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-.-.word.zl.1 移动基因：又叫转位因子transposable elements,由于它可以在染色体基因组上移动，甚至可在不同染色体间跃迁，故又称跳跃基因jumping gene。有三种类型，插入序列，转为子和噬菌体 Mu 和 D108。2 断裂基因split gene ：真核细胞的构造基因，其核苷酸序列中含有与氨基酸编码无关的 DNA 间隔区段，从而被分割成不连续的假设干区域。将这种编码序列不连续，有间隔区段的 DNA 片断称为断裂基因。非编码间隔区段称间隔子，有转录和编码功能序列称表达子。原核细胞无含子。3 重叠基因overlapping genes：不同基因的核苷酸序列有时为相邻两个基因共用，将核苷酸彼此重叠的两个基因称为重叠基因。4 假基因：在珠蛋白基因簇gene cluster各片断核苷酸序列分析时发现，除了有正常的功能基因之外，还有功能失活的特殊序列片断，它不能行使表达功能。该类无表达功能的畸变核苷酸基因序列片断，称为假基因。5 同尾酶：有一些限制性核酸切酶识别的碱基顺序不完全恒定，即识别顺序不同，但酶切后产生同样黏性末端的两种酶称为同尾酶，如 BamH和 Bgl。6 质粒：细菌存在于细胞质中的一种独立于染色体以外的遗传成分，是由环状的DNA 分子组成的复制子。质粒有我复制和调控系统，可以在胞浆自主复制，把携带的遗传信息通过自我复制的子代质粒，可随细菌分裂而进入子代菌体中。还有转移，选择性标记及不相容性等特性。7 柯斯COS质粒：粘性质粒Cosmid带有噬菌体的 Cos 位点和整个 pBR322的 DNA 顺序。经感染进入细菌细胞以后，它就好象质粒那样在细胞中进展复制。分子量小，易环化和扩增，可包装 30-45kb 外源基因，可由 Ampr 抗性筛选，常用于构建基因文库。-.-.word.zl.8Cos 位点Cohesive-end site：DNA 为线状双链分子，两端各有几个碱基的单链互补粘性末端，通过粘性末端的互补作用形成双链环形 DNA。这种由粘末端结合形成的双链区段即 Cos 位点。9 COS细胞：用一个复制起始部位缺失的SV40突变种感染猴细胞，由于病毒DNA不能自主复制，便整合到宿主染色体 DNA 中，早期基因表达产生功能性的 T 抗原，这样的细胞就叫 COS 细胞。10 基因组文库：别离真核生物中某种 DNA 成分,通常是别离供体细胞中的染色体 DNA，酶切后，将这些染色体 DNA 片段与某种载体相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真核细胞染色体 DNA 片断的克隆株,这种克隆株群体称基因组文库。11cDNA 文库：以 mRNA 为模板在反转录酶的作用下将形成的互补 DNAcDNA 与某种载体相接，而后转入大肠杆菌，建立克隆株，即 cDNA 文库gene library 12 转染：病毒含噬菌体DNA 及其重组子 DNA 导入宿主细胞或细菌的过程。由于噬菌体是细菌的病毒，因此噬菌体 DNA 导入大肠杆菌的感受态细胞也称转染。13 转导：以噬菌体为媒介，将外源 DNA 导入细菌的过程称转导。14 转化：以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞。转化作用就是一种基因型细胞从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的 DNA，进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生变化的现象。常见：原生质粒转化法，化学转化法和电穿孔法。15 启动子：是位于构造基因上游，转录起始调控所必需的一段 DNA 序列，是-.-.word.zl.RNA 聚合酶与模板 DNA 结合的部位。含-35 区与因子结合和-10 区和核心酶结合的保守序列。当启动子与全酶结合后可在+1 转录起始点开场转录。16 终止子：位于一个基因编码区 3下游提供终止信号的 DNA 序列，可以被RNA 聚合酶识别并发出停顿 mRNA 合成的信号。一般为一段发卡构造的反向重复序列。17 起始密码子：编码多肽链的第一位氨基酸的密码子 AUG或 ATG，编码甲硫氨酸蛋氨酸。在细菌中也有罕见的起始密码子 GUG，编码缬氨酸。其起始表达作用 AUGGUG。18 终止密码子：有三个密码子UAA,UAG，UGA，是使蛋白质合成终止的码子，通过一个或两个组合在一起发挥作用。只表示链的终止，不表达氨基酸。19 锌指构造：由两个半胱氨酸残基和两个组氨酸残基通过位于中心的锌离子结合成一个稳定的指状构造，并以锌辅基螯合成的环状构造作为活性单位，在指状突出区外表暴露的碱基及其极性氨基酸与DNA 结合有关。20 粘性末端：是指 DNA 分子在限制酶切割后产生一条链多出几个碱基的互补对称的突出末端，假设 5突出称 5粘性末端，他们能够通过碱基间的配对而重新环化起来，假设平末端的 DNA 片段那么不易重新环化。21 PCR：聚合酶链反响，是依据细胞 DNA 半保存复制的机理，以及体外 DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，在试管中给 DNA 的体外合成提供一种适宜条件：模板 DNA，寡链核苷酸引物，DNA 聚合酶，适宜的缓冲液系统和 DNA 变性、复性及延伸的温度与时间等，使参加的 4 种 dNTP 由引物沿模板从 53按碱基配对原那么,形成与模板 DNA 互补的半保存复制链。22 Genomic DNA：基因组 DNA，组成生物基因组的所有 DNA，包含一个生物-.-.word.zl.体的全部遗传信息，即 DNA 的全部核苷酸序列。对于二倍体高等生物，其配子的 DNA 总和即为一组基因组。不同区域具有不同的功能，有些编码蛋白质，有些调控基因的复制，转录和蛋白质表达等。23 Intron：即间隔子含子，与原核的蛋白质编码基因相比，真核蛋白质编码基因最主要的特点是其转录区的编码序列是连续的不连续的，其中非编码序列叫间隔子。它可随 DNA 的转录，参与形成前体 mRNA，而后在转录后的加工过程中被剪切，最终不存在于成熟 mRNA 中。因其对翻译产物的构造无意义，因而累计有更多的突变。24 Exon：即表达子编码序列，与原核的蛋白质编码基因相比，真核蛋白质编码基因最主要的特点是其转录区的编码序列是连续的不连续的，其中编码氨基酸的序列叫表达子。它是转录物经加工后被保存的相应的成熟 RNA 分子，并可在蛋白质合成过程中表达为蛋白质。所有外显子一同组成了遗传信息。25 转录transcription：生物体以 DNA 为模板在 mRNA 聚合酶的作用下，合成RNA 的过程称为转录。包括转录起始、延伸、终止等过程。转录是不对称的，表达为在 DNA 双链上一股链可以转录而另一股不可以。二是模板链并不都是在同一单链上。26翻译(translation):在多种因子辅助下，细胞以mRNA模板，在核糖体上通过tRNA识别该 mRNA 的三联体密码子和转移相应氨基酸，组装合成蛋白质肽链的过程。在多数情况下，新生多肽还需要经过转译后加工和修饰才能成为有活性的蛋白质。27 顺式作用元件：顺式作用元件为一些能与 DBP 结合的特定序列 DNA 片段,主要位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,决定转录起始位点和 RNA 聚-.-.word.zl.合酶的转录效应。按功能可分为启动子、增强子、沉默子、衰减子、终止子等DNA 序列片段。28 反式作用因子：反式作用因子是一组能直接或间接地与 DNA 的顺式作用元件特定序列结合，发挥调节作用的核非组蛋白，激活或阻遏基因表达。是 DNA结合蛋白DBP，DBP 又称转录因子transcription factor,TF分通用转录因子及转录调节因子两大类。基因表达的组织特异性及细胞周期特异性受上述元件和因子的相互作用所决定。29 转录因子：能够结合在某基因上游特异核苷酸序列上的蛋白质，活化后从胞质转位至胞核，通过识别和结合基因启动子区的顺式作用元件,启动和调控基因表达。30 瞬时表达：外源基因进入宿主细胞后，不整合到受体细胞染色体而独立于其外，随复制而出现基因产物，但复制量不宜太多，否那么会引起细胞死亡，也不能随细胞传代，因而其表达的量越来越少最后消失。这种现象称为瞬时表达。31 稳定表达：具有选择性标记，有完整的哺乳动物细胞转录系统，但无真核复制子的表达载体，在转染哺乳动物细胞后，外源基因进入真核细胞后，可将基因整合到细胞染色体上，可随细胞转录表达和传代。通过对转染 DNA 的阳性细胞克隆筛选，那么可获得外源基因整合到细胞染色体中稳定表达的细胞。32tk 基因：可以合成胸腺嘧啶核苷激酶thymidine Kinase,TK，在所有真核细胞中都有表达,是嘧啶生物合成补救代途径中的一个关键酶,它可催化胸苷磷酸化转变成为 dTMP,继续磷酸化生成 dTTP,参与 DNA 的生物合成。通过 HAT 培养基筛选 TK+细胞。同时也对 GCV 敏感，是一种常见的自杀基因。33 亮氨酸拉链：存在于蛋白 C 末端，为两组走向平行，带亮氨酸的螺旋形成-.-.word.zl.的对称二聚体，约为 30 个氨基酸，每两个亮氨酸之间隔有六个氨基酸，于是每两圈螺旋就有一个亮氨酸，排成一排，从而在 2 个-螺旋的蛋白分子之间形成一条拉链。形成二聚体后可使肽链上富含的碱性氨基酸区与亮氨酸拉链形成的整体构造与 DNA 亲和力较强而发生结合。34基因突变：指基因组DNA分子在构造上发生碱基对组成或排列顺序的改变 通常只涉及局部序列的变化，并引起个体表型的改变,而使生物体发生遗传变异。35 同义突变：是指碱基被替代后,没有改变产物氨基酸序列,这是与密码子的简并性相关,如 CTT、CTC、CTA、CTG 的第 3 位碱基互相替代后其编码表达的产物均为亮氨酸,因此这种突变不产生突变效应。36 错义突变：是指碱基序列的改变引起了产物氨基酸的序列改变。有些错义突变严重影响到蛋白质活性甚至完全失去活性，从而影响了表型。如果该基因是必需基因，那么该突变为致死突变。37.无义突变：某个碱基的改变可使某种氨基酸的密码子突变为终止密码子。如赖氨酸的密码子AAG突变为终止密码子TAG,假设肽链合成过早终止,那么蛋白质产物一般没有活性。假设是发生在基因 DNA 的 3末端处,它所表达产生的多肽常有一定活性或有局部活性,这种突变又称为渗漏变型leaky mutation。38 限制性核酸切酶：是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA 双链构造的核酸切酶。主要从原核生物中别离纯化出来。39 基因拼接：将有共同限制性切酶切点的基因连接起来形成多种基因杂合体，如将 IFN-1 与 IFN-2 亚型间进展拼接，可形成 IFN-1/2 或 IFN-2/1 等，称 IFNs 杂合体。此外，也可根据需要将具有协同效应的不同基因进展接拼。40 基因缺失：将原基因中的非功能区域的编码子人为地使之缺失的过程称为基-.-.word.zl.因缺失，所表达的产物相对分子质量虽然小了，但有时可提高表达效率，如 IL-6缺失 N 端 1725 个核苷酸可使 IL-6 的表达效率提高。有时还可降低一些毒性作用。如 TNF 基因缺失某一区域可使毒性下降。41 重组病毒载体：将外源性的 DNA 直接插入缺陷型的病毒基因组上，插入的外源片段的大小同被取代的病毒基因组区段是等同的。这样形成的重组体 DNA 能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，并包被成病毒颗粒。但为了补充被取代病毒基因组 DNA 功能，必须用一种与之互补的辅助病毒。42 重组质粒型载体：即重组病毒-质粒载体，这类载体只取病毒基因组中维持在哺乳动物中进展复制的有关序列以及抗性标记基因，使它与一个细菌质粒融合，这样的重组体也能够在大肠杆菌中进展复制和增殖，不过这种重组体不能够被包装成病毒颗粒，不能出现裂解感染的情况。43 基因工程多肽疫苗：使微生物对人体具保护作用的抗原基因经体外重组表达后所制备的生物活性多肽类疫苗称基因工程多肽或亚单位疫苗。其表达系统可以是酵母，也可以是哺乳动物细胞，假设无需糖基化的多肽疫苗甚至可在大肠杆菌等原核细胞中表达。44 基因置换(gene replacement)：是指将致病基因整个地被有功能的正常基因所置换，使致病基因永久地得到更正。但操作难度大，有伦理学问题。45 基因修正(gene correction)是指将致病基因的突变碱基序列予以纠正，而正常序列局部予以保存，使突变的致病基因恢复正常功能。即使致病基因的突变序列纠正为正常序列用碱基点突变技术。46 基因修饰(gene augmentation)那么是指将目的基因导入缺陷细胞或其它细胞，目的基因的表达产物可修饰和改变缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。-.-.word.zl.47 基因失活(gene inactivation)就是应用反义技术(antisense technology)特异封闭某些基因的表达，以到达抑制或阻止某些有害基因的表达。SiRNA 的基因干扰可造成靶基因异常基因的失活或沉默。48 转基因动物：就是把外源性目的基因导入动物的受精卵或其囊胚细胞中，并在细胞基因组中稳定整合，再将合格的重组受精卵或囊胚细胞筛选出来，采用借腹怀孕法寄养在雌性动物的子宫,使之发育成具表达目的基因的胚胎动物,并能传给下一代。这样，生育的动物为转基因动物。这类动物由于外源性目的基因的稳定存在而赋于子代动物个体。49 动物克隆：是一种通过核移植过程进展无性繁殖的技术。取发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，使之与去掉细胞核的卵母细胞融合，经短期培养后形成胚胎细胞并移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的动物，其遗传构造与细胞核供体完全一样。这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传构造与细胞核供体一样动物个体的技术，就叫做动物克隆。50 基因敲除：是向正常生物个体引入某个突变基因位点而选择性地使某特定基因功能失活的技术，可培养出靶向性剔除某基因的动物，而导致行为特性改变。但由于同源位点和重组率低等原因，障碍较大。51 ES 细胞：胚胎干细胞，不仅具有全能分化能力，而且可以在体外培养建立细胞株。同时还有无限增殖和自我更新等功能。假设把培养的细胞接种到恰当的动物胚胎中培育分娩后，便可发育出嵌合体动物。52 基因组：表示某物种单倍体的总 DNA。对于二倍体高等生物其配子的 DNA总和即为一组基因组，不同生物基因组数目不同。-.-.word.zl.53 基因表达：生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编码的形式储存在遗传物质DNA 上。基因表达的过程就是遗传信息经过转录，翻译等及其复杂的生物化学反响，最终产生具有生物功能的蛋白质。即 DNARNA蛋白质。DNA 中含有的基因遗传信息决定了物种的遗传和变异，并通过表达蛋白质来呈现遗传性状。54 RT-PCR：即逆转录 PCR，先在逆转录酶的作用下以 mRNA 为模板合成 cDNA,再以 cDNA 为模板进展 PCR 反响。这样，低浓度的 mRNA 被扩增放大易于检测。是一种快速、简便且敏感性极高的检测 RNA 的方法，可用于分析基因的转录产物、克隆 cDNA 及合成 cDNA 探针、改造 cDNA 序列等。其关键步骤是 RNA 的逆转录，要求 RNA 模板必须是完整的且不含 DNA，蛋白质等杂质。55 载体vector：可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进展独立和稳定的自我复制的核酸分子。主要包括五类：质粒，噬菌体的衍生物，柯斯质粒，单链DNA 噬菌体 M13，动物病毒。56 基因：指编码有功能蛋白质多肽链或 RNA 分子所必须的全部核酸序列。一个基因不仅含有编码蛋白质肽链或 DNA 分子的核酸序列，还包括保证转录所必须的调控序列及位于编码区上游 5端的启动子非编码序列，含子和位于编码区下游 3端的终止子非编码序列。前者为构造基因后者为调控基因。57 密码子codon：由 3 个相邻的核苷酸组成的 mRNA 根本编码单位。有 64种密码子，其中有 61 种氨基酸密码子(包括起始密码子,AUG、ATG 也编码蛋氨酸和甲硫氨酸)及 3 个终止密码子UAA,UAG,UGA，由它们决定多肽链的氨基酸种类和排列顺序的特异性以及翻译的起始和终止,。1 什么叫做基因？何谓基因的新概念？基因的主要功能是什么?答：概念见名解 56.-.-.word.zl.所谓基因的新概念是随着近年分子生物实验技术的开展，从分子水平上研究基因的构造和功能，提出的移动基因，断裂基因，重叠基因，假基因等基因的新概念。功能：基因是编码蛋白质或者 RNA 分子根本遗传信息的根本遗传单位，最终可合成各种特异的多肽，具有不同的功能。从化学角度看，基因是具有特定功能和构造的连续脱氧核糖核苷酸序列，是构成染色体的重要组成局部，是构成 DNA的功能单位。2真核细胞基因组中的基因常有含子存在，能否在原核细胞中表达？能，为什么？不能，为什么？答：不能，真核细胞基因序列中的含子是插入在构造基因中间使其不能连续的间隔基因序列片段，可随 DNA 转录参与形成前体 mRNA，而后在转录后的加工修饰过程过两次转脂反响而剪切，在原核细胞中，由于其基因组序列不包括这类含子，也缺乏相应的含子的剪接功能和转录后加工系统。因此不能完成含子基因序列的剪切过程，是一种无效转录。同时，真核生物基因在原核细胞中表达还必须有相应的原核RNA聚合酶以及可识别的原核细胞的启动子,才能催化RNA的合成。3 试述 DNA 分子的构造及其意义。答：DNA 一级构造：即 DNA 分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序。其中 A,T,C,G碱基分布不均匀，但脱氧核糖和磷酸均一样。意义：1、蕴藏着极为丰富的转换为蛋白质的遗传信息；2、一些特定序列以其大量信息决定着 DNA 的空间构造及基因间相互作用和调控功能。DNA 二级构造：为 DNA 双螺旋构造，由两条反向平行互补的脱氧核糖核苷酸链组成，两条链之间靠碱基间的氢键结合，多为右手螺旋。意义：解释了 DNA 复-.-.word.zl.制时两条链可分别作为模板生成新的子代互补链，从而形成遗传信息稳定传递的半保存复制机制。DNA 三级构造，指双螺旋构造根底上的卷曲，包括线状双链中可能有的扭结和超螺旋、多重螺旋和分子单链形成的环及环状 DNA 中的扭结、超螺旋和连环等体拓扑学状态。意义：1、使 DNA 体积更小，2、DNA 的线性序列带遗传信息，而紧绷的超螺旋状态储存着必要的生物学过程的能量和信息。是一种重要的功能态。三链 DNA：双螺旋构造根底上形成的三链螺旋构造。意义：1、作为准确切割双螺旋 DNA 靶序列的分子剪刀；2、作为基因表达抑制物，选择阻断靶基因，抑制转录；3、阻止序列专一性蛋白质结合，影响 DNA 与蛋白质结合及 DNA 复制转录等。四链 DNA：如端粒酶是真核细胞 DNA 3末端特殊重复序列，对染色体起保护作用。4 试述 cDNA 文库的构建及其意义？答：过程：1、cDNA 克隆：选用目的基因含量丰富的组织细胞，提取总 RNA，根据 3末端 polyA 尾长度不一，用亲和层析法获取较纯的 mRNA2、第一股 cDNA合成：以别离纯化的 mRNA 为模板，以 Oligo(dT)为引物在反转录酶的作用下，沿模板的35方向合成。对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA，也可用随机引物法，以 68 个核苷酸为随机引物，从 mRNA 的不同结合点合成全长 cDNA 第一链RNA-DNA3、第二股 cDNA 的合成：自身引导法置换合成法外加引物合成法 4、cDNA 与载体连接和导入宿主细胞：cDNA 加头或衔接尾，使产生的黏性末端与载体相应的黏性末端互补，形成重组 DNA。-.-.word.zl.意义：1、以成熟 mRNA 为模板合成的 cDNA 无含子，大大减小其长度，便于操作。2、真核生物细胞表达 mRNA 的量比人类基因组少很多，因此减少了筛选目的基因的工作量。3、某一特定功能基因在 mRNA 中拷贝量大于基因组，利于获得较多模板。4、可从全长 cDNA 序列中直接找到编码区，推测氨基酸顺序，分析性质和功能。5、基因克隆后可在原核细胞中表达有生物活性的蛋白。5 基因组文库构建的过程及意义？答：过程：1、别离纯化基因组 DNA,提取哺乳动物细胞染色体 DNA；2、制备全部基因组的 DNA 片断：包括完全酶解，局部酶解和机械切割。3、构建基因组文库载体，常用载体：粘性质粒，噬菌体，酵母人工染色体系统。4、DNA 片段与载体的连接包装：直接与经 BamH消化酶切的噬菌体的黏性末端在 T4 连接酶的作用下进展重组结合形成重组 DNA，然后进展体外包装产生完整的具有强感染力的噬菌体颗粒，继而形成噬菌斑。5、导入细胞，一定条件下进入大肠杆菌培养增殖。基因组 DNA+粘性质粒重组 DNA转化细菌菌落 基因组 DNA+噬菌体重组 DNA包装成噬菌体感染细菌噬菌斑 意义：1、可便于研究基因组中 5末端控制基因转录的调控序列，含子的分布和作用以及重复序列的数量及分布的大小。2、开展“人类基因组方案研究。3、在哺乳动物细胞中，是表达目的蛋白的根本形式之一。6 什么是限制性核酸切酶？答：限制性核酸切酶是一类可以识别双链 DNA 的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链 DNA 的一类限制酶。主要从原核生物中国别离纯化而来。根据限制酶的构造,辅因子的作用方式，可将限制酶分为三种类型：I 型、II 型及 III 型。-.-.word.zl.型既能催化宿主 DNA 的甲基化，又催化非甲基化的 DNA 的水解；而型只催化非甲基化的 DNA 的水解；III 型同时具有修饰及认知切割的作用。7.链终止 DNA 测序法根本原理及过程？答：原理：在单链 DNA 合成链延伸过程中，假设以 dNTP 为原料，新掺入的脱氧核苷酸 5-P 与前一个核苷酸戊糖的 3-OH 以磷酸二酯键相连，可使链不断延伸。但假设在反响体系中参加 ddNTP，可替代具有一样碱基的 dNTP，但由于ddNTP 不具有 3-OH，下一个核苷酸不能与之连接，使得 DNA 链的合成终止。因此，可以特定的放射标记，通过放射自显影获知最后一位核苷酸的碱基类型，从而获知相应的 DNA 序列。过程：1、以待测序列的单链 DNA 为模板，参加适当的 DNA 引物和 4 种 dNTP，其中一种是带放射标记的，分别参加相应的反响体系A/T/C/G中。同时，每个反响体系参加一定比例的ddNTP 和 DNA 聚合酶。2、PCR 合成。由于同一反响体系中有 dNTP 和 ddNTP，因此会竞争一样的碱基部位，假设以前者结合，那么合成继续，后者那么使合成停顿。因此，最终会得到很多长度不同的合成链。3、将合成完毕后的产物分四条相邻泳道进展凝胶电泳，每个体系为一条泳道。那么产生四条分子量从小到大，从正极到负极的梯度条带。4、将凝胶电泳产物通过放射自显影，在 X 光胶片上显现四条并列的“梯子条带。5、对四条“梯子条带并列分析。从最下的正极向上依次将最短的 DNA 链到最长链的末端碱基读出。即从 53直接读出这条链的碱基顺序，但要注意的是，这条链是待测模板链的互补链，还需要进展互补转换，最终得到待测链序列。8 试绘图并说明大引物 PCR 定点诱变法的过程。-.-.word.zl.答：如图 P183 页。原理：以第一轮 PCR 产物作为第二轮PCR 扩增的引物。第一轮以引物 2 和引物 3 扩增出短片段 DNA，引物 2 含有预先设计的突变序列。待 PCR 产物经纯化后除去原来的引物，然后以上一轮 PCR 扩增产物作为大引物，并与引物 1 一起再对靶基因作第二轮 PCR 扩增，其产物即为突变的 DNA。9.何谓基因工程的四大里程碑和三大技术创造？答：四大里程碑：1、1944 年 Oswald Avery 报道肺炎球菌转化实验，不仅证明了生物的遗传物质是 DNA，而且还证明了 DNA 可以转移，并把一个细胞的性状传递给另一个细胞；2、1953 年 James waston 和 Francis Crick 说明了 DNA 双螺旋构造，建立了 DNA 半保存复制及蛋白质合成的中心法那么，提出了遗传信息是DNARNA蛋白质，也说明了转录翻译过程中出现误差造成生物变异；3、遗传密码子的破译：1961年Monod和Jacob提出操纵子学说，1968年Crick和Nireberg完全破译 64 个遗传密码子，确定遗传信息是以密码子方式传递的；4、基因转移载体的发现：20 世纪 60 年代，发现了细菌的质粒，它是指生物体染色体以外的环状 DNA，具有独立自我复制的能力，可在微生物细胞间转移。三大技术创造：1、工具酶的创造切酶、合成酶、连接酶；2、基因合成和测序合成仪、测序仪；3、PCR 技术PCR 扩增仪。10 基因重组常用哪几种载体？其共同特点如何？答：常用载体有 5 类：质粒，噬菌体的衍生物，柯斯质粒，单链 DNA 噬菌体-.-.word.zl.M13，动物病毒。共同特征：在寄主细胞中能自我复制容易从寄主细胞中别离纯化载体DNA 分子中有不影响扩增的非必需区有单一酶切位点多克隆位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点。多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶切位点能赋予细胞特殊的遗传标记表达载体还应有表达调控元件启动子、增强子、终止子,SD 序列。11 作为理想的质粒载体有哪些根本条件？答：作为理想的质粒载体，应具备以下几个条件1能自主复制，即本身是复制子2具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；3在基因组中有 1-2 个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征，4分子量要小，多拷贝，易于操作。12 什么叫插入失活，举例说明之？答：外源基因片段克隆到插入型载体上后，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应，也为克隆基因的选择提供了表型。常用的有免疫功能失活和大肠杆菌-半乳糖甘酶失活。例一：免疫功能失活。Imm434 是噬菌体 434 的免疫区段，通过噬菌体杂交的方法导入噬菌体基因组，构成插入型的派生载体。在 C基因部有 EcoR和 Hind的单一切割位点，假设在这两个位点中任意一个插入外源 DNA 片段，都会导致 C基因的失活，阻遏蛋白合成受阻，进入溶菌周期，结果产生出清晰的噬菌斑，而亲本噬菌体 C未失活，可以变成溶原的状态，形成浑浊的噬菌斑。例二：-半乳糖甘酶基因组中含有一个大肠杆菌的 LacZ 区段，在诱导物 IPTG存在下，可指导合成-半乳糖甘酶与 X-gal 结合形成蓝色化合物。因此由这样的-.-.word.zl.载体感染的大肠杆菌 Lac-指示菌，涂布在含有 IPTG 和 X-gal 的培养基上，会形成蓝色噬菌斑。但假设在 LacZ 区段插图外源 DNA 片段，就会阻断其编码序列使其失活，从而不能形成相应的蓝色噬菌斑。13 如何从所克隆到的基因重组体载体中鉴定基因的存在和正确性？答：1、利用遗传标志的表型特征筛选：1由载体提供的性状进展筛选：a、抗生素抗性标记筛选：当带有完整抗性基因的载体转化抗性细胞后，所有转入载体的细菌都获得了抗性，被转化的阳性克隆菌，能在含相应抗生素的平板上生长形成菌落，而未转化的原宿主菌那么不能生长。b、抗性基因的插入失活筛选：在含有两个抗性基因的载体中，如果目的基因 DNA 片段插入其中一个抗性基因，就会导致抗性基因功能失活，用两个含不同抗生素的平板进展对照筛选。c、-半乳糖甘酶 LacZ 基因失活：通过基因互补作用，使缺失 LacZ 基因的突变体和带有完整 LacI 而无-半乳糖甘酶活性的的突变体结合，形成有功能活性的-半乳糖甘酶。2根据插入基因的遗传性状进展筛选：如亮氨酸Leu为 Leu 营养缺陷菌所必须，如果外源基因中能够表达 Leu，那么可使细菌生长。2、根据重组子的构造特征筛选：1重组子大小鉴别筛选：菌落提取质粒单切酶电泳质粒。携带外源目的基因的重组子质粒分量大，条带滞后，反之在前。适用于插入片段大的重组体筛选。2酶切鉴定：菌落提取质粒双切酶电泳质粒。原载体无外源目的片段，电泳为一条带，装有外源基因的载体有原载体和目的基因片段两条带。3PCR 筛选法：利用能与插入基因片段两端互补的特异引物，以少量抽提的重组子 DNA 为模板扩增出特异片段的转化子为携有目的基因的重组子，还可进展直接测序。4原位杂交：在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置原位不变的转移到滤膜上，并在原位溶菌裂解，DNA-.-.word.zl.变性和用特异探针进展杂交。5斑点杂交：将重组体 DNA 或 RNA 提取出来，将样品点在硝酸纤维膜上进展杂交。纯化的重组体去除了杂质干扰。6 Southern blot：将同源片段定位在某个酶切片段中，可用于对克隆后片段的基因定位，也可测其含量。14、质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？答：一般用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶BAP 或 CAP，预先处理线性的载体DNA 分子，以移去其末端的 5-P 基团，于是在连接反响中，它自己的两个末端就再也不能被连接酶共价连接起来了。这样形成的杂种 DNA 分子的每一个连接位点中，载体 DNA 都只有一条链是外源 DNA 连接上的，而另外一条链由于失去了 5-P 基团，不能作此连接，故留下一个具有 3-OH 和 5-OH 的缺口，尽管如此，这样的 DNA 分子仍然可以导入细菌细胞，并在寄主细胞完成缺口的修复工作。另外，也可改用双酶切片段的定向克隆，用两个不同的限制性核酸切酶切割目的基因和载体，产生两个不同的粘性末端，防止该现象。15 如何利用抗体标记基因筛选阳性克隆？答：1、抗生素抗性标记筛选：大多数质粒载体均带有抗生素抗性基因，如抗氨苄西林基因等，当带有完整抗性基因的载体转化抗性细胞后，所有转入载体的细菌都获得了抗性，被转化的阳性克隆菌能在相应抗生素的琼脂平板上生长，如pBR220 的抗氨苄西林基因可使克隆菌在氨苄西林平板上生长并形成菌落，而未被转化的原宿主菌那么不能生长。2、抗性基因的插入失活：在含有两个抗性基因的载体中，如果目的基因 DNA片段插入其中一个抗性基因，就会导致该抗性基因的功能失活，用两个分别含不同抗生素药物的平板进展对照筛选，可筛选出阳性重组子克隆菌株。如 pBR322-.-.word.zl.质粒编码有 Tet 抗性基因和 Amp 抗性基因，假设通过外源 DNA 片段使 Tet 或Amp 抗性基因失活，那么重组体克隆能在只含有一种抗生素的平板上生长繁殖的重组体克隆即为阳性转化。16 真核表达调控的顺式作用元件和反式作用因子有哪些？其作用特点是什么？答：顺式作用元件有：启动子，增强子，沉默子，衰减子，终止子。作用特点：1、多数位于真核生物构造基因上游，只有终止子位于下游，而增强子可以在上游也可以在下游。2、能够与 DNA 结合蛋白质结合的特定序列的 DNA片段。3、决定转录起始位点和 RNA 聚合酶的转录效应。反式作用因子因子：通用转录因子和转录调节因子。作用特点：1、同一 DNA 序列可被不同蛋白质识别。2、不同蛋白质因子可与不同 DNA 序列发生联系，但直接连接为少数。3、蛋白质-蛋白质或 DNA-蛋白质的结合，均导致构象上得细微变化，构象变化常是实现调控功能的分子根底。4、在反式作用因子的自身生物合成过程中，有相当大的可变性和可塑性。17、目的基因表达系统有哪几种？其特点如何？答：主要有原核如大肠杆菌和真核(如哺乳动物细胞)两大表达系统。两个系统的特点：1、真核生物 DNA 大局部是非裸露的，由核膜包裹，DNA 转录后需由特殊的肽链引导出核膜后开场翻译。原核生物大局部 DNA 属于非结合状态，又无核膜相隔，边转录边翻译。2、真核生物 DNA 中存在含子，不翻译，可在转录后的加工修适中剪切掉。原核生物 DNA 序列中没有含子，也没有转录后相应的剪切过程。3、真核生物具有在需要时以可控方式重拍某些 DNA 片段和扩增特定基因的机制，原核生物中罕见。4、真核生物有 3 种不同的 RNA 聚合酶，分别参与不同类型的 RNA 分子转录作用。而原核生物往往只有一种 RNA-.-.word.zl.聚合酶。5、真核生物产生的 mRNA 分子寿命大多比原核生物长。6、真核生物初级转录产物可进展转录后的加工修饰。不仅可除去含子，还可以再 mRNA 分子的 5末端加帽，3末端加尾。7、真核生物不存在操纵子构造，转录产物mRNA 为单顺反子，其表达调控成散在瀑布样型。原核基因表达调控顺序为操纵子，转录产物为多顺反子，可直接与一定数量的核糖体结合形成为多聚核糖体。8、真核生物基因为多拷贝。而原核生物中除了 rRNA，tRNA 和启动子局部区域为重复序列，其余基因很少含重复序列。9、真核生物一条 mRNA 上同时只能合成一条肽链，原核生物每个核糖体可独立合成一条肽链，多聚核糖体可同时在一条链上合成多条肽链。10、真核生物翻译过程不需要 SD 序列的特异性结合，原核生物必须依赖这种序列。11、原核生物表达的外源基因蛋白产物不能被糖基化。18 基因工程疫苗研究开发常用的技术途径有哪些？19 基因治疗展望和应用如何？答：展望：基因治疗存在感染率低，表达水平低，长期表达效果难，整合随机性带来危害等自身问题，以及伦理道德，平安性，技术复杂，要求条件高，所用细胞寿命短等技术问题。但它是人类治疗疑难疾病的新方法，新技术，随着研究和-.-.word.zl.应用的不断开展，不断深入，技术不断完善成熟，基因治疗将会在人类常见病和多发病及疑难病的有效治疗中发挥巨大作用，许多原来视为“不治之症的疾病将应用这先进技术得到治愈，其应用前景极为广阔。应用：1、遗传性疾病的基因治疗 2、肿瘤的基因治疗1抑癌基因转移的基因治疗2反义寡核苷酸的原癌基因失活疗法3药物自杀基因在肿瘤基因治疗中的应用4癌抗原基因转移的肿瘤基因治疗5多重耐药性基因转移的肿瘤基因治疗 3、病毒的基因治疗1阻止病毒复制策略2使感染 HIV 细胞死亡的方法3降解策略 20 有哪几种反义核苷酸基因失活疗法？简述其原理。答：原理：反义 RNA 是一种与 mRNA 互补的 RNA 分子，它是双链 DNA 中无意义链转录的 RNA，因此肿瘤癌基因活化表达的 mRNA 的起始翻译部位就会被相应的反义 RNA 互补结合形成 RNA/RNA 双链体，进而就阻止了核糖体与启动子结合，或阻止核糖体 mRNA 上移，以抑制 mRNA 的翻译，起到了抑制癌基因过高表达癌蛋白的效果。反义核酸包括三类：1、将特异的反义基因重组到表达载体上，导入靶细胞中转录出反义 RNA，形成双链 RNA,阻碍基因的翻译。2、人工合成寡聚脱氧核糖核酸经过化学修饰导入细胞，与 mRNA 和 DNA 结合，形成 RNA/DNA 杂链或 DNA核苷酸三聚体，影响基因的翻译或转录。3、特异性的核酸，根据癌基因设计出特异的“锤头或“发夹构造，它能够催化切割，降解异常表达基因的 mRNA而影响基因的翻译。21 何谓“动物克隆技术？有何应用价值？答：动物克隆：是一种通过核移植过程进展无性繁殖的技术。取发育早期的动物-.-.word.zl.胚胎细胞，或成年动物的体细胞，使之与去掉细胞核的卵母细胞融合，经短期培养后形成胚胎细胞并移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的动物，其遗传构造与细胞核供体完全一样。这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传构造与细胞核供体一样动物个体的技术，就叫做动物克隆。应用价值：1、培育优良畜种和生产实验动物。2、生产转基因动物。3、生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法。4、复制濒危动物物种，保存传播动物物种资源。22 PCR 根本原理和过程？答：原理：是依据细胞 DNA 半保存复制的机理，以及体外 DNA 分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，在试管中给 DNA 的体外合成提供一种适宜条件：模板 DNA，寡链核苷酸引物，DNA 聚合酶，适宜的缓冲液系统和 DNA变性、复性及延伸的温度与时间等，使目的 DNA 得以迅速扩增。其技术原理如图：P135 PCR 过程：1、DNA 模板变性：与体不同，体外用 94C 左右的高温使其变性形成单链 DNA。2、模板与引物退火：PCR 需要两条寡链核苷酸作为合成时的引物，分别与待扩增DNA 的序列两端互补。在降低温度过程中，通过控制退火条件就能使其与扩增区域两端配对。3、引物延伸：在 4 种