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实验三：目的基因克隆PCR技术 【课前预习】 PCR (polymerase chain reaction) 反响的根本原理。 【目的要求】 1学习和掌握 PCR 反响的根本原理与实验技术方法。 2认真完成每一步实验操作，详细记录实验现象和结果并加以分析和总结。 【根本原理】 类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性-退火-延伸三个根本反响步骤构成：模板 DNA的变性：模板 DNA 经加热至93左右一定时间后，使模板 DNA双链或经 PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作准备；模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反响原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保存复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保存复制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟，23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 【实验用品】 1材料：重组质粒DNA作为模板 2器材和仪器：移液器及吸头，硅烷化的 PCR 小管，DNA扩增仪(PE 公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机 3试剂： 10×PCR 反响缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在 25下, pH9.0, 1.0 Triton X-100。 MgCl2 ：25mmol/L。 4 种 dNTP 混合物:每种 2.5mmol/L。 Taq DNA聚合酶 5U/l。 T4 DNA连接酶及连接缓冲液： 【方法步骤】 一PCR反响 1. 依次混匀以下试剂 35l H2 O 5l 10×PCR反响缓冲液 4l 25mmol/L MgCl2 4l 模板DNA(约1ng) 混匀后离心5秒。 2. 将混合物在94l约2.5U，混匀后稍离心,参加一滴矿物油覆盖于反响混合物上。 3. 用94变性1分钟，45退火1分钟, 72延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72下保温10分钟，使反响产物扩增充分。 4 电泳 按前所述,取10l扩增产物用1琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反响产物及长度。 注意 1. PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。 2. 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。 3. 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再翻开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。 4. 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。 【实验结果】 【考前须知】 微量操作、PCR 反响体系的设计、引物设计、扩增条件的优化 【思考题 】 1. 降低退火温度对反响有何影响？ 2. 延长变性时间对反响有何影响？ 3. 循环次数是否越多越好？为何？ 4. PCR有哪些用途？举例说明。 附：PCR知识(供参考) 一PCR 反响体系与反响条件 标准的 PCR 反响体系： 10×扩增缓冲液 10ul 4 种 dNTP 混合物 各 200umol/L 引物 各 10100pmol 模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5u Mg2+加双或三蒸水至 100ul PCR 反响五要素： 参加 PCR 反响的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+ 引物： 引物是 PCR 特异性反响的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理 论上，只要知道任何一段模板 DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原那么： 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 引物扩增跨度： 以 200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。 引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，防止5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 防止引物内部出现二级结构，防止两条引物间互补，特别是 3端的互补，否那么会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以防止因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。 引物中有或能加上适宜的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量： 每条引物的浓度 0.11umol 或 10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的时机。 酶及其浓度： 目前有两种 Taq DNA聚合酶供给， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反响约需酶量 2.5U(指总反响体积为 100ul 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低那么合成产物量减少。 dNTP 的质量与浓度：dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris。HCl的缓冲液将其 PH调节到 7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。屡次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反响中，dNTP 应为 50200umol/L， 尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等( 等摩尔配制)， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR 反响。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止 RNase降解 RNA。Mg2+ 浓度： Mg2+ 对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反响中，各种 dNTP 浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为 1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反响特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反响产物减少。 PCR 反响条件的选择 PCR 反响条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置： 基于 PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反响中采用三温度点法，双链 DNA 在 9095变性，再迅速冷却至 40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至 7075，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为 100300bp 时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用 94变性，65左右退火与延伸(此温度 Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin足以使模板 DNA变性，假设低于 93那么需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步假设不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性，就会导致 PCR 失败。 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响 PCR 特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至 4060，可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合时机远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于 20 个核苷酸，G+C 含量约 50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择适宜的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T) 复性温度=Tm值-(510) 在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR 反响的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。 延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性： 7080 150核苷酸/S/酶分子 70 60 核苷酸/S/酶分子 55 24 核苷酸/S/酶分子 高于90时， DNA合成几乎不能进行。 PCR 反响的延伸温度一般选择在 7075之间，常用温度为 72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR 延伸反响的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。34kb 的靶序列需 34min；扩增 10Kb 需延伸至 15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 循环次数：循环次数决定 PCR 扩增程度。PCR 循环次数主要取决于模板 DNA的浓度。一般的循环次数选在 3040 次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 PCR 反响特点特异性强 PCR 反响的特异性决定因素为： 引物与模板 DNA 特异正确的结合； 碱基配对原那么； Taq DNA 聚合酶合成反响的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原那么的。聚合酶合成反响的忠实性及 Taq DNA 聚合酶耐高温性，使反响中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。灵敏度高 PCR 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10 -12 g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10 -6 g)水平。能从100 万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达 3 个 RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为 3 个细菌。 简便、快速 PCR 反响用耐高温的 Taq DNA 聚合酶，一次性地将反响液加好后，即在 DNA 扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反响，一般在 24 小时完成扩增反响。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 对标本的纯度要求低 不需要别离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总 RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的 DNA 扩增检测。 PCR 扩增产物分析 PCR 产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。 凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB 溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重 PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。 琼脂糖凝胶电泳： 通常应用 12%的琼脂糖凝胶，供检测用。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳别离效果比琼脂糖好，条带比拟集中，可用于科研及检测分析。 酶切分析：根据 PCR 产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳别离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。 分子杂交：分子杂交是检测 PCR 产物特异性的有力证据，也是检测 PCR 产物碱基突变的有效方法。 Southern 印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与 PCR 产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR 产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。 斑点杂交： 将 PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于 PCR 产物特异性鉴定及变异分析。 核酸序列分析：是检测 PCR 产物特异性的最可靠方法。 PCR 常见问题总结 PCR 产物的电泳检测时间一般为 48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于 48h 后带型不规那么甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR 反响的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及活性 PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有 Taq 酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丧失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看 OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止屡次冻融或长期放冰箱冷藏局部，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR扩增的特异性，浓度过低那么影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR扩增失败而不出扩增条带。 反响体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul。或 100ul，应用多大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否那么容易失败。 物理原因：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。 假阳性出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不适宜： 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性， 因而在进行 PCR 扩增时， 扩增出的 PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反响管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR 方法来减轻或消除。 出现非特异性扩增带 PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR 循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶那么不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。出现片状拖带或涂抹带 PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少 dNTP的浓度。适当降低 Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。 PCR 污染与对策 PCR 反响的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。 污染原因 (一) 标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。 (二) PCR 试剂的污染:主要是由于在 PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被 PCR核酸模板污染. (三) PCR扩增产物污染:这是PCR反响中最主要最常见的污染问题， 因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的 PCR 产物 污染，就可造成假阳就可形成假阳性。还有一种容易无视，最可能造成 PCR 产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比拟剧烈地摇动反响管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷贝，因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题。 (四) 实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比拟常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。 污染的监测 一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。 对照试验 1. 阳性对照:在建立 PCR 反响实验室及一般的检验单位都应设有 PCR 阳性对照，它是PCR 反响是否成功、产物条带位置及大小是否符合理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100 个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一 PCR 试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。 2. 阴性对照:每次 PCR 实验务必做阴性对照。它包括标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。试剂对照:在 PCR 试剂中不加模板 DNA或RNA，进行 PCR 扩增，以监测试剂是否污染。 3. 重复性试验 4. 选择不同区域的引物进行PCR 扩增 防止污染的方法 (一) 合理分隔实验室:将样品的处理、配制 PCR 反响液、PCR 循环扩增及 PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及 PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分标本处理区;PCR 反响 液制备区;PCR 循环扩增区;PCR 产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA 或 RNA。 (二) 吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌屡次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 (三) 预混和分装 PCR试剂:所有的 PCR 试剂都应小量分装，如有可能，PCR 反响液应预先配制好，然后小量分装，-20保存。以减少重复加样次数，防止污染时机。另外，PCR 试剂，PCR 反响液应与样品及 PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。 (四) 防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。 (五) 设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反响都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。 (六) 减少 PCR 循环次数，只要PCR 产物到达检测水平就适可而止。 (七) 选择质量好的 Eppendorf管，以防止样本外溢及外来核酸的进入，翻开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。 参考文献一、主要教学参考书： 1.基因工程原理第二版 .吴乃虎编著，科学出版社 2.分子克隆实验指南 第三版.黄培堂等译，科学出版社 3.基因克隆和DNA分析.魏群等译，高等教育出版社 4.最新分子生物学实验技术梁国栋主编，科学出版 5分子生物学实验指导 主编：魏群 高等教育出版社 施普林格出版社二、 主要参考文献： 1.Cohen, SN, ACY Chang and L Hsu, 1972,Proc.Natl.Acad. Sci. 69:2110. 2.Birnboim, HC and J Doly. 1979.，Nucleic Acids Res. 7:1513. 3.Aaij, C and P Borst, 1972.，Biochim. Biophys. Acta 269:192. 4.Bolivar F, RL Rodriguez, PJ Greene, MC Betlach, HL Heyneker, HW Boyer, JH Crosa, and S Falkow, 1977b,，Gene 2:95. 5.Mullis K, F Faloona, S Scharf, R Saiki, G Horn and H Erlich, 1986.，Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263. 实验四：DNA 的琼脂糖凝胶电泳 【课前预习】 核酸的琼脂糖凝胶电泳原理和方法【目的要求】 1.学习和掌握核酸的琼脂糖凝胶电泳原理和技术方法。 2.认真完成每一步实验操作，详细记录实验现象和结果并加以分析和总结。 【根本原理】 DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重 复性质，相同数量碱基的双链 DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的 DNA 片段迁移速度不一样， 迁移速度与 DNA 分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可别离不同分子量的 DNA，也可以别离分子量相同、但构型不同的 DNA 分子。一般提取的质粒有 3 种构型：超螺旋的共价闭合环状 DNA(covalently closed circular DNA，简称 cccDNA)，开环 DNA，即共价闭合环状质粒 DNA 有一条链断裂，(open circular DNA，简称 ocDNA)，线状质粒 DNA， 即质粒 DNA 在同一处两条链都发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。由于这 3种构型的质粒 DNA 分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现 3 条带，其中超螺旋质粒DNA 泳动最快，其次为线状 DNA，最慢的为开环质粒 DNA。 【实验用品】 1. 材料： 上次实验所获得质粒、1.5mL 离心管、枪头、枪盒 2器材和仪器： 恒温培养箱、琼脂糖凝胶电泳系统、小型高速离心机、高压灭菌锅、紫外核酸检测仪 3试剂： 50xTAE(50 倍体积的 TAE 贮存液)：配 1000mL 50xTAE： Tris 242 g 冰醋酸 57 mL 0.5molL EDTA 200 mL pH 8.0 凝胶加样缓冲液(6x)：溴酚蓝 0.25，蔗糖 40 琼脂糖 µgmL 250bp DNA 分子量标准【方法步骤】 一) 制备琼脂糖凝胶 根据被别离 DNA 的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度线性DNA的有效别离范围kb5601200.70.8100.90.570.460.240.13本实验用 1.2琼脂糖。称取 琼脂糖，放入锥形瓶中，参加 100mL 1xTAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。 (二) 胶板的制备 1取干净的有机玻璃内槽，用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严，不能留缝隙) 2将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。 3将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。 4待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。 5加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面 1-1.5毫米。 (三) 加样 用移液枪将已参加上样缓冲液的 DNA 样品参加加样孔(记录点样顺序及点样量)。 (四)电泳 1接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA 的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5Vcm。 2当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 12cm 处，停止电泳。 (五) 染色 将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200mL1xTAE缓冲液中加两滴2mg/mL的溴化乙锭储存液即可)，在脱色摇床上缓慢摇动下染色20-30 分钟。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境 【实验结果】 在紫外灯(360nm或 254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带。 【考前须知】 1在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的伤害作用 2注意平安，防止污染，戴手套操作。实验五 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质的分子量测定【课前预习】 SDS-PAGE 垂直板型电泳法的根本原理是什么？ 【目的要求】 1了解 SDS-PAGE 垂直板型电泳法的根本原理及操作技术。2学习并掌握 SDSPAGE 法测定蛋白质相对分子量的技术。【根本原理】 SDS-PAGE 电泳法，即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 1在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。 1g蛋白质，使各种蛋白质SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。 3. 当蛋白质的分子量在 15000200000之间时， 电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合以下方程： 1gMr =KbmR式中：Mr 为蛋白质的分子量；K为常数；b 为斜率；mR 为相对迁移率。在条件一定时，b和 K 均为常数。 假设将分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 【实验用品】 1材料标准蛋白: 牛血清白蛋白：Mw=67,000上海生化所；鸡卵清清蛋白：Mw=45,000美国 SIGMA 公司；3胰凝乳蛋白酶原 A：Mw=24,000美国 SIGMA公司；4溶菌酶：Mw =14,300； 未知蛋白质样品：由实验室准备；低分子量标准蛋白质按照每种蛋白 0.51mg·ml-1 样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。 2器材和仪器 100ml 试剂瓶；1000ml 量筒；250ml 烧杯；50ml、100ml 烧杯；10ml或 5ml刻度试管；垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50 或 100l 微量注射器；玻璃板；水浴锅；染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。 3试剂 1别离胶缓冲液Tris-HCl 缓冲液 PH8.9：取1mol/L盐酸 48mL，Tris ,用无离子水溶解后定容至100mL。 2浓缩胶缓冲液Tris-HCl 缓冲液 PH6.7：取1mol/L盐酸 48mL, Tris ,用无离子水溶解后定容至100mL。 330%别离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺Acr 30g及 N，N-甲叉双丙烯酰胺Bis，溶于重蒸水中，最后定容至 100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4保存。 410%浓缩胶贮液：称 Acr 10g及 Bis ，溶于重蒸水中，最后定容至 100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。510%SDS 溶液：SDS 在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。 61%TEMED； 710%过硫酸铵AP：现用现配。 8电泳缓冲液Tris-甘氨酸缓冲液 PH8.3:称取 Tris , 甘氨酸 , SDS , 用无离子水溶解后定容至 1L。 9样品溶解液：取 SDS 100mg，巯基乙醇 0.1mL，甘油 1mL，溴酚蓝 2mg，0.2mol/L，pH7.2 磷酸缓冲液 0.5mL，加重蒸水至 10mL遇液体样品浓度增加一倍配制。用来溶解标准蛋白质及待测固体。 10染色液：考马斯亮蓝 G-250，参加 454mL 50%甲醇溶液和 46mL冰乙酸即可。11脱色液：75mL冰乙酸，875mL重蒸水与 50mL甲醇混匀。 12 KCl HAC(乙酸)洗脱液1000ml； 13蓝色葡聚糖2000。 【方法步骤】 1安装夹心式垂直板电泳槽目前，夹心式垂直板电泳槽有很多型号，虽然设置略有不同，但主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。同学们可根据具体不同型号要求进行操作。主要注意：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净枯燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。 2配胶根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的别离胶浓度。本实验采用 SDS-PAGE 不连续系统，按下表的配制别离胶和浓缩胶。 3制备凝胶板 1别离胶制备按表配制 20ml 10%别离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约 8cm高，用 1ml 注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约 34mm高，以进行水封。约30min 后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，那么表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。 2浓缩胶的制备按表配制 10ml 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的别离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约 处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，防止带入气泡。约 30min后凝胶聚合，再放置 2030min。待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约 以上，即可准备加样。 4样品处理及加样 各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为 0.51mg/mL，沸水浴加热 3 分钟，冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热 1 分钟，以消除亚稳态聚合。 一般加样体积为 1015L即 210g蛋白质。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。 5电泳 将直流稳压电泳仪开关翻开，开始时将电流调至 10mA。待样品进入别离较时， 将电流调至 2030 mA。 当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。 6染色及脱色 将染色液倒入培养皿中，染色 1h 左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。 7计算 1. 相对迁移率 mR =样品迁移距离cm/染料迁移距离cm 2. 以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。 【实验结果】 1. 在凝胶层析法中将分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，做一条标准曲线。 2. 计算相对迁移率和样品的分子量。 【考前须知】 1 实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。 2不是所有的蛋白质都能用 SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质如某些糖蛋白以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白 F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的 SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是 21,000，但 SDS-凝胶电泳测定的结果却是 35,000。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。 3有许