水质粪大肠菌群(一般水样)测定作业指导书.docx

文件编号：WJES/QZ-0057-2023常州市武进区环境监测站作业指导书名称：水质 粪大肠菌群一般水样测定作业指导书第 1 页共 5 页水质 粪大肠菌群一般水样测定作业指导书1 含义及执行标准1.1 含义粪大肠菌群根本性状与总大肠菌群相像，属于总大肠菌群的一局部。在培育温度为 37 时可检出总大肠菌群的存在，为区分存在于自然环境和温血动物肠道内的粪源性大肠菌群细菌，将培育温度提高倒 44.5，仍能使乳糖发酵产酸产气的总大肠菌群为粪大肠菌群。一般水样特指除医院污水外的各种水样。本试验通过定性区分试验产酸产气，检索MPN 表，导出定量的粪大肠菌群结果。1.2 方法原理多管发酵技术是以最可能数most probable number，简称MPN来表示试验结果的。它是依据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培育阳性结果估量水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN 表获得结果的。1.3 水环境质量标准表 1-1粪大肠菌群地表水环境质量标准 GB 3838-2023类 别类类类类类标准值个/L2002023100002023040000表 1-2粪大肠菌群农田浇灌水质标准 GB 5084-2023类 别水作、旱作蔬菜标准值个/L4000020230a，10000ba 加工、烹调及去皮蔬菜b 生食类蔬菜、瓜类及草本水果表 1-3粪大肠菌群畜禽养殖污染物排放标准 GB 18596-2023类 别污水排放标准值个/L100002 分析方法2.1 方法名称、方法来源及适用范围方法名称：多管发酵法方法来源：水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法试行(HJ/T 347 200)7方法适用范围：此法适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。2.2 仪器高压蒸汽灭菌器1文件编号：WJES/QZ-0057-2023常州市武进区环境监测站作业指导书名称：水质 粪大肠菌群一般水样测定作业指导书第 2 页共 5 页电热枯燥箱恒温培育箱冰箱采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿直径 9cm、刻度吸管等器皿 12120min高压蒸汽灭菌后于电热枯燥箱中烘干。2.3 标准菌株制备将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培育液中培育比照把握。必需包 括大肠埃希氏菌、产气场杆菌和山夫登堡沙门氏菌三种比照。接种完后需记录：母种的来源， 母种和工作种的保存方法、保存温度、传代间隔时间、生长培育基及孵育条件，确认试验存 活度、纯度、关键诊断指标等，母种到工作种的传代代数。2.4 培育基2.4.1 单倍乳糖蛋白胨培育液：市售乳糖蛋白胨培育基，按铭牌配制，用定量加液器分装每个试管 10ml，加塞，在 115灭菌 20min，贮存于暗处备用。2.4.2 三倍乳糖蛋白胨培育液：市售乳糖蛋白胨培育基，按铭牌比例，三倍配制蒸馏水除外，用定量加液器分装每个试管 5ml 或每个大试管 50mL，加塞，在 115灭菌 20min， 贮存于暗处备用。2.4.3 EC 培育液：市售EC 培育基，按铭牌配制，在115灭菌 20min，用定量加液器分装每个试管 10ml，加塞，贮存于暗处备用。2.4.4 培育基存放于带紫外灯的灭菌物品专用贮藏柜中，当培育基颜色变化，或体积明显变化时废弃不用。2.5 分析步骤2.5.1 水样接种量将水样充分混匀后，依据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水 样量接种。同一接种水样量要有五管。相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样接种量依据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL 或0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。使用的水样量可参考下表2。水样种类接种量(mL1010.110-210-310-410-5表2 接种用水量参考表井水×××河水、塘水×××湖水、塘水×××城市原污水×××2文件编号：WJES/QZ-0057-2023常州市武进区环境监测站作业指导书名称：水质 粪大肠菌群一般水样测定作业指导书第 3 页共 5 页如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培育液5mL；如接种量为1mL 或少于1mL，则可接种于一般浓度的乳糖蛋白胨培育液10mL中。2.5.2 初发酵试验吸取适量水样，按相应的比例将其制成1：10和1：100或其他稀释比的稀释样。将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培育液的发酵管中。在37±0.5下培育24h±2h。产酸和产气的发酵管说明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。1:10稀释样品的制作方法为：吸取1mL水样，注入到盛有9mL灭菌水的试管中，混匀， 制成1:10稀释样品。因此，取1mL1:10稀释样品，等于取0.1mL水样。其它稀释比的稀释样 品同法制作。样品为地表水、废水时，取三个接种量，每个接种量的样品分别接种于5个试管内，共需15个试管。样品为地下水时，取三个接种量，首个接种量为100mL,其他每个接种量的样品分别接种于5个试管内，共需12个试管。试管内乳糖蛋白胨培育液的浓度与体积应依据接种量确定。假设接种量为 100mL，倒取100mL样品接种于装有50mL三倍浓度乳糖蛋白胨培育液的大试管内；假设接种量为10mL，吸取10mL样品接种于装有5mL三倍浓度乳糖蛋白胨培育液的试管内；假设接种量为1mL时，吸取1mL样品接种于装有10mL一般浓度乳糖胆盐培育液的试管内；假设接种量少于1mL时，吸取1mL稀释样品接种于装有10mL一般浓度乳糖胆盐培育液的试管内。2.5.3 复发酵试验稍微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培育物转接到EC 培育液中。在44.5±0.5温度下培育24h±2h水浴箱的水面应高于试管中培育基液面。接种后全部发酵管必需在30min 内放进水浴中。培育后马上观看，发酵管产气则证明为粪大肠菌群阳性。3 结果的计算依据不同接种量的发酵管所消灭阳性结果的数目，从表3 或表4中查得每升水样中的粪大肠菌群。接种水样为100mL2 份、10mL10 份、总量300mL 时，查表3 可得每升水样中的粪大肠菌群；接种5份10mL 水样、5 份1mL 水样、5 份0.1mL 水样时，查表4求得MPN 指数， MPN 值再乘10，即为1L水样中的粪大肠菌群。3MPN值= MPN指数´10(mL)接种量最大的一管mL表3、表4 见附件4 质量把握要求4.1 比照把握承受无菌水作全过程比照把握，当有明显杂菌污染时，说明测定过程某环节无菌性失 控，应重检验；承受阳性、阴性菌株作试验室过程比照把握，当阳性菌株不能生长或阴性文件编号：WJES/QZ-0057-2023常州市武进区环境监测站作业指导书名称：水质 粪大肠菌群一般水样测定作业指导书第 4 页共 5 页菌株生长时，说明测定过程某环节失控，应重检验。4.2 准确度同一试验人员所作前 15 个阳性水样平行双样结果为X、X X、X 0，i1，2，415，则准确度推断值 3.27 × R 。1i2i1i2i R = (å15i=1RR )，/15ii= logX1i-logX2i当分析所得 R = 的差距可以承受。5 数据处理5.1 数据审核logX1-logX2> 3.27 × R 表示周密度已失控；否则平行双样分析结果填写原始记录表与样品送检单，应经科室内部校对、审核后，方可上交。5.2 数据填报粪大肠菌群报告以个/L 单位填报，当数量在 100 以内按实有数据报告；大于 100 承受二位有效数字报告，有效数字后面的数值以四舍五入方法计算，为缩短数字后面的零数可用10 的指数形式表示如报告 16，000 或 1.6×104。6 样品采集6.1 采样瓶应经高压或干热灭菌处理前方可使用；6.2 样品含有余氯时采样瓶灭菌前应加脱氯剂，即于 500mL 采样瓶中参加 0.3mL10%硫代硫酸钠溶液；6.3 样品含铜锌等重金属较高时采样瓶灭菌前应加螯合剂，即于 500mL 采样瓶中参加1.0mL15%乙二胺四乙酸二钠EDTA-Na 溶液；26.4 同一地点同时采多瓶水样时，细菌学检验水样先采；6.5 采样时，采样瓶不得用水样荡洗；6.6 采样后，样品应 2 小时内检验，否则，应 10以下保存且不超过 6 小时。7 期间核查7.1 人员素养首先要参与省上岗证理论考试，理论考试合格前方能上岗。同时站内进展操作技能考 核、培训，考核合格前方能持证上岗，承但本项分析。按国家和省环境监测中心的要求，必要进展五年换证的理论考试、操作技能考核。7.2 仪器设备臭氧杀菌效果、高压锅压力表指示、恒温培育箱温控状况每年由站质管中心组织持证人员检验、校正，玻璃量具每三年由站质管中心组织持证人员校正。8 分析环境条件把握8.2 仪器设备文件编号：WJES/QZ-0057-2023常州市武进区环境监测站作业指导书名称：水质 粪大肠菌群一般水样测定作业指导书第 5 页共 5 页保持试验室环境干净，定期检查，避开恒温培育箱温控失控，做好仪器设备使用和保养记录。8.3 无菌室定期承受消毒剂清洁无菌室，定期检查臭氧杀菌效果，保证无菌室微生物试验条件的满足。8.4 分析环境条件检查和记录每次分析样品时，作无菌室空气细菌培育比照，保证无菌室空气微生物学质量，并做好记录。 日期： 日期：审批：日期：修订记录：5