欧石楠体细胞胚发生过程中的甲基化研究.docx

欧石楠体细胞胚发生过程中的甲基化研究姚培娟李际红木亓晓王锦楠(山东农业大学林学院，农业生态与环境重点实验室，山东泰安271018)摘要：利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)方法，对欧石楠大田苗、胚性愈伤组织和再生苗的DNA 甲基化进行了研究。本试验从64对选扩增引物中筛选出19对，共扩增得到506条带，统计显示， 大田苗、胚性愈伤组织和再生苗的全基因组DNA甲基化水平分别为3142、2786和2905， 三种试材之间发生甲基化变异的有175条带，变异率为3458。对比发现，体胚诱导形成胚性愈伤组织过程中，甲基化水平降低，而在再生苗中有所恢复，与大田苗接近。在外侧胞嘧啶甲基 化水平卜，胚性愈伤组织的甲基化水平有所增加，且在再生苗中可部分维持。分析3种试材之间 175条变异带的DNA甲基化变异带型发现，再生苗中恢复到大舀苗DNA甲基化模式的有62条 变异带，占总变异条带的3543，而与胚性愈伤组织维持相同DNA甲基化模式的有59条变异 带，占337l；通过对部分甲基化变异条带的回收，最终得到8条有效的基因组DNA序列， BLASTn比对分析表明，欧石楠基因组中包括抗性基因、蛋白激酶、质体基因等在内的多种类 型的DNA序列中均存在DNA甲基化修饰现象。关键词：欧石楠；DNA甲基化；体胚发生；胚性愈伤组织；再生苗DNA Methylation in Somatic Embryogenesis of Erica carnea LYA0 PeiJuan；LI JiHong+；OI Xiao；Wang JinNanKey Laboratory ofAgricultural Ecology and Environrnent,College ofForestry，Shandong Agricultural University,Tai'a11Shandong 271018,ChinaAbstract：The DNA methylation of Erica carnea Field seedlings，embryogenic callus and regenerated seedlings were analyzed by methylation sensitive amplified polymorphism(MSAP)methodHere，1 9 pairs of amplification primers had been dug out from 64 pairs，and 506 bands were got by amplification The results showed that wholegenomic DNA methylation levels of Field seedlings，embryogeniccallus and regenerated seedlings were 3 1422786and 2905respectively,and 1 75 bands presented 3458ofmethylation mutation rateamong three kinds of test materialsBy comparison methylation level of embryogenic callus reduced in process of induction of somatic embryos，and recovered close to ficld seedlings in the regenerated seedlingsOn lateral cytosine methylation level，it was increased in embryogenic callus，and could partially maintain inregenerated seedlingsBy analyzing 1 75 mutation bands among three kinds of test materials，among them，62 bands from regenerated seedlings returning to field seedlings ofDNAmethylation pattern accounted for 3543 of mutation bands，while 59 bands from regenerated seedlings maintaining the same DNA methylation pattern with embryogenic callus accounted for 337lEight methylated DNA sequences were isolated and sequenced by extracting part of the amplificated sites，The DNA methylated modi矗cation phenomenon existed in multiple types of DNA sequences by BLASTn comparison，including resistancegene sequences，protein kinase，plastogene，etcKev words：Erica carnea L|：DNA methylation；somatic embryogenesis；embryogenic callus： regeneration plant欧石楠是2006年我们课题组从德国引进的适合我国北方广大地区的地被开花植物，为迅速推广应用我们己成功建立了欧石楠体胚繁育技术体系。然而体细胞无性系变异在植物组织培养中 是一种普遍现象， DNA甲基化变化作为体细胞无性系变异的分子机制之一，广泛存在于组织培养过程(Kaeppler等2000)。目前，关于DNA甲基化变异在组织培养过程中的作用机制虽然还没被完全揭示，但许多研究已显示DNA甲基化以多种变异形式出现在植株再生过程中，且在组织培养过程中高频 发生(鲍智娟2009)。近年来，利用MSAP技术，对啤酒花(Humulus lupulus LCVChinook)、豌豆(Pisum sativum L)、野生大麦(Hordeum brevisubulatum(Trin)Link)、香雪兰(觑esia hybrida)、大叶蝴蝶兰(Phalaenopsis bellina(Rchbf)Christenson)、大花君子兰(Clivia miniata)币I茄子(Solanum melongena L)等植物组织培养过程中DNA甲基化变异的研究已有报道(Peredo等作者简介姚培娟(1989一)，女，河北沧州人，就读于山东农业大学林学院林木遗传育种专业。 ：+通讯作者E-mail：jhli4856163com5912006；Smykal等2007；Li等2007；Gao等2010；Amir等2010；Wang等2012；Mallaya和 Ravishankar2013)。其研究多集中于禾本科植物及蔬菜作物中，对于木本观赏植物还鲜有报道。 目前我们己建立了成熟的欧石楠体胚再生体系，为了检测体胚再生方式形成的再生苗，在表观遗 传方面是否存在变异，对其胚性愈伤组织和再生苗与大田苗之间DNA甲基化水平和模式的变异进行研究。本试验利用MSAP技术，以山东农业大学林学实验站的7年生欧石楠大田苗(CK)和实验室 已有的胚性愈伤组织(E)以及胚性愈伤组织诱导的再生苗(s)为材料，对欧石楠胚性愈伤组织、再 生苗与大田苗之间的胞嘧啶甲基化水平和模式的变异进行分析，明确其变异趋势，以期从DNA 甲基化层面揭示欧石楠体胚再生过程中发生的DNA甲基化变异情况，为欧石楠体细胞胚发生过 程中其表观遗传学特性提供一定的理论依据。1材料与方法11试验材料材料采自山东农业大学林学实验站的七年生欧石楠(Erica carnea L)大田苗的当年生嫩梢 (CK)及取实验室已有的胚性愈伤组织(E)(在12 WPM+I0 mg·LJzT+O3 mgL。IBA培养基上， 培养约50 d)，以表面具球形颗粒，结构致密，颜色嫩黄的胚性愈伤组织为宜(参照李际红2012) 和胚性愈伤组织诱导形成的再生苗(s)，分别采集带回实验室，用于DNA的提取。 12试验方法121 DNA的提取方法按照新型植物基因组提取试剂盒(TianGen)z步骤要求提取上述3个试材的总DNA，所提 DNA经15琼脂糖凝胶电泳检测鉴定其含量及DNA模板的完整性，并用分光光度法定量后， 一20。C保存备用。122 DNA甲基化分析采用甲基化敏感扩增多态。l生(methylationsensitive amplification polymorphism，MSAP)方法，分析所有试材的DNA甲基化状态。分析流程参照魏华丽等的(2010)的方法略有修改，所有接头和引物参照Xiong(1999)，见表1。表lMSAP分析的接头和引物序列：!兰塑旦121宝21 1i!P!：!型2墨里!：竺!塑!垒：坚!些竺!Z坐接头和引物序列正向EcoRl接头5'-CTCGTAGACTGCGTACC一3反向EcoRI接头5'-AA丁TGGTACGCAGTCTAC一3正向HpalIMspl接头5'-GACGATGAGTCTAGAA-3反向HpalIMspI接头5'-CGTTCTAGACTCATC一3预扩增引物Presclective primers(5 7-÷3)EA00+A5GTAGACTGCGTACCAATTCA3HpalI-MspI+T5GATGAGTCTAGAACGGT一3选扩增引物Seleclive primers(5一3)EAOO+ATG5'-GTAGACTGCGTACCAATrCATG一3EA00+ACG5'-GTAGACTGCGTACCAATTCACG一3EA00+ACT5一GTAGACTGCGTACCAATTCACT3EA00+ACA55TAGACTGCGTACCAATTCACA一3EAOO+AGT5 7GTAGACTGCGTACCAATTCAGT3EA00+AGA5GTAGACTGCGTACCAATTCAGA一3EA00+AGG5 7。GTAGACTGCGTACCAATTCAGG一3EAOO+ACC5。GTAGACTGCGTACCAATTCACC一3EAOO+ATC5GTAGACTGCGTACCAAT丁CATC一3HM+丁rc5。GATGAGTCTAGAACGGTTC一3HM+TCG5'-GATGAGTCTAGAACGGTCG3HM+TAG5'-GATGAGTCTAGAACGGTAG3592HpalI和MspI的酶切位点均为(CCGGGGCC)，但二者对酶切位点甲基化修饰敏感性不同， 上勿aII能识别并切割未甲基化和外侧胞嘧啶甲基化位点(smCCGGGGCC)，面不能切割内测胞嘧啶 甲基化位点(csmCGGGG5mcc)：MspI能识别并切割未甲基化和外侧胞嘧啶甲基化位点，而不能 切割外侧胞嘧啶甲基化位点。利用这两种同裂酶分别与EcoRI组合进行MSAP反应时，如果被 内切酶识别，图谱上就会显示有带，记为“1”；如未被识别则显示无带，记为“0”。根据条带的有 无，可将MSAP选扩图谱条带分成四大类：“11”表示H和M泳道都有条带，为I类型，表示未 发生甲基化；“01”表示H泳道无条带，而M泳道有条带，为II类型，表示发生全甲基化；“10” 表示H泳道有条带，而M泳道无条带，为III类型，表示发生半甲基化；“00”表示H和M泳道 都无条带，为IV类型，表示没有CCGG位点存在(李际红等201 1)。123 DNA甲基化变异模式 为了更好的分析和统计胚性愈伤组织与再生苗的DNA甲基化变异模式，我们将大田苗，胚性愈伤组织以及再生苗三种试材之间的DNA甲基化模式变异类型划分为四种类型：一类是在胚 性愈伤组织中DNA甲基化模式已经发生了变异，而再生苗恢复到之前的甲基化模式；二类是胚 性愈伤组织中变异了的DNA甲基化模式在再生苗中可维持；三类足在胚性愈伤组织中已经发生 了变异的DNA甲基化模式，在再生苗中却又发生新的甲基化变异：四类是在胚性愈伤组织中没 有发生DNA甲基化模式变异，而再生苗中却发生了甲基化模式变异。124 DNA甲基化变异率计算 在两组内切酶消化产物的MSAP扩增图谱中，有一些片段是不同材料共有的片段f非变异片段)，而有些片段中发生了部分材料片段的变异，称这些片段为变异片段。DNA甲基化的变异率 m)=产生变异的片段数(产生变异的片段数+非变异的片段数x 100。 125甲基化变异片段的回收、克隆及测序采用回收试剂盒(OMEGA)回收所有甲基化变异片段，克隆的甲基化变异片段，与 pTZ57RT(TaKaRa)载体连接，连接反应在22进行；测序由上海生工公司进行。将所得的甲基 化差异序列用BLASTn程序在NCBI( ：wwwncbinlmnihgov)上进行同源性检索，以确定其 基因功能。2结果与分析21欧石楠的MSAP扩增图谱采用优化的MSAP技术体系，对欧石楠大田苗、胚性愈伤组织以及再生苗进行分析，获得 了谱带清晰，重复性好，甲基化修饰位点丰富的MSAP扩增图谱(图1 o依据方法122中对胞 嘧啶甲基化带型的分类，从64对选扩增引物中筛选出的19对引物，共扩增产生506条清晰可 辨且可重复的DNA条带，平均每对引物扩增获得2663条带(表21。593M随删烈SH岛i M口叫髓尉SH涮 M凸I叫l蹦sH SM X傩诫班f咧si瓢图1欧石楠基因组DNA的MSAP扩增图谱Fig1 MSAP fingerprints of genomic DNA in E carnea1：非甲基化位点：II：全甲基化位点：III：半甲基化位点。CH：CK的EcoRI+坳口11双酶切：CM：CK的EcoRI+Mspl双酶切： EH：胚性愈伤组织的EcoRl+HpaII双酶t：JJEM：胚性愈伤组织的EcoRl+MspI双酶切；SH：再生苗的EcoRl+HpaII双酶切：SM： 再生苗的EcoRI+MspI双酶切：M：100bp的DNA分子量标准：AD：不同选扩引物扩增结果22欧石楠3种试材的DNA甲基化修饰水平由MSAP扩增图谱带型统计可知(表2)，大田苗、胚性愈伤组织以及再生苗的全基因组甲基 化水平分别为3142、2786、2905，可明显看出，大田苗的全基因组甲基化水平最高，再 生苗次之，胚性愈伤组织最低，由此得出在胚性愈伤组织发生过程当中，以去甲基化为主，而在 再生苗诱导过程中却以重新甲基化为主，使得再生苗甲基化水平与大田苗相接近(图2)。从外侧 胞嘧啶甲基化水平看，胚性愈伤组织的半甲基化水平高于大田苗，说明在胚性愈伤组织发生过程中，虽然以去甲基化为主，但同时也存在高频的外侧胞嘧啶重新甲基化。对比内侧胞嘧啶甲基化 和外侧胞嘧啶甲基化修饰水平，3种试材的内侧胞嘧啶甲基化水平均高于外侧胞嘧啶甲基化水平 (图2)，由此可知DNA甲基化的发生以双链内侧胞嘧啶甲基化为主。表2 19对MSAP选扩引物组合在欧石楠全基因组中的检测结果!：邕旦翌!：21 11望坐竺21i!i!璺竺!i翌g!坚i丝：!垒!P巫巴!坚12尘!i翌型i2呈：i呈量：丝2丝E引物HM引物扩增位点娑基化警sC全甲K基化位E点s弘2786巧口外侧胞嘧啶iii内测胞嘧啶巧目全基因组DMm00大田茁(cK)胚性愈伤组织再生苗图2 DNA甲基化水平Fig2 The DNA methylated levels23欧石楠3种试材之间的DNA甲基化变异从MSAP图谱=显示的3种试材的DNA甲基化带型可知，欧石楠大田苗、胚性愈伤组织和 再生苗之间存在DNA甲基化变异。从扩增出506条带中，发生DNA甲基化模式变异的有175 条带，其变异率为34，58，就其甲基化变异条带进行如下分析。 231胚性愈伤组织与大田苗、再生苗与胚性愈伤组织之间的DNA甲基化变异模式根据大田苗到胚性愈伤组织、胚性愈伤组织到再生苗之间条带的变异，可将其分为4大类和 12亚类，即A为由未甲基化的位点，到发生了变化的位点：B为由外侧胞嘧啶半甲基化的位点， 其后又发生了变化的位点；C为由内侧胞嘧啶完全甲基化的位点，之后又发生了变化的位点：D 为由外侧胞嘧啶或者内侧和外侧胞嘧啶位点均完全甲基化，而下一过程又重新出现带的位点。175条变异带的变异模式见表4。表3 3种欧石楠试材两者之阊的变异模式!：!盟!i2翌P!垡!翌：!竖：翌!垒竖：2翌!：i!：i2墨生：2 122：2ClassBeforePatternAfterNumber ofbandsHMHMr¨A川O 6舵O 3躬 00张m，们体 BO阱， 。 7陀O， 6盼00他c0a， 4晓0¨。oQ00 3DOOm，控眦0H09k湛勰甜m，悦M条带的对比分析可知，相对于大田苗，胚性愈伤组织的带型变异主要表现为新条带的出现， 产生63条新带，占152个多态性位点的4145。通过对再生苗和胚性愈伤组织的变异带分析 可知，带的消失即重新甲基化是在这一过程中主要发生的事件(表3中A3，B3和C3)。在所有 发生变异的带型中，内外侧甲基化位点的转换频率最低，即带(1 0)和带(O 1)的转换(表3 B2和 c2)。23，2三种试材之间的DNA甲基化变异模式依试验方法3甲基化变异模式的分类，分析获得的175条变异带(图3)可知，再生苗恢复到595与大田苗带型一致的有62条带(图3；图4a)，占变异条带的3543，为四种变异类型中所占比 例最高的。胚性愈伤组织发生变异，并在再生苗中可维持的有59条带(图3；图4b)，比例为3371， 其中以外侧胞嘧啶甲基化变异的遗传稳定性最好。胚性愈伤组织中已经发生了变异，而再生苗中 发生新甲基化变异的比例为1886。胚性愈伤组织没发生变异，而再生苗却发生甲基化模式变异的比例为12。由以上两种变异模式可以看出，胚性愈伤组织形成和再生苗诱导两过程均存在丰富的DNA 甲基化变异模式。胚性愈伤组织中发生的甲基化变异在再生苗中大部分会有所恢复，而在再生苗 中表现的变异多为外侧胞嘧啶半甲基化。40354335337130摹25 丑 捂20咪制15圻10a0第一类第二类DNA甲基化变异类型图3胚性愈伤组织、再生苗与大田苗之间的变异模式Fig3 Variation patterns among embryogenie callus，regeneration plantlets and CKcf渊疆EM s缸sI蹦cM El!酬slI谢C鞋烈EH翻SH铽旬专I钾勺钾气。写图4胚性愈伤组织、再生苗与大田苗的DNA甲基化变异模式的MSAP图谱Fig4 MSAP fingerprints of variation patterns among embryogenic callus，regeneration plantlets and CKI：非甲基化位点；IlI：半甲基化位点：a：第一类；b：第二类；c：第三类捆：第四类AC：不同选扩引物扩增结果24 DNA甲基化变异片段的回收检测及序列分析对部分产生甲基化变异的修饰位点进行回收克隆，最终成功分离了8条发生甲基化变异的 DNA序列(表4)。BLASTn比对分析表明，这8条甲基化变异序列均检索到同源系列，包括抗性基因(M5)、蛋白激酶6(MKK6)(M12)、环斑病(PRSV)外壳蛋白(M19)、茶树连锁图谱中 相关基因(MI 1)、质体(M20、M30)、切割和多聚腺苷酸化特异性因子亚单位(M24)和大豆 转基因无性系(M29)，说明多种类型的基因组DNA序列均存在DNA甲基化修饰现象，可以 看出欧石楠体胚诱导发生过程中发生了广泛的甲基化变异。表4甲基化片段序列分析!塾曼!皇墨!理!里!鱼!坐!塾Y!璺!垒鱼翌墨堡!望!序列长度bp条带同源序列一致性E值3讨论早在1994年，Phillips等就提出，DNA甲基化变化可能是体细胞无性系变异的一个重要原 因。Shawn等(2000)指出，再生苗及其后代中存在广泛的DNA甲基化模式变异。Prakash等(2003) 利用两组同裂酶(Hpa II和MspI)对矮牵牛叶片再生苗诱导过程中，愈伤组织和再生苗的CCGG 位点进行酶切分析，得出胞嘧啶甲基化水平与叶片诱导再生苗的能力存在很强的正相关。本研究 利用MSAP技术，对欧石楠胚性愈伤组织、再生苗与大田苗之间的DNA甲基化水平和模式的变 异进行了分析，发现胚性愈伤组织与大田苗相比，胚性愈伤组织的全基因组DNA甲基化水平有 所降低；与胚性愈伤组织的DNA甲基化水平(2786)相比，再生苗的DNA甲基化水平(2905) 有所回升，接近大田苗的甲基化水平(3142)。本研究得到的胚性愈伤组织甲基化水平的变异趋势，与大豆_(Quemada等1987)、玉米 (Kaeppler和Phillipsl993)、刺五加(Chakrabany等2003)、油棕(Kubis等2003)以及大麦(Li等2007) 等的报道一致，却与香蕉(PerazaEcheverria等2001)和豌_再(Smykal等2007)上的研究结论不同。 观察欧石楠通过体胚诱导繁育获得的再生苗的甲基化水平变化，可以推知其遗传稳定性较高。 Kubis等(2003)幂0用HPLC对油棕愈伤组织和再生苗甲基化变异进行检测得出，愈伤组织形成过 程中，全基因组DNA甲基化水平有所下降，但再生苗中会部分恢复，并接近正常苗水平。由此 推知不同植物无性系繁殖获得再生植株过程中，存在相似的甲基化水平变异趋势。欧石楠胚性愈伤组织的全基因组DNA甲基化水平虽然有所降低，但其外侧胞嘧啶甲基化水 平却有所增加，再生苗中也持续此变化(图3)。与苗高健(2009)在水稻上的研究结论一致，而xu 等(2004)在玫瑰愈伤组织中检测发现，其外侧胞嘧啶甲基化水平显著下降，与本实验结论存在分 歧；再生苗又恢复到之前的DNA甲基化模式，与欧石楠再生苗诱导形成过程中甲基化水平变异 模式一致。关于愈伤组织形成过程中DNA甲基化水平的变异虽然存在多种报道，但再生苗诱导 发生过程中大多数变异逐渐恢复的趋势却是一致的。这可能与愈伤组织培养过程中所用的外源激 素有关。对欧石楠组织培养发生的胚性愈伤组织和诱导形成的再生苗的胞嘧啶甲基化变异模式具体 类型进行统计分析发现，发生变异的1 75条带中，有62条(3543)在胚性愈伤组织形成过程中 发生变异的条带又恢复到之前大田苗的甲基化模式，与聂丽娟(2008)对菊花的报道一致；另一方 面，175条变异带中3371的变异带型却可在再生苗中持续下去，大部分为外侧胞嘧啶甲基化， 与番茄(Smulders等1995)研究结论一致。Smulders等(1995)币0用探针技术对番茄愈伤组织和再生 苗叶片甲基化模式进行比较，发现没有发生内测胞嘧啶甲基化变异，仅存在外侧胞嘧碇甲基化变 异，且在再生苗中可以部分持续，且遗传给后代，虽与本实验所用研究技术不同，但却获得与本实验一致的结论，进一步说明，胚性愈伤组织发生过程中存在此类甲基化变异现象，且可部分遗 传，其机理有待进一步研究。本实验中取得了8条存在有效比对结果的序列，涉及抗性基因、蛋 白激酶、质体基因等多种基因，这些基因都存在甲基化变异修饰现象。参考文献1鲍智娟植物组织培养巾体细胞无性系变异的研究进展白城师范学院学，2009，23(6) 2李际红，邢世岩，王聪聪，张侍，付茵茵。银杏基因组DNA甲基化修饰位点的MSAP分板园艺学搬，201 l，38(8)：14291436 3李际红，邢世岩+，姚培娟，谭起航，王海林欧石楠体细胞胚发生和植株再生植物生理学报，2012，48(11)：104310495974孟凡志，徐力，戴百荣，赵祥文欧石楠的适应性及其栽培山东林业科技，2004，f4)·33345苗高健水稻胚性愈伤组织诱导和植株再生伴随DNA胞嘧啶甲基化的减少和恢复f学位论文长春：东北师范大学，2009【6j聂丽娟，王子成，何艳霞菊花组织培养继代过程中的DNA甲基化变化园艺学报，2008，35 f“)：1689-1694 7沙文勇欧洲常绿地被植物欧石楠和彩萼石桶中国花卉园艺，2002，(9)1415 8魏华丽，吴涛，杨文华，李万峰，张俊红，齐力旺，韩素英落叶松体细胞胚胎发生过程中DNA甲基化模式变化分析东北林业大学学报，201139(2)：3337f9Amir AK，Urea RS，Midhzar AK，Maziah M，Sreeramanan S，Detection of somaclonal variation by random amplified polymorphic DNA analysis during micropropagation ofPhalaenopsis belhna(Rchbf)christenson African Joumal ofBIotechnoIogy，2010，9(40t：66326639 f10ChakrabartyD，YuKW PaekKYDetection ofDNAmethylation changes during somatic embryogenesis ofSiberian ginseng(Eleuterococcus senticosus)Plant Sci2003，165：61-681 1Fraga HPF,Vieira LN，Caprestano CA，Steinmacher DA，Micke GA，Spudeit DA，Pescador R，Guerra MP 5-Azacytidine 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