罗非鱼中致病菌快速检测方法(T-MMAT 003—2020).pdf

ICS 67.120.30 B50 T/MMAT 茂 名 市 罗 非 鱼 协 会 团 体 标 准 Q/MMAT 0032020 罗非鱼中致病菌快速检测方法 2020-08-03 发布 2020-08-10 实施 茂名市罗非鱼协会 发 布 T/MMAT 0032020 I 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由茂名市罗非鱼协会提出并归口。本标准起草单位：茂名市罗非鱼协会、茂名市食品药品检验所。本标准主要起草人：林莉莉、康婷、王伯顺、张海明、李海丽、李土贵、伍杰森 本标准为首次发布。T/MMAT 0032020 1 罗非鱼中致病菌快速检测方法 1 范围 本标准规定了罗非鱼中沙门氏菌、副溶血性弧菌快速检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定等技术要求。本标准适用于在生产、销售环节中对罗非鱼产品进行致病菌快速检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SC/T 3016-2004 水产品抽样方法 GB 4789.1 食品安全国家标准食品微生物学检验总则 GB 4789.4 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验 GB 4789.7 食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验 3 设备和材料 3.1 冰箱：25。3.2 恒温培养箱：361。3.3 均质器。3.4 电子天平：感量 0.1g。3.5 无菌吸管：1mL（具 0.01mL 刻度）、10mL（具 0.1mL 刻度）或微量移液器及其吸头。3.6 无菌锥形瓶：容量为 250mL。3.7 无菌培养皿：直径为 90mm。3.8 PCR 管。3.9 BAX全自动病原菌检测系统（启动包）。4 培养基和试剂 4.1 缓冲蛋白胨水（BPW）:见附录 A 中 A.1。4.2 亚硒酸盐胱氨酸（SC）：见附录 A 中 A.2。4.3 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂:见附录 A 中 A.3。4.4 营养琼脂:见附录 A 中 A.4。4.5 3%氯化钠碱性蛋白胨水：见附录 A 中 A.5。4.6 硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂：见附录 A 中 A.6。4.7 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：见附录 A 中 A.7。4.8 BAX沙门氏菌的 PCR 检测试剂盒。T/MMAT 0032020 2 4.9 BAX弧菌(副溶血/霍乱/创伤)的 PCR 检测试剂盒。4.10 API 20E 生化鉴定试剂盒。4.11 副溶血性弧菌生化鉴定试剂盒。5 检验程序 5.1 沙门氏菌检验程序 见图1。取样 25g样品+225ml BPW 361 8h18h 1ml增菌液+10mL SC 361 18h24h 菌落模板DNA制备 BAX系统检测 阴性结果 阳性结果 XLD 划线分离 361 18h24h 挑取菌落，接种于营养琼脂 生化鉴定 报告 图1 沙门氏菌检验程序 5.2 副溶血性弧菌检验程序 见图2。T/MMAT 0032020 3 取样 25g样品+225ml 3%氯化钠蛋白胨水 361 8h18h 菌落模板DNA制备 BAX系统检测 阴性结果 阳性结果 TCBS 划线分离 361 18h24h 挑取菌落，接种于3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板 361 18h24h 生化鉴定 报告 图2 副溶血性弧菌检验程序 6 操作步骤 6.1 样品采集及运输 样品采集及运输按照 SC/T 3016-2004 的规定执行。采集罗非鱼的肌肉组织、肠或鳃用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。6.2 样品处理 冷冻样品应45以下不超过15min或在25不超过18h解冻。6.3 样品检测 6.3.1 沙门氏菌增菌及 DNA 的制备 无菌操作称取25g样品，置于盛有225mL BPW 的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍击2min，于361培养8h18h。轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL转种于10mL SC内，于361培养18h24h。沙门氏菌SC细菌模板DNA的制备按BAX 系统筛选沙门氏菌的PCR分析试剂盒说明书进行。6.3.2 副溶血性弧菌增菌及 DNA 的制备 无菌操作称取 25g 样品，置于盛有 225mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的无菌均质袋中,用拍击式均质器T/MMAT 0032020 4 拍击 2min，于 361培养 8h18h。副溶血性弧菌增菌肉汤细菌模板 DNA 的制备按 BAX 系统筛选副溶血性弧菌的 PCR 分析试剂盒说明书进行。6.3.3 BAX检测 按照 BAX用户指导书来准备试剂、进行检测的和读取结果。必须按照实验室工作指南来装配、操作设备并记录使用情况。7 结果说明 7.1 检测结果 BAX检测结果为阴性的样品可以出具阴性报告。检测结果为阳性的样品需要继续按照传统的方法进行培养分析及确认。7.2 结果确证 7.2.1 沙门氏菌确证方法 将检测为阳性的样品 SC 增菌液接种划线于 XLD 平板上,于 361培养 18h24h。观察平板上生长的菌落,典型的沙门氏菌在 XLD 上呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落，还有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。挑取 2 个或以上可疑菌落，划线接种营养琼脂平板，于 361培养 18h24h 后，进行生化试验（API 20E）确认。7.2.2 副溶血性弧菌确证方法 将检测为阳性的样品增菌液接种划线于 TCBS 平板上，于 361培养 18h24h。观察平板上生长的菌落,典型的副溶血性弧菌在 TCBS 上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感。挑取 2 个或以上可疑菌落（从培养箱取出 TCBS 平板后，应不超过 1h 挑取），划线接种 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，于 361培养 18h24h 后，进行生化鉴定确认。T/MMAT 0032020 5 附 录 A（资料性附录）培养基和试剂 A.1 缓冲蛋白胨水(BPW)A.1.1 成分 蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钠(含12个结晶水)9.0g，磷酸二氢钾1.5g，蒸馏水1000mL。A.1.2 制法 将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min，煮沸溶解，调节pH至7.20.2，121高压灭菌15min。A.2 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液 A.2.1 成分 蛋白胨5.0g，乳糖4.0g，磷酸氢二钠10.0g，亚硒酸氢钠4.0g，L-胱氨酸0.01g，蒸馏水1000mL。A.2.2 制法 除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,冷至55以下,以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/L L-胱氨酸溶液10mL(称取0.1g L-胱氨酸,加1mol/L氢氧化钠溶液15mL,使溶解,再加无菌蒸馏水至100mL即成,如为DL-胱氨酸,用量应加倍)。摇匀,调节pH至7.00.2。A.3 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂 A.3.1 成分 酵母膏3.0g，L-赖氨酸5.0g，木糖3.75g，乳糖7.5g，蔗糖7.5g，去氧胆酸钠2.5g，柠檬酸铁铵0.8g，硫代硫酸钠6.8g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，酚红0.08g，蒸馏水1000mL。A.3.2 制法 除酚红和琼脂外，将其他成分加入400mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.40.2。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至5055倾注平皿。注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处.本培养基宜于当天制备,第二天使用.A.4 营养琼脂 T/MMAT 0032020 6 A.4.1 成分 蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g20.0g，蒸馏水1000mL。A.4.2 制法 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL调节pH至7.30.2.加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化，121高压灭菌15min。A.5 3%氯化钠碱性蛋白胨水 A.5.1 成分 蛋白胨10.0g，氯化钠30.0g，蒸馏水1000.0mL。A.5.2 制作 将各成分溶于蒸馏水中，调节pH至8.50.2，121高压灭菌10min。A.6 硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂 A.6.1 成分 蛋白胨 10.0g，酵母浸膏 5.0g，柠檬酸钠（C6H5O7Na32H2O）10.0g，硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O）10.0g，氯化钠 10.0g，牛胆汁粉 5.0g，柠檬酸铁 1.0g，胆酸盐 3.0g，蔗糖 20.0g，溴麝香草酚蓝 0.04g，麝香草酚蓝 0.04g，琼脂 15.0g，蒸馏水 1000.0mL。A.6.2 制法 将各成分溶于蒸馏水中，调节 pH 至 8.60.2，加热煮沸至完全溶解。冷至 50左右倾注平板备用。A.7 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂 A.7.1 成分 胰蛋白胨 15.0g，大豆蛋白胨 5.0g，氯化钠 30.0g，琼脂 15.0g，蒸馏水 1000mL。A.7.2 制法 将各成分溶于蒸馏水中，调节pH至7.30.2，121高压灭菌15min。_