领域可以有效地分析化合物在界面的吸附取向、吸附态的变化、界面信息，这极大地拓展了拉曼光谱技术在该领域的应用35。1.2.1 表面增强拉曼光谱的发现和发展 1974 年，英国 Fleishmann 研究小组发表了第一篇有关表面增强拉曼光谱的文章。在文章中，他们报道了粗糙的银电极表面吡啶分子的高强度拉曼散射信号，但是 Fleishmann 将这种高强度的信号归结于电极表面的粗造化引起的电极表面积的增加，而没有意识到粗糙表面对吸附分子的拉曼光谱信号的增强作用35。1977 年，Van Duyne 36以及 Creighton 37两个研究小组各自独立地发现，吸附在粗糙银电极表面的每个吡啶分子的拉曼信号要比溶液中单个吡啶分子的拉曼信号大约强 106倍。他们认为，这种异常高的拉曼信号的增强并不是由于银电极表面粗糙化后吸附的散射物质数量的增加，而必然存在某种新的物理效应。这种可以使拉曼信号增强 105-106倍的拉曼散射增强现象被称为表面增强拉曼散射（Surface Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）。1997 年，Nie 等人38以单个银粒子为 SERS 基底检测到了单分子，发现单分子下的增强因子高达 1014。这一重大的发现立刻在化学界和物理学界引起了极大地影响，相关理论和实验研究迅速开展起来，尤其是在表面科学领域的空前应用39,40。上世纪末，有关表面增强拉曼光谱的研究获得了突破性的进展。一方面，检测灵敏度得到相应的改善，这使得 SERS 技术成为新兴的单分子科学的有效检测手段之一。高达1014-1015的增强因子可在特定银溶胶纳米粒子表面获得，这有助于我们成功地研究吸附在单个溶胶颗粒表面的单个分子的拉曼光谱，更有利于拓宽 SERS 的应用范围，并为深入了解 SERS 增强机理等提供了重要信息41。另一方面，SERS 增强基底的材料已经由有限贵金属拓宽到过渡金属，基底材料选择性的扩宽在一定程度上促进了 SERS 的发展。而值得研究人员注意的是，纳米技术的兴起为制备新型的 SERS 活性基底提供了可能性，对 SERS 机理研究起到了推动作用。1.2.2 表面增强拉曼光谱的增强机理 表面增强拉曼光谱技术由发现到现在已经将近四十年了，该技术早已应用于各个研究领域。但有关其增强机理部分的解释至今仍无法给出确定的结论。到目前为 止，学术界普 遍认同的 SERS 增强机理主要有电磁 场增强机理（Electromagnetic Enhancement，EM）和化学增强机理（Chemical Enhancement，CM），而前者被普遍认为起决定作用42,43。第一章 绪论 12 1.2.2.1 电磁场增强机理 电磁场增强（EM）机理是一种物理模型，是由于入射光和散射光与基底之间的相互作用而产生。当入射光照射到具有一定表面粗糙度的金属基底时，该表面的局域电磁场被增强，进而拉曼散射强度也相应的被增强。这种增强效应受到金属纳米粒子的聚集状态、大小和形状的影响。该模型主要包含以下几种常用模型：1)表面等离子体共振（Surface Plasma Resonance）：在所有物理模型中，该模型在理论和实验上的研究都是比较广泛的，是电磁场增强的主要来源40,44。该模型可解释为：当入射光照射到具有一定粗糙度的金属表面时，位于金属表面的等离子体受到激发而跃迁到较高的能级，并与光波的电场发生耦合而共振，造成金属表面的电场增强，最终产生较强的拉曼散射。2)避雷针效应（Lightning Rod Effect）：在金属粗糙化的过程中往往会产生一些曲率半径非常小的针状纳米级颗粒，在其尖端处往往存在非常强的局域表面电磁场，并且在越小的尖端处，其表面场强越大45。3)镜像场效应（Image Field Effect）：该模型是提出比较早的物理类模型之一。该模型可解释为：当吸附分子与金属表面之间存在足够小的距离时，入射光照射到吸附分子表面而产生的偶极子将在金属内部产生共轭的电偶极子，这将在金属表面形成镜像光电场。于是，新形成的镜像光电场将随同入射光共同作用于吸附分子，从而使其表面拉曼信号得到增强，这种效应称之为镜像场效应。吸附分子与金属表面之间的距离越短，这种镜像场效应越加剧，属于极短程效应46。1.2.2.2 化学增强机理 然而在实际的应用中，尚有许多实验现象不能用上述模型进行解释，归纳如下4：1)当分子吸附到同一 SERS 增强基底时，增强效应的大小受到吸附分子的种类及其振动模式的影响，存在明显的差异性。2)当化学吸附和物理吸附同时存在时，前者可以观察到强大的增强效应，而后者却微乎其微，甚至无法观测到拉曼信号47。3)当几个单分子层的分子连续吸附到金属基底的表面时，第一层中分子的SERS 强度要比其它几层中分子的 SERS 信号强 100 倍以上48。4)SERS 强度不与激发光频率的四次方成正比。以上这些实验现象说明，还有其他未知的增强模型与电磁场增强模型同时存在。为解决上述无法解释的实验现象，SERS 研究的科学家们进而提出了化学增强机理。目前比较常用的化学增强机理模型有以下两种：第一章 绪论 13 1)活位模型：此模型否定了之前认为的所有基底表面分子对 SERS 信号的贡献作用。它认为只有那些吸附在基底表面某些被称为活位上的分子才有强的SERS 效应49。有研究发现，利用电化学方法对银电极表面进行粗糙化后，采用欠电位法沉积上覆盖度为 3的 TI，此时发现吸附分子的 SERS 信号消失。该研究结果证明：能产生 SERS 的活位只占基底表面很小的一部分面积。2)电荷转移模型：该模型普遍用于解释化学增强机理，认为电荷的转移作用促成了化学增强。模型认为，吸附分子的极化率由于吸附分子与金属基底间的电荷转移而发生改变，由此产生 SERS 效应。然而至今尚没有一个完善的理论用于解释所有的实验现象，但 SERS 的研究人员普遍认为电磁场增强和化学增强可能同时存在于拉曼信号的增强过程中，只是两者之间的贡献程度可能因被测物质的不同而变化。1.2.3 表面增强拉曼光谱的活性基底制备 在 SERS 实际应用中，入射激光波长、激发强度、金属 SERS 活性基底作为三大重要因素而受到研究人员的重视。其中，实现 SERS 高灵敏度度测量的最关键技术是制备出增强能力强和稳定性很好的表面增强拉曼光谱活性基底50。因此表面增强拉曼光谱的活性基底制备一直是该领域的研究热点之一。一方面，SERS 活性基底的发展是进一步拓宽 SERS 应用范围的必要条件；另一方面，制备有规则结构的 SERS 活性基底可以为理论研究提供理想的模型以检验 SERS 增强机理51。SERS 活性基底制备方法的多样性决定了 SERS 技术的多样性。通常，在实际应用中，需要根据特定的体系选取合适的 SERS 基底。一种性能优良的SERS 活性基底应该