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第二章 核酸的结构与功能 Structure and Function of nucleic acid 一、授课章节及主要内容：第二章 核酸的结构与功能 二、授课对象：临床医学、预防、法医（五年制）、临床医学（七年制）通过本章的学习让学生掌握两种核酸分子即 DNA 和 RNA 的化学组成、分子结构和功能及其理化性质的特点和应用。三、授课学时 本章共安排 3 学时（每个课时为 45 分钟）。讲授安排如下：1 学时：概述+第一节 核酸的化学组成及一级结构和第二节 DNA 的空间结构与功能中的第一部分：DNA 的二级结构双螺旋结构模型；2 学时：第二节 DNA 的空间结构与功能的第二部分：DNA 的超螺旋结构及其在染色质中的组装和第三节 RNA 的空间结构与功能的第一点：信使 RNA（mRNA）的结构与功能 3 学时：第三节 RNA 的空间结构与功能的第二点：转运 RNA（tRNA）的结构与功能 和第二点：转运 RNA（tRNA）的结构与功能和第二点：核蛋白体 RNA（rRNA）的结构与功能及第四节核酸的理化性质和第五节核酸酶 四、教学目的与要求 五、重点与难点 重点：掌握核酸的分类、分布及生物学意义。掌握 DNA 和 RNA 的化学组成。掌握 DNA的一级结构、空间结构及其功能，RNA 的一级结构以及三种 RNA 的功能。掌握 DNA 的变性、复性、分子杂交的概念。难点：核酸的结构（DNA 的一级结构、空间结构，几种重要的 RNA 的结构）六、教学方法及授课大致安排 以讲授为主，授课结束前作适当的小节，帮助学生消化当天所学的内容，另外课前穿插提问帮助学生复习，巩固已学的知识。七、主要外文专业词汇 八、思考题 1、试比较两类核酸的化学组成、分子结构、分布及生物学功能。2、简述 DNA 双螺旋结构的碱基组成的 Chargaff 规则。3、简述真核细胞的 mRNA 的结构特点和功用。4、简述 tRNA 的分子组成、结构特点和功能。5、什么是 TM 值？他有何生物学意义？6、什么是核酶？他在医学发展中有何意义？7、什么是 DNA 变性、复性、分子杂交和增色效应？有何实际意义？九、教材与教具：人民卫生出版社生物化学第六版 十、授课提纲(或基本内容)概 述 Introduction 核酸（nucleic acid）是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。核酸可以分为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）两大类。第一节 核酸的化学组成及一级结构 Chemical constitution and primary construction of nucleic acid 核酸的基本组成单位是核苷酸（nucleotide），而核苷酸则由碱基、戊糖和磷酸三种成分连接而成。DNA的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide或deoxynucleotide），RNA 的基本组成单位是核糖核苷酸（ribonucleotide）。一、核苷酸的结构 （一）碱基的种类：构成核苷酸的五种碱基（base）分别属于嘌呤（purine）和嘧啶（pyrimidine）两类含氮杂环化合物。DNA 分子中的碱基成分为 A、G、C 和 T 四种；而 RNA 分子则主要由 A、G、C 和 U 四种碱基组成。（二）戊糖与核苷：是核苷酸的另一重要成分。脱氧核糖核苷酸中的戊糖是 bD2脱氧核糖；核糖核苷酸中的戊糖为 bD核糖。这一结构上的差异使得 DNA 分子较 RNA 分子在化学上更为稳定，从而被自然选择作为生物遗传信息的储存载体。为区别于碱基中的碳原子编号，核糖或脱氧核糖中的碳原子标以 C1、C2等。碱基和核糖或脱氧核糖通过糖苷键（glycosidic bond）缩合形成核苷或脱氧核苷，连接位置是 C1。（三）核苷与磷酸通过酯键结合即构成核苷酸或脱氧核苷酸。生物体内多数核苷酸都是 5核苷酸，即磷酸基团位于核糖的第五位碳原子 C5上。根据磷酸基团的数目不同，有核苷一磷酸（nucleoside monophosphate，NMP）、核苷二磷酸（nucleoside diphosphate，NDP）、核苷三磷酸（nucleoside triphosphate，NTP）的命名方式；根据碱基成分的不同，有 AMP（adenosine monophosphate）、ADP（adenosine diphosphate）、ATP（adenosine triphosphate）等命名。（四）核苷酸除了构成核酸大分子以外，还参加各种物质代谢的调控和多种蛋白质功能的调节。例如 ATP 和 UTP 在能量代谢中均为重要的底物或中间产物；环腺苷酸（cyclic AMP，cAMP）和环鸟苷酸（cyclic GMP，cGMP）等则在细胞信号转导过程中具有重要调控作用。二、核酸的一级结构 (一)定义:核酸的一级结构是指 DNA 和 RNA 分子中核苷酸的排列顺序，也称核苷酸序列。由于核酸分子中不同核苷酸之间的差异仅在于碱基的不同，因此也称为碱基序列。(二)连接方式:磷酸二酯键。四种脱氧核苷酸按照一定的排列顺序以化学键：3,5磷酸二酯键（phosphodiester linkage）相连形成的多聚脱氧核苷酸（polydeoxynucleotides）链称为DNA。多聚核苷酸（polynucleotides）链则称为 RNA。这些脱氧核苷酸或核苷酸的连接具有严格的方向性，由前一位核苷酸的 3OH 与下一位核苷酸的 5位磷酸基之间形成 3,5磷酸二酯键，从而构成一个没有分支的线性大分子。它们的两个末端分别称为 5末端（游离磷酸基）和 3末端（游离羟基）。书写规则应从 5末端到 3末端。（见六版教材图 2-4）(三)DNA 和 RNA 一级结构的差异：RNA 是生物体内另一大类核酸。它与 DNA 的差别是：组成它的核苷酸的戊糖不是脱氧核糖而是核糖；RNA 中的嘧啶成分为胞嘧啶和尿嘧啶，而不含有胸腺嘧啶，所以构成 RNA 的基本四种核苷酸是 AMP、GMP、CMP 和 UMP，其中 U 代替了 DNA 中的 T。DNA 和 RNA 对遗传信息的携带和传递，是依靠碱基排列顺序变化而实现的。第二节 DNA 的空间结构与功能 Space structure and function of DNA 一、DNA 的二级结构双螺旋结构模型（一）双螺旋结构的研究背景 1碱基组成的 Chargaff 规则：A=T，C=G；不同种属的 DNA 碱基组成不同；同一个体不同器官、不同组织的 DNA 具有相同的碱基组成。2DNA 纤维的 X 线图谱分析显示 DNA 是螺旋型分子，且为双链分子。3Rosalind Franklin 获得了高质量的 DNA 的 X 线衍射照片，显示出 DNA 是螺旋形分子，而且从密度上提示 DNA 是双链分子。1953 年 Watson 和 Crick 总结前人的研究成果，提出了 DNA 的双螺旋结构模型。（二）DNA 双螺旋结构模型的要点 1 DNA 是一反向平行的互补双链结构:DNA 分子是由两条反向平行的脱氧多核苷酸链组成，一条链的走向是 53，另一条链的走向是 35。在 DNA 双链结构中，外侧是由亲水的脱氧核糖基和磷酸基构成的骨架，内侧是碱基，两条链的碱基之间以氢键结合即 A 与 T 配对；C 与 G 配对。两个配对的碱基结构几乎在一个平面上，并且此平面与线性分子的长轴相垂直（图 25）。2DNA 是右手螺旋结构 DNA 线性长分子通过初始的折叠形成一个右手螺旋式结构，螺旋直径为 2nm，螺旋一周包含了 10 对碱基，螺距为 3.4nm。外观上，DNA 双螺旋分子存在一个大沟和一个小沟，此沟状结构可能与蛋白质和 DNA 间的识别有关。3疏水力和氢键维系 DNA 双螺旋结构 的稳定 DNA 双螺旋结构的稳定性横向靠两条链间互补碱基的氢键维系，纵向则靠碱基平面间的疏水性堆积力维持，由以后者更为重要。（三）DNA 结构的多样性 不同的环境条件下，DNA 的结构不同，自然界存在的 DNA 有：B-DNA 右手螺旋（Watson-Crick 模型结构）Z-DNA 左手螺旋 A-DNA 右手螺旋 体内不同构象的 DNA 在功能上有所差异，可能参与基因表达的调节和控制。（见六版教材图 2-6）二、DNA 的超螺旋结构及其在染色质中的组装 DNA 是十分巨大的信息高分子，DNA 的长度要求其必须形成紧密折叠扭转的方式才能够存在于很小的细胞核内。（一）DNA 的超螺旋结构 DNA 双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构（superhelix 或 supercoil）。盘绕方向与 DNA双螺旋方同相同为正超螺旋（positive supercoil）；盘绕方向与 DNA 双螺旋方向相反则为负超螺旋（negative supercoil）。自然界的闭合双链 DNA 主要是以负超螺旋形式存在。（二）原核生物 DNA 的高级结构 绝大部分原核生物的 DNA 都是共价封闭的环状双螺旋分子。在细胞内进一步盘绕，并形成类核（nucleoid）结构，以保证其以较致密的形式存在于细胞内。在细菌基因组中，超螺旋可以相互独立存在，形成超螺旋区，各区域间的 DNA 可以有不同程度的超螺旋结构。（三）DNA 在真核生物细胞核内的组装 在真核生物，DNA 以非常致密的形式存在于细胞核内。在细胞周期的大部分时间里以分散存在的染色质（chromatin）形式出现，在细胞分裂期形成高度组织有序的染色体（chromosome）染色质的基本组成单位被称为核小体（nucleosome），由 DNA 和 5 种组蛋白（histone，H）共同构成。核小体中的组蛋白分别称为 H1，H2A，H2B，H3 和 H4。各两分子的 H2A，H2B，H3 和 H4 共同构成八聚体的核心组蛋白，DNA 双螺旋链缠绕在这一核心上形成核小体的核心颗粒（core particle）。核小体的核心颗粒之间再由 DNA（约 60 bp）和组蛋白 H1 构成的连接区连接起来形成串珠样的结构。核小体是 DNA 在核内形成致密结构的第一层次折叠，使得 DNA 的整体体积减少约 6 倍。第二层次的折叠是核小体卷曲（每周 6 个核小体）形成直径 30 nm、在染色质和间期染色体中都可以见到的纤维状结构和襻状结构，DNA 的致密程度增加约 40 倍。第三层次的折叠是30 nm 纤维再折叠形成柱状结构，致密程度增加约 1000 倍，在分裂期染色体中增加约 10 000倍，从而将约 1 米长的 DNA 分子压缩，容纳于直径只有数微米的细胞核中。人类的基因组 2.8109bp DNA 的结构特点是具有高度的复杂性和稳定性，可以满足遗传多样性和稳定性的需要。第三节 RNA 的空间结构与功能 Space structure and function of RNA RNA 在生命活动中同样具有重要作用。它和蛋白质共同负责基因的表达和表达过程的调控。RNA 分子远小于 DNA 分子，分子大小的差异变化大，小的仅有数十个核苷酸，大的由数千个核苷酸组成。RNA 分子通常以单链形式存在，局部有二级结构或三级结构。RNA 的种类具有多样性，同时 RNA 的功能也是多样性的。表 2-2 动物细胞内主要 RNA 的种类及功能 一、信使 RNA（messenger RNA，mRNA）的结构与功能 mRNA 的长短差异很大，半期最短，由几分钟到数小时不等,在细胞核内合成的 mRNA初级产物比成熟的 mRNA 分子大得多，此种初级产物称为不均一 RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA),经过剪接成为成熟的 mRNA 并移位至细胞质。结构特点：1 5端具有帽子结构：大多数真核生物的 mRNA 在转录后 5末端以 7-甲基鸟嘌呤-三磷酸鸟苷为起始结构，这种 m7GpppN 结构被称为帽结构（cap sequence）。5帽结构是由鸟苷酸转移酶加到转录后的 mRNA 分子上的，与 mRNA 中所有其他核苷酸呈相反方向。帽结构中的鸟苷酸及相邻的 A 或 G 都可以发生甲基化，由于甲基化位置的差别可产生数种不同的帽结构。mRNA 的帽结构可以与一类称为帽结合蛋白（cap binding proteins，CBPs）的分子结合。这种 mRNA 和 CBPs 复合物对于 mRNA 从细胞核向细胞质的转运、与核蛋白体的结合、与翻译起始因子的结合、以及 mRNA 稳定性的维系等均有重要作用。2 3末端有 poly A 尾巴：真核生物 mRNA3末端有数十至一百多个腺苷酸连接而成，称为多聚 A 尾poly(A)。poly（A）结构也是在 mRNA 转录完成以后额外加入的，催化这一反应的酶为 poly(A)转移酶。poly(A)在细胞内与 poly(A)结合蛋白（poly(A)-binding protein，PABP）相结合而存在。这种 3-末端多聚 A 尾结构和 5帽结构共同负责 mRNA从核内向胞质的转位、mRNA 的稳定性维系以及翻译起始的调控。去除多聚 A 尾和帽结构是细胞内 mRNA 降解的重要步骤。3.mRNA 的功能：是转录核内 DNA 遗传信息的碱基排列顺序，并携带至细胞质，指导蛋白质合成中的氨基酸排列顺序。mRNA 分子从 5末端的 AUG 开始，每 3 个核苷酸为一组，决定肽链上一个氨基酸，称为三联体密码（triplet code）或密码子（codon）。二、转运 RNA（transfer RNA，tRNA）的结构与功能 细胞内分子量最小的一类核酸，由 74 到 95 个核苷酸构成。1结构特点：（1）tRNA 分子中含有 10%20%的稀有碱基如：双氢尿嘧啶（DUH）、假尿嘧啶（，pseudouridine）、甲基化的嘌呤（mG，mA）（2）tRNA 能形成茎环结构：组成 tRNA 的几十个核苷酸中存在着一些能局部互补配对的区域，可以形成局部的双链。这些局部双链呈茎状，中间不能配对的部分则膨出形成环或襻状结构，称为茎环（stem-loop）结构或发夹结构。由于这些茎环结构的存在，使得 tRNA整个分子的形状类似于三叶草形（cloverleaf pattern）。此结构称为三叶草结构。（3）tRNA 分子末端有氨基酸接纳茎：所有 tRNA 的 3端的最后 3 个核苷酸序列均为CCA，是氨基酸的结合部位，称为氨基酸接纳茎（acceptor stem）。（4）tRNA 序列中有反密码子：每个 tRNA 分子中都有 3 个碱基与 mRNA 上编码相应氨基酸的密码子具有碱基反向互补关系，可以配对结合，这 3 个碱基被称为反密码子（anticodon），位于反密码环内。tRNA 的三级结构：X 射线衍射结构分析表明，tRNA 的共同三级结构是倒 L 型。2.tRNA 的功能：在蛋白质合成过程中作为氨基酸的载体并将其转呈给 mRNA 三、核蛋白体 RNA（ribosomal RNA，rRNA）的结构与功能 核蛋白体 RNA（ribosomal RNA，rRNA）是细胞内含量最多的 RNA，约占 RNA 总量的 80%以上。rRNA 与核蛋白体蛋白（ribosomal protein）共同构成核蛋白体或称为核糖体（ribosome）。原核生物和真核生物的核蛋白体均由易于解聚的大、小两个亚基组成。原核生物的 rRNA 共有 5S，16S，23S 三种；而真核生物的 rRNA 有 18S，5S，5.8S，28S 四种，它们分别与蛋白质一起组成核蛋白体的大亚基和小亚基，然后由大小亚基共同构成核蛋白体完成其功能。真核生物的 18S rRNA 的二级结构成花状 rRNA的功能:rRNA与核蛋白体蛋白共同构成核蛋白体,为蛋白质的合成提供场所。四、其他小分子 RNA 及 RNA 组学 除了上述三种 RNA 外，细胞的不同部位还存在着许多其他种类的小分子 RNA，这些小RNA 被统称为非 mRNA 小 RNA（small non-messenger RNA，snmRNAs）。有关 snmRNAs的研究近年来受到广泛重视，并由此产生了 RNA 组学（RNomics）的概念。SnmRNAs 主要包括核内小 RNA（small nuclear RNA，snRNA）、核仁小 RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）、胞质小 RNA（small cytoplasmic RNA，scRNA）、催化性小 RNA（small catalytic RNA）、小片段干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）等。这些小 RNA在 hnRNA 和 rRNA 的转录后加工、转运以及基因表达过程的调控等方面具有非常重要的生理作用 核酶：某些小 RNA 分子具有催化特定 RNA 降解的活性，在 RNA 合成后的剪接修饰中具有重要作用。这种具有催化作用的小 RNA 亦被称为核酶（ribozyme）或催化性 RNA（catalytic RNA）。小片段干扰 RNA：近年 siRNA 的研究受到了特别关注。siRNA 是生物宿主对于外源侵入的基因所表达的双链 RNA 进行切割所产生的、具有特定长度（21 个核苷酸）和序列的小片段 RNA。它可以与外源基因表达的 mRNA 相结合，并诱发这些 mRNA 的降解。第四节 核酸的理化性质 Phisicochemical property of nucleic acid 一、核酸的一般理化性质：1核酸是多元酸，有较强的酸性 2DNA 是线性高分子，机械作用下易发生断裂，而 RNA 分子远小于 DNA 3DNA 粘度较大，而 RNA 的粘度要小得多 4DNA 和 RNA 溶液均具有 260nm 紫外吸收峰，因此可进行定量分析。二、DNA 的变性：1变性：在某些理化因素作用下，DNA 分子互补碱基对之间的氢键断裂，使 DNA 双螺旋结构松散，变成单链，即为 DNA 变性。DNA 变性只改变其二级结构，不改变它的核苷酸排列。变性的方法：强酸、强碱、加热以及变性试剂（如尿素、乙醇、丙酮等）变性的本质：双链间氢键的断裂，即空间结构的破坏，不涉及一级结构的变化。理化因素的变化：A260 的值增加、粘度下降、比旋度下降、浮力密度升高、酸碱滴定曲线改变、生物活性丧失 2增色效应（hyperchromic effect）：在 DNA 解链过程中，由于更多的共轭双键得以暴露，DNA 在紫外区 260 nm 处的吸光值增加，并与解链程度有一定的比例关系，这种关系称为 DNA 的增色效应（hyperchromic effect）。(可通过测 A260 的变化来监测 DNA 是否发生变性)3解链曲线：在连续加热 DNA 的过程中以温度对 A260 的关系作图，所得的曲线称为解链曲线。从曲线中可以看出，DNA 的变性从开始解链到完全解链，是在一个相当窄的温度内完成的。在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的 50%时的温度称为 DNA 的解链温度（melting temperature，Tm）又称融解温度。4Tm 值：核酸分子内的 50%双链结构被解开时的温度 Tm 值的大小与碱基中的 G+C 比例有关，G+C 比例越高，Tm 值越大。计算公式为：Tm=4（G+C）+2(A+T)三、DNA 的复性与分子杂交 1复性：变性的 DNA 分子在适当条件下,两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象,称为复性。DNA 的复性速度受温度的影响，只有温度缓慢下降才可使其重新配对复性。一般认为，比 Tm 低 25的温度是 DNA 复性的最佳条件。2 退火(annealing)：热变性的 DNA 经缓慢冷却后即可复性,此过程称为退火。注意：DNA 受热变性后,温度缓慢冷却才能复性,如迅速冷却至 4以下，则几乎不能复性。一般认为，比 Tm 值低 25的温度是 DNA 复性的最佳条件。3 分子杂交（hybridization）：在 DNA 复性过程中，不同来源的 DNA 单链分子或者DNA 和 RNA 分子之间，序列完全互补或者不完全互补的两个单链核酸分子之间能形成双链，这种现象称为分子杂交。（见 六版教材图 2-15）第五节 核酸酶 nucleases 一、核酸酶（nucleases）是指所有可以水解核酸的酶。常用于 DNA 重组技术中。二、分类：1 按作用的底物分：DNA 酶（DNase）和 RNA 酶（RNase）2 按作用的部位分：核酸外切酶：作用于多核苷酸链的 5末端或 3末端（5末端外切酶和 3末端外切酶）核酸内切酶：作用于多核苷酸链的内部，如有严格的序列依赖性则称为限制性核酸内切酶。核酶的底物是核酸，因此从功能上来讲也属于核酸内切酶，且为序列特异性的核酸内切酶。人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段也具有序列特异性降解 RNA 的作用，称为催化性 DNA（DNAzyme）。催化性 DNA 与催化性 RNA 相比，具有更好的化学稳定性和生物学稳定性，在疾病治疗方面的将有更好的前景。尚未发现天然的催化性 DNA 的存在。小结 Summary 核酸是以核苷酸为组成单位的线性多聚生物信息分子，分为 DNA 和 RNA 两大类。DNA由脱氧核糖核苷酸连接而形成，RNA 的基本组成单位则是核糖核苷酸。DNA 分子中的脱氧核糖核苷酸的碱基成分为 A、G、C 和 T 四种；而 RNA 分子中核糖核苷酸的则由 A、G、C和 U 四种碱基组成。碱基与戊糖结合形成核苷。脱氧核苷中的戊糖是 bD2脱氧核糖；核苷中的戊糖为 bD核糖。核苷与磷酸通过酯键连接形成核苷酸。DNA 的一级结构是指 DNA 分子中的核苷酸的碱基排列顺序，DNA 对遗传信息的贮存正是利用碱基排列方式变化而实现的。DNA 是双链结构，两条链呈反向平行走向。DNA 双链中的腺嘌呤始终与胸腺嘧啶配对存在，形成两个氢键；鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对存在，形成三个氢键。DNA 双链是右手螺旋结构。DNA 在形成双链螺旋式结构的基础上在细胞内还将进一步折叠成为超螺旋结构，并且在蛋白质的参与下构成核小体。DNA 的基本功能是作为生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板。RNA 是生物体内的另一大类核酸。mRNA 以 DNA 为模板合成后转位至胞质，在胞质中作为蛋白质合成的模板。成熟的 mRNA 的结构特点是含有特殊 5末端帽和 3末端的多聚A 尾结构。mRNA 分子上每 3 个核苷酸为一组，决定肽链上一个氨基酸，称为三联体密码或密码子。tRNA 的结构特点包括存在反密码子、茎环结构和含有稀有碱基等。tRNA 的功能是在细胞蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的运载体并将其转呈给 mRNA。rRNA 与核蛋白体蛋白共同构成核蛋白体，核蛋白体是细胞合成蛋白质的场所。核蛋白体中的 rRNA 和蛋白质共同为 mRNA、tRNA 和肽链合成所需要的多种蛋白因子提供结合位点和相互作用所需要的空间环境。RNA 组学研究细胞中 snmRNAs 的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一种细胞在不同时间、不同状态下 SnmRNAs 的表达具有时间和空间特异性。核酸具有多种重要理化性质。核酸的紫外吸收特性被广泛用来对核酸、核苷酸、核苷和碱基进行定性定量分析。核酸的沉降特性用于超速离心法纯化核酸。DNA 的变性和复性是核酸最重要的理化性质之一。DNA 变性的本质是双链的解链。DNA 的变性从开始解链到完全解链，紫外光吸收值达到最大值的 50%时的温度称为 DNA 的解链温度（Tm）。在 Tm 时，核酸分子内 50%的双链结构被解开。热变性的 DNA 在适当条件下，两条互补链可重新配对而复性。在 DNA 变性后的复性过程中，只要不同的单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，就可以在不同的分子间杂交形成杂化双链。DNA 与 DNA 及 RNA 与 DNA 间的分子杂交在核酸研究中的应用十分广泛。核酸酶是可以降解核酸的酶。依据核酸酶底物的不同可以将其分为DNA酶和RNA酶两类；依据切割的部位分为核酸内切酶和核酸外切酶；具有序列特异性的核酸酶称为限制性核酸内切酶。