牛呼吸道合胞体病毒病竞争性酶联免疫吸附试验抗体检测技术规程(T-NAASS 059—2023).pdf

ICS65.020.30CCS A0311NAASS宁 夏 回 族 自 治 区 农 学 会 团 体 标 准T/NAASS 0592023牛呼吸道合胞体病毒病竞争性酶联免疫吸附试验抗体检测技术规程Technical specification for detection of competitive ELISA antibodies against bovinerespiratory syncytial virus2023-03-22 发布2023-04-25 实施宁夏回族自治区农学会发 布T/NAASS 0592023I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。专利免责申明：本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由宁夏回族自治区科科学技术厅提出。本文件由宁夏回族自治区农学会归口。本文件起草单位：宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心、宁夏回族自治区畜牧工作站、宁夏农林科学院动物科学研究所、同心县动物疾病预防控制中心、固原市农产品质量安全监管中心。本文件主要起草人：李知新、周海宁、梁小军、安泓霏、马金昕、张成莲、封元、左新文、常耀祖、吴建宁、贾会囡、张学军、郭亚男、吴顺祥、宗亮泽、蒋秋斐、李忠。T/NAASS 05920231牛呼吸道合胞体病毒病竞争性酶联免疫吸附试验抗体检测技术规程1范围本文件规定了牛呼吸道合胞体病毒病竞争性酶联免疫吸附试验抗体检测的术语和定义、竞争性酶联免疫吸附试验。本文件适用于牛呼吸道合胞体病毒病竞争性酶联免疫吸附试验抗体检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和实验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1牛呼吸道合胞体病毒 Bovine respiratory syncytial virus,BRSV牛呼吸道合胞体病毒是单股负链RNA病毒，属副粘病毒科、肺病毒属。感染奶牛和肉牛后可引起急性呼吸道疾病综合征。3.2竞争性酶联免疫吸附试验 Competitive enzyme linked immunosorbent assay,cELISA竞争性ELISA法是将已知的特异性抗原包被在固相载体上，加入待测样本和酶结合物，其中的相应抗体即可与载体上的抗原和酶结合物竞争结合，洗去未结合的材料和被竞争结合的酶结合物，加入酶的底物，由呈色反应来测定抗体。4竞争性酶联免疫吸附试验4.1试验准备实验环境、仪器与设备、洗液的制备、稀释液的制备、示踪剂工作液的配制按照试剂盒说明书规定执行。稀释用蒸馏水应符合GB/T 6682的要求。4.2检测样品无菌采集牛静脉血2 mL3 mL,自然凝固1 h2 h，1500rpm/min2000rpm/min离心5 min，收集血清于1.5 mL离心管中。4.3操作程序使用前将所有试剂（结合物除外）恢复至室温（20 25），轻轻摇动或旋转，使试剂混合均匀。4.3.1取板取出微孔板，并在操作记录表上标记样品的位置。如果使用微孔板的一部分，则只需取出足够检测样品的条数。未使用的微孔板条用锡箔纸包好，保持干燥与密封，2 8 保存。4.3.2加样T/NAASS 05920232按照试剂盒说明书规定浓度，稀释血清样品，每孔加入待检样品，按照板孔布局加阴性和阳性对照。4.3.3稀释酶结合物用稀释液将酶结合物稀释至所需要的量。4.3.4加酶结合物每孔加入酶结合物，摇匀。4.3.5感作将微孔板密封后，37 C孵育。4.3.6洗板弃去微孔板中液体，用300 L左右的洗涤液洗涤每个板孔6次。在每一次洗涤后，甩去每个板孔中的液体，在洗涤时以及在加入下一步试剂之前要防止反应板出现干燥现象，避免孔内产生气泡，在最后一次甩掉后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余的液体.4.3.7加底物每孔加入底物溶液。避光室温孵育。4.3.8加终止液每孔加入终止液终止反应。4.3.9测定吸光值（OD 值）酶标仪预热15 min，在加入终止液5 min内读取波长的吸光度值。4.4实验有效性检测只有当满足试剂盒说明书规定的条件时检测才有效。4.5结果计算使用试剂盒说明书指定的计算公式进行结果计算。4.6结果判定使用试剂盒说明书规定的判定标准进行结果判定。