黄曲霉毒素的测定优秀PPT.ppt

黄曲霉毒素的测定黄曲霉毒素的测定n n黄曲霉毒素（Aflatoxins,简写AFT），是黄曲霉、寄生曲霉及温特曲霉等产毒株的代谢产物，是一群结构类似的化合物。目前已发觉17种黄曲霉毒素，依据其在波长为365nm紫外光下呈现不同颜色的荧光而分为B、G二大类，其中B大类在氧化铝薄层板上于紫外光下呈现蓝色荧光，而G大类则呈绿色荧光。n n黄曲霉毒素属剧毒物质，其毒性比氰化钾还高，也是目前最强的化学致癌物质。其中AFTB1的毒性和致癌性最强，帮其在食品中允许量各国都有严格规定。n nAFT主要污染粮油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉籽等被污染严峻。黄曲霉毒素允许量标准n n食食品品品品种种允允许许量量标标准准（ppbppb或或10-10-6 6）n n玉米、花生、花生油玉米、花生、花生油2020n n玉米及花生制品玉米及花生制品2020n n大米、其他食用油大米、其他食用油1010n n裱花蛋糕、饼干、面包裱花蛋糕、饼干、面包55n n婴儿代乳食品不得检出婴儿代乳食品不得检出本章重点薄层层析法测黄曲霉毒素薄层层析法测黄曲霉毒素薄层层析是在黄曲霉毒素探讨方面应用最广的分别技薄层层析是在黄曲霉毒素探讨方面应用最广的分别技术。自术。自19901990年，它被列为年，它被列为AOAC(associationofofficialAOAC(associationofofficialagriculturalchemists)agriculturalchemists)标准方法，该方法同时具有定性和标准方法，该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能。定量分析黄曲霉毒素的功能。原理本法是利用样品中的黄曲霉毒素本法是利用样品中的黄曲霉毒素B1B1，经有机溶剂提取、，经有机溶剂提取、净化、浓缩、薄层分别后，在波长净化、浓缩、薄层分别后，在波长365nm365nm紫外光下产生紫外光下产生蓝紫色荧光，依据其在薄层上显示荧光的最低检出量蓝紫色荧光，依据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定黄曲霉毒素来测定黄曲霉毒素B1B1的含量。的含量。薄层色谱法黄曲霉毒素薄层色谱法黄曲霉毒素BtBt的最低检出量为的最低检出量为0 00004ug0004ug，最低检出浓度为最低检出浓度为5ug5ugKgKg。仪器小型粉碎机小型粉碎机样筛样筛电动振荡器电动振荡器玻璃浓缩器玻璃浓缩器玻璃板玻璃板5cm20cm5cm20cm、薄层板涂布器、薄层板涂布器绽开槽绽开槽(25cm6cm4cm)(25cm6cm4cm)紫外光灯紫外光灯100100一一125w125w、波长、波长365nm365nm滤光片、微量注射器滤光片、微量注射器(2)(2)试剂n n三氯甲烷、正己烷(沸程3060)或石油醚(沸程6090)、甲醇、苯、乙腈、无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水、丙酮。以上试剂在试验前需先进行空白试验，如不干扰测定即可运用，否则需逐一进行重蒸。吸附剂硅胶薄层层析用硅胶有多种规格。薄层层析用硅胶有多种规格。应应用用最最多多的的是是掺掺有有粘粘合合剂剂石石膏膏的的硅硅胶胶，称称有有硅硅胶胶G G，其其掺掺入入的的石石膏膏量量为为5-20%5-20%不不等等。硅硅胶胶有有时时含含有有铁铁盐盐及及氯氯离离子子等等杂杂质质，它它们们可可被被绽绽开开剂剂提提取取出出来来，对对层层析析的的结结果果产产生确定影响。生确定影响。硅硅胶胶HH不不含含粘粘合合剂剂和和其其他他添添加加剂剂（不不会会被被绽绽开开剂剂提提出出杂质）。杂质）。硅硅胶胶HF254HF254掺掺有有荧荧光光指指示示剂剂，可可在在短短波波254254纳纳米米的的紫紫外光下视察到荧光。外光下视察到荧光。硅胶硅胶GF254GF254含石膏及荧光物质。含石膏及荧光物质。黄曲霉毒素B1标准溶液n n1 1、黄曲霉毒素、黄曲霉毒素B1B1标准贮备液：精确称取标准贮备液：精确称取1 11 12mg 2mg AFTB1AFTB1标准品，先加入标准品，先加入2mL2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL100mL，避光、于冰箱，避光、于冰箱44保存。此标准液浓度约为保存。此标准液浓度约为10ug10ugmLmL。先用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯。先用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯一乙腈混合液调整其浓度为精确一乙腈混合液调整其浓度为精确10100ug0ugmLmL。在。在350nm350nm，AFTBAFTB在苯一乙腈在苯一乙腈(98+2)(98+2)混合液中的摩尔消光系混合液中的摩尔消光系数为数为19 800.19 800.2、黄曲霉毒素B标准运用液：I液(1.0ugmL)：取1mLAFTB标准液(10.0ugmL)于10mL容量瓶中，用苯一乙腈混合液稀释、定容。液(0.2ugmL)：取I液1mL，按上法定容5mL。液(0.04ugmL)：取液1mI。，按上法定容5mI。思索：在配制黄曲霉毒素B标准运用液时，为什么须要用贮备液来稀释而不是干脆配制？次氯酸钠溶液n n配制：取配制：取100g100g漂白粉，加入漂白粉，加入500mL500mL水，搅拌匀整。另水，搅拌匀整。另将将80g80g工业用碳酸钠工业用碳酸钠(Na2CO3H2O)(Na2CO3H2O)溶于溶于500mL500mL温水中。温水中。将两液合并、搅拌、澄清、过滤。此液含次氯酸将两液合并、搅拌、澄清、过滤。此液含次氯酸25g25gL L。n n思索题：思索题：n n1 1、次氯酸钠溶液的作用是什么？、次氯酸钠溶液的作用是什么？n n消毒用，污染的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可达到消毒用，污染的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可达到去毒的效果。去毒的效果。n n2 2、为什么次氯酸钠溶液能起到消毒的作用？、为什么次氯酸钠溶液能起到消毒的作用？操作步骤操作步骤n n样品处理样品处理提取提取浓缩浓缩薄板制备薄板制备点样点样绽绽开开定量定量(1)样品处理样品从大样经粗碎及连续多次用四分法缩减至05lkg后全部粉碎。粮食样品全部通过20目筛，花生样品全部通过10目筛、混匀。(2)提取称取称取20.00g20.00g经粉碎样品，置于经粉碎样品，置于250mL250mL具塞锥具塞锥形瓶中，加形瓶中，加30mL30mL正己烷或石油醚和正己烷或石油醚和100mL100mL甲醇甲醇水清液。水清液。振荡振荡30min30min，静置片刻，以叠成折叠式的，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。形瓶内。取取20.00mL20.00mL甲醇水溶液置于另一甲醇水溶液置于另一125mL125mL分液漏斗中，加分液漏斗中，加20mL20mL三氯三氯甲烷，振摇甲烷，振摇2min2min、静置分层，如出现乳化现象，可滴加甲醇促使、静置分层，如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g10g预先用三氯甲烷潮湿的无水预先用三氯甲烷潮湿的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于50mL50mL蒸发皿中，再加蒸发皿中，再加5mL5mL三氯甲三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最终用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。最终用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。浓缩将蒸发皿放在通风柜，于将蒸发皿放在通风柜，于6565水浴上通风挥干，水浴上通风挥干，然后于冰盒上冷却然后于冰盒上冷却2 23min3min后，精确加入后，精确加入1mL1mL苯一乙腈苯一乙腈混合液。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，混合液。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，再用此滴管吸取上清液转移于再用此滴管吸取上清液转移于2mL2mL的具塞试管中。的具塞试管中。留意：若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，留意：若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，接着溶解、混合，晶体即消逝。接着溶解、混合，晶体即消逝。测定单向绽开法n n1 1、薄板制备：称取、薄板制备：称取3g3g硅胶硅胶G G，加，加2 23 3倍量的水，倍量的水，研磨研磨1 12min2min呈糊状后，倒人涂布器推成呈糊状后，倒人涂布器推成5cm20cm5cm20cm，厚度约，厚度约0.25mm0.25mm的薄层板的薄层板3 3块。在空块。在空气中干燥气中干燥15min15min，在，在100100活化活化2h2h，取出，放干，取出，放干燥器中保存。一般可保存燥器中保存。一般可保存2 23d3d，若放置时间，若放置时间较长，可再活化后运用。较长，可再活化后运用。点样将薄板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端将薄板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm3cm的基线上的基线上用微量注射器或血红素吸管滴加样液。一块板可滴加用微量注射器或血红素吸管滴加样液。一块板可滴加4 4个点，点距个点，点距边缘和点间距为边缘和点间距为lcmlcm，点直径约，点直径约3mm3mm，在同一板上滴加点的大小，在同一板上滴加点的大小应一样，滴加时可用吹风机用冷风边吸边加。滴加样式如下：应一样，滴加时可用吹风机用冷风边吸边加。滴加样式如下：第一点：第一点：10LAFTB10LAFTB，标准运用液，标准运用液(0(004g04gmL)mL)。其次点：其次点：20L20L样液。第三点：样液。第三点：20L20L样液样液+10L0.04g+10L0.04gmLAFTBlmLAFTBl标准运用液。第四点：标准运用液。第四点：20L20L样液样液+10L0.02tLg+10L0.02tLg，mLAFTBmLAFTB。标准运用液。标准运用液。绽开与视察n n在绽开槽内加在绽开槽内加10mL10mL无水乙醚，预展无水乙醚，预展12cm12cm，取出挥干。再于，取出挥干。再于另一绽开槽内加另一绽开槽内加10mL10mL丙酮一三氯甲烷丙酮一三氯甲烷(8+92)(8+92)，绽开，绽开101012cm12cm，取出，在紫外光下视察结果，方法如下：取出，在紫外光下视察结果，方法如下：n na a由于样液上加滴了由于样液上加滴了AFTB1AFTB1标准，可使标准，可使AFTB1AFTB1标准点标准点与样液中与样液中AFTB1AFTB1荧光点重叠。若样液为阴性，薄板上第三点荧光点重叠。若样液为阴性，薄板上第三点AFTB1AFTB1为为0 00004g0004g，可用作检查样液中，可用作检查样液中AFTB1AFTB1最低检出量是否最低检出量是否正常出现；若样液为阳性；则起定性作用。薄层板上第四点正常出现；若样液为阳性；则起定性作用。薄层板上第四点AFTB1AFTB1标准为标准为0 0002ug002ug主要起定位作用。主要起定位作用。n nb b若其次点与若其次点与AFTB1AFTB1标准点的相应位置上无蓝色荧光点，标准点的相应位置上无蓝色荧光点，则表示样品中则表示样品中AFTBlAFTBl含量含量5ug5ugkgkg；若在相应位置上有蓝色荧光；若在相应位置上有蓝色荧光点，则须进行确证试验。点，则须进行确证试验。确证试验为确认薄层样上样液荧光系由黄曲霉毒素为确认薄层样上样液荧光系由黄曲霉毒素B1B1产生的，加滴三产生的，加滴三氟乙酸，产生氟乙酸，产生AFTB1AFTB1的衍生物，绽开后此衍生物的比移值在的衍生物，绽开后此衍生物的比移值在0.10.1左左右。于薄层板左边依次滴加两个点。右。于薄层板左边依次滴加两个点。第一点：第一点：10uL010uL004ug04ugmLAFTBlmLAFTBl标准运用液。标准运用液。其次点：其次点：2020LL样液于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应样液于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min5min后，用后，用吹风机吹热风吹风机吹热风2min(2min(板上温度不高于板上温度不高于4040)，再于薄层板上滴加以，再于薄层板上滴加以下两点。下两点。第三点：第三点：10uL0.04ug10uL0.04ugmLAFTBlmLAFTBl标准运用液。第四点：标准运用液。第四点：20L20L样液。样液。按上法绽开并视察，样液是否产生与AFTB1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为标准与标准的衍生物空白比照。稀释定量：样液中的AFTB1荧光点的荧光强度，如与AFTB1。标准点最低检出量(0.0004g)的荧光强度一样，则样品中AFTB1含量为即为5gkg若样液中荧光强度比最低检出量强，则依据其强度估计，削减滴加微升数，或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液的荧光强度与最低检出量的荧光强度一样为止。滴加式样如下：第一点：l0uLAFTB1，标准运用液(0.04ugmL)。其次点：依据状况滴加10uL样液。第三点：依据状况滴加15uL样液。第四点：依据状况滴加20uL样液。4)结果计算X=式中：X一样品中AFTBl的含量，ugkg；V1一加入苯一乙腈混合液的体积，mL；V2出现最低荧光时滴加样液的体积，mL；D一样液的总稀释倍数；m1加入苯一乙腈混合液溶解时相当样品的质量，g；0.0004AFTBl的最低检出限量，ug。测定双向绽开法原理原理 如用单向绽开法后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了如用单向绽开法后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了AFTB1AFTB1的荧光强度，需接受双向绽开法。薄层板先用的荧光强度，需接受双向绽开法。薄层板先用无水乙醚做横向绽开，将干扰的杂质展至样液点的一无水乙醚做横向绽开，将干扰的杂质展至样液点的一边，而边，而AFTB1AFTB1不动，然后再用丙酮一三氯甲烷不动，然后再用丙酮一三氯甲烷(8+92)(8+92)做纵向绽开，样品在相应处的杂质底色大量削减，因做纵向绽开，样品在相应处的杂质底色大量削减，因而提高了方法的灵敏度。而提高了方法的灵敏度。操作步骤(1)(1)点样：取薄层板三块，在距下端点样：取薄层板三块，在距下端3cm3cm基线上，在距左基线上，在距左边缘边缘0 08 81cm1cm其次篇食品理化检测技术处，各滴加其次篇食品理化检测技术处，各滴加10uLAFTB1(0.04ug10uLAFTB1(0.04ugmL)mL)标准液，在距左边缘标准液，在距左边缘2.82.83cm3cm处，各滴加处，各滴加20uL20uL样液。然后在其次块板的样液点样液。然后在其次块板的样液点上滴加上滴加l0uLAFTBl(0.04ugl0uLAFTBl(0.04ugmL)mL)标准液，在第三块板的标准液，在第三块板的样液点上滴加样液点上滴加10uLAFTB1(0.02ug10uLAFTB1(0.02ugmL)mL)标准液。标准液。(2)绽开：a横向绽开：在绽开槽内的长边置一玻璃支架，加10mL无水乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边，置于绽开槽内绽开，展至板端后，取出挥干。依据状况，须要时，可再重复l2次。b纵向绽开：挥干的薄层板以丙酮一三氯甲烷(8：92)绽开至1012cm为止。丙酮与氯甲烷的比例，依据不同条件自行调整。视察与评定结果a a在紫外光下视察第一、二块板，若其次块板在在紫外光下视察第一、二块板，若其次块板在AFTB1AFTB1标准点的相应处出现最低检出量，而在第一板与其次板的相同位置上未出现荧光，则样品中标准点的相应处出现最低检出量，而在第一板与其次板的相同位置上未出现荧光，则样品中AFTBlAFTBl含量含量5ug5ugkg.kg.b b若第一块板与其次块板的相同位置上出现荧光点，则将第一块板与第三块板比较，这第三块板上其次点与第一块板上其次点的相同位置上的荧光点若第一块板与其次块板的相同位置上出现荧光点，则将第一块板与第三块板比较，这第三块板上其次点与第一块板上其次点的相同位置上的荧光点是否与是否与AFTB1AFTB1标准点重叠，假如重叠，再进行确证试验。在具体测定中，三块板可以同时做，也可按依次做。当第一块板出现阴性时，第三块板标准点重叠，假如重叠，再进行确证试验。在具体测定中，三块板可以同时做，也可按依次做。当第一块板出现阴性时，第三块板可以省略，如第一块板为阳性，则其次块板可省略，干脆做第三块。可以省略，如第一块板为阳性，则其次块板可省略，干脆做第三块。确认试验另取薄层板二块，于第四、五两板距左边缘另取薄层板二块，于第四、五两板距左边缘0.80.81cm1cm处，各处，各滴加滴加10u LATTB1(0.04ug10u LATTB1(0.04ugmL)mL)标准液及一小滴三氟乙酸；在距左标准液及一小滴三氟乙酸；在距左边缘边缘2.82.83cm3cm处，于第四板滴加处，于第四板滴加20uL20uL样液及一小滴三氟乙酸；于样液及一小滴三氟乙酸；于第五板滴加第五板滴加20gL20gL样液、样液、10uL10uL。AFTBl(0.04ugAFTBl(0.04ugmL)mL)标准液及一小滴标准液及一小滴三氟乙酸，反应三氟乙酸，反应5min5min后，用热风吹后，用热风吹2min(2min(板上温度不高于板上温度不高于40)40)。再用双向绽开法绽开后，视察样液是否产生与再用双向绽开法绽开后，视察样液是否产生与AFTB1AFTB1标准点重叠的标准点重叠的衍生物。视察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。若样液衍生物。视察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。若样液AFTB1AFTB1含量较高时，则将样液稀释后，按单向绽开法中含量较高时，则将样液稀释后，按单向绽开法中(4)(4)做确认做确认试验试验.(5)稀释定量：若样液中AFTBl含量较高，可按单向绽开法中(5)稀释定量操作。若AFTB1含量较低，稀释倍数小，在定量的纵向绽开板上仍有杂质干扰，影响结果推断，可将样液再做双向绽开法测定，以确定含量。3.2.3结果计算同单向绽开法。3.2.4说明及留意事项用过后受污染的玻璃器皿，应经次氯酸溶液(25gL)，浸泡消毒后再清洗之。思索题n n单向与双向绽开法有什么不同？n n各有什么优点？