医学专题一免疫细胞功能检测技术概述.ppt

免疫细胞免疫细胞(xbo)(xbo)功能检测技术功能检测技术第一页，共四十三页。一一 淋巴细胞的功能淋巴细胞的功能(gngn(gngn ng)ng)检测检测 淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解体内实验主要是间接了解(lioji)(lioji)淋巴细胞对抗原、半淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定 第二页，共四十三页。淋巴细胞淋巴细胞T T细胞细胞(x(x bo)bo)（负责细胞（负责细胞(x(x bo)bo)免疫功能）免疫功能）B B细胞（执行体液免疫功能）细胞（执行体液免疫功能）NKNK细胞（非特异性免疫作用）细胞（非特异性免疫作用）第三页，共四十三页。一、一、T细胞细胞(xbo)功能的检测功能的检测T T细胞增殖细胞增殖(zngzh(zngzh)试验试验T T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定T T细胞介导的细胞毒试细胞介导的细胞毒试验验体内试验体内试验第四页，共四十三页。（一）（一）T T淋巴细胞增殖淋巴细胞增殖(zngzh(zngzh)试验试验1.1.原理原理(yunl)(yunl)：淋巴细胞淋巴细胞DNADNA合成合成(hchng)(hchng)分化分化母细胞母细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松核染色质疏松第五页，共四十三页。未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞 过渡型细胞大小(直径m)1220121668核大小、染色质增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、14个有或无无有丝分裂有或无无无胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色浆内空泡有或无有或无无伪足有或无有或无无第六页，共四十三页。2.2.淋巴细胞转化淋巴细胞转化(zhunhu(zhunhu)的刺激物的刺激物非特异性刺激物：非特异性刺激物：PHA -TPHA -T细胞细胞 ConA-TConA-T细胞细胞 PWM-TPWM-T、B B细细胞胞 LPS -BLPS -B细胞细胞特异性刺激物：特异性刺激物：异种异种(y(y zhn)zhn)抗原抗原 同种组织抗原同种组织抗原 第七页，共四十三页。3.3.检测检测(jin c(jin c)方法方法 形态法：刺激物 淋巴细胞（4-6天）母细胞化 同位素法：PHA 淋巴细胞（54h）DNA合成期 +3HTdR掺入 收集细胞(xbo)检测射线 测定测定(cdng)(cdng)细胞内的细胞内的3H3HTdRTdR第八页，共四十三页。（1 1）形态学检查法）形态学检查法第九页，共四十三页。方法学评价方法学评价(p(p ngjingji)：优点：形态学方法简便易行，优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察普通光学显微镜便能观察(gunch(gunch)结结果，适于基层实验室应用。果，适于基层实验室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。响，重复性和准确性较差。第十页，共四十三页。培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性（2 2）3H-TdR3H-TdR掺入法掺入法第十一页，共四十三页。优点：优点：3H-TdR3H-TdR掺入法敏感性高，客掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。观性强，重复性好。缺点：但需一定缺点：但需一定(yd(yd ng)ng)设备条件，同设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。时还存在放射性核素污染问题。第十二页，共四十三页。培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性MTT测吸光度(gungd)(3)MTT(3)MTT 比色法比色法第十三页，共四十三页。(二二)T)T细胞分泌功能细胞分泌功能(gngn(gngn ng)ng)测定测定 体外培养的体外培养的T T细胞经各种丝裂原或抗原细胞经各种丝裂原或抗原刺激后刺激后,分泌各种细胞因子分泌各种细胞因子,可借助免疫学、可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术细胞生物学及分子生物学技术(j(j shsh)分别检分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映水平，以反映T T细胞功能。细胞功能。第十四页，共四十三页。（三）（三）T T细胞细胞(x(x bo)bo)介导的细胞介导的细胞(x(x bo)bo)毒试验毒试验1.1.原理原理(yunl)(yunl)：靶细胞抗原靶细胞抗原(kngyun)(kngyun)T T细胞细胞观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTLCTL靶细胞靶细胞第十五页，共四十三页。形态学方法形态学方法(fngf)(fngf)：淋巴细胞：淋巴细胞+肿瘤细胞肿瘤细胞 计数计数残留肿瘤细胞残留肿瘤细胞2.2.方法方法(fngf)(fngf)意义(yy)：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力 第十六页，共四十三页。图15-2 T细胞细胞毒试验示意图第十七页，共四十三页。靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时5151CrCr释放释放(shfng)(shfng)法法第十八页，共四十三页。(四四)体内体内(t ni)(t ni)试验试验特异性抗原皮肤特异性抗原皮肤(p(p f)f)试试验验PHAPHA皮肤试验皮肤试验 第十九页，共四十三页。二、二、B细胞功能细胞功能(gngnng)检测检测B B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验(sh(sh y y n)n)溶血空斑试验溶血空斑试验B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测体内试验体内试验第二十页，共四十三页。(一一)B)B细胞细胞(x(x bo)bo)增殖能力的试验增殖能力的试验抗抗IgMIgM细菌细菌(xjn)(xjn)脂多糖脂多糖SACSAC的的SPASPAB B细胞细胞(xbo)(xbo)增增殖殖形态学形态学3 3H HTdRTdR掺入法掺入法第二十一页，共四十三页。(二二)溶血溶血(rn xu)(rn xu)空斑试验空斑试验1.1.原理原理(yunl)(yunl)：第二十二页，共四十三页。2.2.方法学：方法学：经典经典(jngdin)(jngdin)溶血空斑形成试验溶血空斑形成试验被动溶血空斑试验被动溶血空斑试验 第二十三页，共四十三页。3 3临床应用临床应用(y(y ngyngy ng)ng)与评价与评价溶血空斑试验主要用于测定溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素药物和手术等因素(yn s(yn s)对体液对体液免疫功能的影响免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。机体产生抗体的能力。第二十四页，共四十三页。(三三)B B细胞细胞(x(x bo)bo)抗体形成功能的检抗体形成功能的检测测 酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法ELISPOTELISPOT1.原理原理(yu(yu nl)nl)：第二十五页，共四十三页。2 2应用应用(y(y ngyngy ng)ng)与方法学评价：与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌该方法既可检测抗体分泌(fnm(fnm)细胞，细胞，又可检测抗体分泌又可检测抗体分泌(fnm(fnm)量。量。优点：优点：稳定、特异、抗原用量少；稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。胞。第二十六页，共四十三页。(四四)体内体内(t n(t n i)i)试试验验体内抗体产生的特异性抗原体内抗体产生的特异性抗原(k(k ngyungyu n)n)有白有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后免疫前及免疫后1 1周、周、2 2周、周、3 3周分别采血，周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内的效价，判断受检者体内B B细胞的功能。细胞的功能。第二十七页，共四十三页。染色染色(rns)(rns)计数计数离心离心(lxn)(lxn)取上清取上清测测LDHLDH或或AKPAKP离心离心(lxn)(lxn)取沉淀取沉淀测活细胞荧光测活细胞荧光测发光强度测发光强度测测CPMCPM值值形态法形态法酶释法酶释法荧光法荧光法同位素法同位素法化学发光法化学发光法三、三、NK细胞活性测定细胞活性测定靶靶细细胞胞溶溶解解常用靶细胞常用靶细胞:K562细胞株第二十八页，共四十三页。二二 吞噬细胞功能检测吞噬细胞功能检测(jin c(jin c)技术技术 按其形态大小分为两类：按其形态大小分为两类：大吞噬细胞大吞噬细胞(tn sh(tn sh x x bo)bo)单核单核-吞噬细胞系统吞噬细胞系统小吞噬细胞小吞噬细胞中性粒细胞中性粒细胞第二十九页，共四十三页。一、中性粒细胞功能一、中性粒细胞功能(gngnng)的检测的检测 细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检测 吞噬吞噬(tnsh(tnsh)和杀菌功能的检测和杀菌功能的检测第三十页，共四十三页。(一一)细胞运动功能细胞运动功能(gngn(gngn ng)ng)趋化功能检趋化功能检测测1.1.原理原理(yu(yu nl)nl)：第三十一页，共四十三页。2.2.方法方法(fngf)(fngf)：琼脂糖平板琼脂糖平板(pngbn)(pngbn)法法 滤膜渗透法（滤膜渗透法（Boyden 小室法）小室法）第三十二页，共四十三页。(二二)吞噬和杀菌吞噬和杀菌(sh jn)(sh jn)功能测定功能测定 1 1显微镜检查法：显微镜检查法：第三十三页，共四十三页。2.2.溶菌法溶菌法第三十四页，共四十三页。NBTNBT还原还原(hun yun)(hun yun)试验试验 原理原理(yunl)：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黄色）四氮唑基（淡黄色）甲臜（紫黑色）甲臜（紫黑色）3NBT还原(hun yun)试验 第三十五页，共四十三页。中性中性(zhngxng)(zhngxng)粒细胞粒细胞NBTNBT甲臜颗粒甲臜颗粒(kl)(kl)沉积于胞质中沉积于胞质中第三十六页，共四十三页。二、巨噬细胞功能二、巨噬细胞功能(gngnng)检测检测(一一)炭粒廓清炭粒廓清(ku(ku qng)qng)试验试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%10%炭粒。据炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液炭粒悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的浓度，根据血流中炭粒被廓清(kuqng)(kuqng)的速度，的速度，判断巨噬细胞的功能。判断巨噬细胞的功能。第三十七页，共四十三页。(二二)吞噬吞噬(tnsh(tnsh)功能检功能检测测 巨噬细胞对颗粒性抗原巨噬细胞对颗粒性抗原(k(k ngyungyu n)n)物质具有很强物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞的吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)(CRBC)、白色念珠菌、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。第三十八页，共四十三页。(三三)巨噬细胞溶酶体酶的测定巨噬细胞溶酶体酶的测定(c(c d d ng)ng)1 1酸性磷酸酶的测定酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法硝酸铅法 偶氮法偶氮法2 2非特异性酯酶的测定非特异性酯酶的测定 常用常用(ch(ch n yn y n)n)-萘醋酸萘醋酸法法第三十九页，共四十三页。(四四)细胞毒作用细胞毒作用(zu(zu y y ng)ng)测定测定 用用IFN-IFN-激活激活(j hu(j hu)小鼠巨噬细胞，观察其对小鼠巨噬细胞，观察其对125125I-UdRI-UdR标记的标记的DBA/2DBA/2小鼠肥大细胞瘤小鼠肥大细胞瘤P815P815的杀的杀伤活性。伤活性。第四十页，共四十三页。(五五)巨噬细胞促凝血活性测定巨噬细胞促凝血活性测定(c(c d d ng)ng)激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆活性因子，加速正常血浆(xu(xu jing)jing)的凝固，为此取的凝固，为此取已经已经3737预温的正常兔血浆和预温的正常兔血浆和CaClCaCl2 2混合液，加混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置3737，即时记录血浆凝固时间。即时记录血浆凝固时间。第四十一页，共四十三页。Thanks！第四十二页，共四十三页。内容(nirng)总结免疫细胞功能检测技术。淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。T细胞（负责细胞免疫功能）。未转化和转化淋巴细胞的形态特征。PWM-T、B细胞。LPS -B细胞。肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力。可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌(fnm)，并可定量。体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。常用靶细胞:K562细胞株。二 吞噬细胞功能检测技术。Thanks第四十三页，共四十三页。