丙肝疗效监控之丙肝RNA检测方案设计.pdf
目录1.病人病例资料.12.概述与诊断.13.检测方案设计.23.1 标本类型.23.2标本采集.23.2.1 患者准备.23.2.2 采集及保存.23.3标本接收.23.4 标本检测流程.23.4.1 仪器准备.23.4.2 试剂准备.23.4.3 检测原理.23.4.4 检测步骤.33.4.5 注意事项.54.结果.54.1 结果判断.54.2 结果分析.55.结论.61丙肝疗效监控之丙肝丙肝疗效监控之丙肝 RNA 检测方案设计检测方案设计1.病人病例资料病人病例资料患者陆某某，男，45 岁，汉族，广东广州人，一年前因右上腹疼痛数月于我院门诊就诊，就诊当天精神尚可，除右上腹有疼痛外无放射痛，无恶心呕吐，无发热恶寒，无头晕头痛。经检查：血清 ALT：100IU/L、AST：65IU/L，抗-HCV 阳性，既往曾有吸毒史。其临床初诊为急性丙型病毒性肝炎。2.概述与诊断概述与诊断丙型病毒性肝炎（HCV），简称丙肝，因感染丙型肝炎病毒而引起的病毒性肝炎，经血液传播，不同人群均对其易感，属于乙类传染病。根据临床表现分急性和慢性。急性期黄疸可能会有轻度或中度升高，主要临床表现有恶心，食欲减退，疲乏无力，小便微黄，瞳孔泛黄等。慢性期表现为易于疲乏，食欲不振，腹部胀气等，也可没有症状。若不做抗病毒治疗干预的情况下会有 55%85%急性丙型肝炎的患者极易转为慢性丙型肝炎。丙型肝炎化验室诊断原则需根据检测结果（血清中 ALT、AST 上升；血清抗-HCV 阳性；血清 HCV RNA 阳性）联合流行病学史，临床特征进行鉴别诊治。在以上病例可知抗-HCV 为阳性，结合其他临床诊断初诊为急性丙型肝炎。对此为进行后续治疗因定量检测丙型肝炎病毒核酸 RNA，根据其核酸检测技术与相关疾病检测结果以及临床意义，为医生对病人的病情判断、药物疗效的观察、医治方案的选择做出指导依据。此检测可用于对丙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察，但检测结果不可作为患者病情单独2评估的指标，须结合临床表现及其他结果来评估，不可作为血液筛查丙型肝炎病毒试剂使用。3.检测方案设计检测方案设计3.1 标本类型标本类型：血浆/血清3.2 标本采集标本采集3.2.1 患者准备：清晨空腹采集；3.2.2 样本采集及保存：采集部位以肘正中静脉为宜，用无菌注射器采集3mL 静脉血于丙肝病毒 RNA 定量专用管或 4mlEDTA 抗凝管中颠倒混匀。采集完成后应立即送检，采血 6 小时内必须分离收集血清(切勿吸入红细胞)，并将血清转移至一次性使用的无 RNA 酶的无菌微量离心管中。抗凝剂的采血管不可使用肝素抗凝，样本如不及时检测，应于-20C 至-80C 冻存，反复冻融不宜超过 3 次。3.3 标本接收：标本接收：运输应冷冻条件下进行。接收前检查样本量的多少、有没有存在凝血、溶血和脂血等问题。如果有严重溶血脂血、管盖敞开，怀疑污染的标本，肝素抗凝标本等应联系临床重新采集。3.4 标本检测流程标本检测流程3.4.1 仪器准备：QuantStudio Dx 实时荧光定量 PCR 仪3.4.2 试剂准备：丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒（PCR-荧光探针法）（厂家：上海科华生物工程股份有限公司）3.4.3 检测原理：本实验主要是从血清中提取出 HCV RNA,在逆转录酶的作用下 RNA 逆转录为 HCV cDNA,之后在含特异性引物的指导下，以四种脱氧核苷酸为底物，通过 Taq DNA 聚合酶的酶促作用，对 cDNA 进行体3外扩增。应用 Taqman 技术探针且探针是完整的基础上，其探针 t（5末端）报告基团所发出的荧光会被（3端）淬灭基团所吸收。在其进行 PCR 扩增中，Taq 酶的 53活性则会将外切酶与模板所结合的特异性探针切断分离报告基团与淬灭基团。而报告基团在激发光的激发下，会产生特定的荧光，其荧光量与扩增的产物量成正比，检测荧光强度的改变便可分析标本中HCV-RNA 数值。3.4.4 检测步骤RNA 提取试剂的配制（标本制备区）A.裂解液 70加热 5 分钟，使瓶内晶体的全部溶化，吸 1000l 裂解液到助沉剂中混匀，再转移到裂解液中，混匀备用；B.取 14001 洗脱液至抑制剂中，混匀备用；C.取 9ml 无水乙醇至洗涤液 A 中，混匀备用；D.取 24ml 无水乙醇至洗涤液 B 中，混匀备用。RNA 提取（标本制备区）A.取N个1.5ml离心管(N=标本数+阴性对照+强阳性质控或临界质控品+4个标准品)，做好记号；B.加入 40l 去抑制剂+2001 血清+200l 裂解液振荡混匀、离心数秒(11000rpm)置 70C 孵育 10min 后离心数秒(11000 转/分)；C.加入 2201 无水乙醇混匀、离心数秒(11000rpm)，转移至核酸提取柱，11000rpm 离心 1min 弃液体；D.加入 700l 洗涤液 A 洗涤,11000rpm 离心 1min 弃液体加 700l 洗涤液 B 洗涤，11000rpm 离心 1min 弃液体，将核酸提取柱放入新的 2ml4离心管中；E.20000rpm 离心 3min 将少量残留乙醇除去,将核酸提取柱转移至新的2ml 离心管中；F 加入 501 洗脱液，至膜中央位置，静置 1min,11000rpm 离心 1min,离心管中收集的液体即为 PCR 反应模板。反应试剂配制（试剂准备区）A.取出主反应液、酶混合物和荧光探针，置室温下融化后，振荡混匀、瞬时离心备用；B.计算需配反应试剂的数量（标本数+阴性对照+临界质控品或强阳性质控品+4 个标准品）；C.按 11.2：8：0.8（PCR 主反应液：酶混合物：荧光探针）比例配置反应试剂，依次加入各组分后，振荡混匀，瞬时离心，以每个测试 201 的量分装至反应管中,移至标本制备区。加样（标本制备区）取已弄好的 RNA 模板 20l，至已分好的管中，盖上管盖，做标记，将管移至产物扩增与分析区。扩增检测（扩增和产物分析区）上机：RouModeHomeTemplateHCVfromdestopdefine2001.2010HCVFAM.NoneAssinSaveasRun打开 instrument 窗口，设置循环条件如下：5反应体积设为 40l。3.4.4 注意事项1待检新鲜血样本若不及时检测，应保存于-20C 或-80C。2试剂盒各组分使用前充分融化并摇匀。3 3应在专定区域制备 RNA，仪器和设备专用。4.结果结果4.1 结果判断1检测标本中 103IU/ml HCV RNA107IU/ml,测定有效，可报告相应结果。2检测标本中 HCV RNA107IU/ml,其结果仅供参考，报告上应注明107IU/ml。若需精确定量，可使用阴性血清稀释至 104107IU/ml 后重新检测。3检测标本中 HCV RNA1.0X103IU/ml 或 Ct 值无数值时，报告为1.0X103IU/ml。4检测标本中 HCV RNA1.0X103IU/ml，其抗-HCV 阴性，标本需复查。步骤温度时间循环数15025min12942min139410S55515S7215S49410S4256045S65检测标本中 HCV RNA 原先结果1.0X103IU/ml.而现在结果1.0X1031U/ml，若肝功能正常，标本需复查。6检测标本中 HCV RNA1.0X103IU/ml,无抗-HCV 结果，需用胶体金法检测抗-HCV，若胶体金法做出抗-HCV 阴性，标本需复查。4.2 结果分析1操作正确规范，仪器自检正常，质控数据相符。2第一次：HCV RNA107IU/ml第二次：HCV RNA103IU/ml3经过和临床医生的沟通，确认患者的治疗情况，结合其他检测结果，对比该患者第一次所做检验结果与经过治疗所做结果，可明显看出其病毒得到有效的控制。5.结结论论通过此次选择急性丙型病毒性肝炎患者病例作为毕业设计方案，在此次方案设计中，以检测患者丙肝 RNA 及其疗效监控，在设计过程中对有关理论知识如疾病的概念，诊断依据，临床症状都有着更深的了解以及新的收获。掌握了有关病例的收集，到治疗的跟踪，以及如何与临床医生交流沟通。在检测的过程中无论是标本的采集，实验的前期准备，试剂的配置利用，仪器的操作及其原理，还是后续结果的判断分析，各个方面的注意事项都有着深7入的学习。其所检测出的结果也对临床医生为患者的病情判断、药物疗效观察、治疗方案的选择提供依据和指导。在此次方案设计中不仅仅提高了我自身的实际操作能力，思维逻辑能力，判断力，更为我以后所在工作岗位的工作流程里有着的清晰线路。
