三乙烯四胺对c-MYC启动子的调节作用教学提纲.doc

Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。三乙烯四胺对c-MYC启动子的调节作用-三乙烯四胺对c-MYC启动子的调节作用邓小红刘建辉*郑旭煦陈刚郭丽霞(重庆工商大学药物化学与化学生物学研究中心，重庆，400067)摘要目的探讨三乙烯四胺(triethylenetetramine,TETA)对c-MYC启动子的调节作用。方法构建c-MYC启动子的荧光报告质粒及其突变体，经过序列测定后，转染HEK293细胞24h后，以终浓度为0mmol/L,0.1mmol/L,1.0mmol/L,10mmol/L,100mmol/L的TETA处理，测定其启动子的转录活性，计算TETA对其转录活性抑制率。结果成功构建c-MYC启动子荧光报告质粒PGL3-Basic/c-MYCNHEIII1promoter及其突变体pGL3-Basci/c-MYCNHEIII1promotermutant。将二者分别转染细胞后发现，TETA可以剂量依赖的抑制c-MYC启动子的转录活性，而对突变体的转录活性抑制作用明显下降。结论TETA能通过c-MYC启动子上的超敏元件对其转录活性具有负调节作用。关键词：TETA；c-MYC启动子；G四链体；转录活性基金项目：国家自然基金(30600813,30701020)、教育部新世纪优秀人才计划（NCET-07-0913）以及重庆市科委重点基础项目（CSTC,2005BA5023）的资助。作者简介:邓小红，女，在读博士*通讯作者:刘建辉，男，教授，硕士研究生导师Tel:(023)62769652Email:jhliuTETAregulatesthetranscriptionofc-MYCpromoterbyenhancingthestabilityofG-quadruplexDENGXiao-hong,LIUJian-hui*,ZHENGXu-xu,CHENGang,GUOLi-xia(ResearchCenterofPharmaceuticalChemistry&ChemicalBiology,ChongqingTechnologyandBusinessUniversity,Chongqing,400067,China)ABSTRACT:OBJECTIVETostudytheeffectoftriethylenetetramine(TETA)onthetranscriptionofc-MYCpromoter.METHODSAfterthewildandmutantreportergeneplasmidscontainingthec-MYCNHEIII1sequencewereconstructed,thetwoplasmidweretransfectedintoHEK293cells.Thetransfectedcellswerereplatedinto96wellsplate,andtreatedwithdifferentconcentrationsofTETA(0.0mmol/L,0.1mmol/L,1mmol/L,10mmol/L,100mmol/L)forabout6-8h,theluciferaseactivitywasdeterminedwithitssubstrateBrightGlo.TheinhibitingrateofTETAonthereportergenewerecalculatedbytheluciferaseactivity.RESULTSTheluciferasereportgeneplasmidsincludingpGL3-Basic/c-MYCNHEIII1promoteranditsmutantwereconstructedsuccessfully.AndTETAcouldinhibitthetranscriptionactivityofwildreportergeneinadose-dependentmanner,butforthemutatedgene,theinhibitingratewasdecreasedsignificantly.CONCLUSIONTTETAhasnegativeregulatoryeffectonc-MYCpromoterthroughnucleasehypersensitiveelementIII1.Keywords:Triethylenetetramine；c-MYCpromoter；G-quadruplex；transcriptionc-MYC是一种重要的转录因子，参与多种生理功能，如在G1/S的过渡、G2/M的转化中都有作用，与细胞的生长、增殖、分化密切相关。它同时也是一种重要的原癌基因，位于肿瘤发生、发展的多种信号通路的关键交汇点，其蛋白的表达失调与肿瘤的发生、发展密切相关1,2，过量表达将直接或间接导致肿瘤的发生。研究表明，c-MYC基因的转录85-90是由其启动子区的核酸超敏元件III1(nucleasehypersensitiveelementIII1,NHEIII1)所控制3。该元件即为G4-DNA结构，一段富含鸟嘌呤的重复序列，该序列在一定条件下可以形成四链螺旋结构。该结构在端粒、免疫球蛋白开关区、基因启动子区等许多具有重要生物学功能的基因组中出现。目前已有多种小分子化合物显示出对G4-DNA的稳定作用，其中包括酰胺蒽醌类化合物4-7、卟啉类化合物等8-10。TETA是一种小分子化合物，在中性溶液中带正电，类似于K，我们前期通过圆二色谱以及热力曲线证明，TETA在体外能够增强人端粒DNA和c-MYCNHEIII1启动子序列形成的G4-DNA结构的稳定性11,15本文将研究TETA在细胞内对c-MYC启动子的调节作用，为TETA的抗肿瘤作用机制提供实验依据。1.实验材料药品和试剂c-MYC启动子质粒Pbv-Del1由美国哈佛医学院Dr.BertVogelstein惠赠，限制性内切酶NheI和EcoRV购自于TaKaRa公司，c-MYC启动子突变体引物由上海生工合成，突变试剂盒购自于Stratagene公司，Bright-GloTM荧光试剂购自Promega公司，转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。HEK293细胞株，购自中国科学院上海生化细胞所。细胞培养液DMEM、胎牛血清均购自Hyclone公司，TETA购自于Aldrich公司。2.方法2.1c-MYC启动子荧光报告质粒的构建将Pbv-Del1和PGL3-Basic两种质粒分别都用NheI和EcoRV进行双酶切，凝胶电泳后，切胶回收c-MYC启动子2500bp的片断和酶切后的PGL3-Basic质粒。将此两种酶切后回收产物按1:5比例在4下连接过夜，再将连接产物转化于大肠杆菌DH5中。37过夜培养，挑取单克隆菌，并提取其质粒后，用NheI和EcoRV进行酶切鉴定，将鉴定结果为阳性的质粒命名为PGL3-Basic/c-MYCpromoter。2.2c-MYC启动子突变体的构建根据GeneBank登录号：AC103819gi:22539123中的c-MYC启动子序列，设计突变引物为，上游:ATGGGGAGGGTGAGGAGGGTGGGGAAGGTGGGG，下游:TTCCCCACCCTCCTCACCCTCCCCATAAGCGCC。根据Stratagene的突变试剂盒说明，首先以PGL3-Basci/c-MYCpromoter质粒为模板进行PCR扩增，再将DpnI酶加入到扩增产物中，37作用1h后直接转化到XL-bule菌，涂板。37过夜培养，挑取单克隆菌，提取质粒后，用NheI和EcoRV进行酶切鉴定，将鉴定结果为阳性的质粒送TaKaRa公司测序，将突变成功的质粒命名为PGL3-Basci/c-MYCpromotermutant。2.3TETA对c-MYC启动子的调节作用肿瘤细胞HEK293以1×105/mL接种于6孔板中，待其融合度达到6580时准备转染。提取的PGL3-Basic/c-MYCpromoter和PGL3-Basic/c-MYCpromotermutant两种质粒分别调其浓度为0.5mg/mL。将此两种质粒分别与脂质体Lipofectamine2000混合均匀后，转染于HEK293细胞中，置37，5CO2培养箱中培养24h后，分别以1×106/mL浓度接种于96孔板，100mL/孔。待细胞贴壁后，约2h4h，加入稀释的TETA，使其终浓度分别为：0mmol/L,0.1mmol/L,1.0mmol/L,10mmol/L,100mmol/L，继续培养6-8h后，VeritasTURNERBIOSYSTEMS上测定细胞的荧光值。将TETA浓度为0的组设定为control(A)，同批测定其它组的值(X)计算抑制率(I），抑制率(I)(AX）/A×100，统计分析，采用origin7.5软件进行。3.结果3.1c-MYC启动子荧光报告质粒的构建从Pbv-Del1质粒上酶切下了c-MYC启动子的全片断，并将其与PGL3-Basic质粒连接。经过对单克隆菌株质粒的酶切鉴定，发现从PGL3-Basic酶切下大小为2500bp的DNA片断，连接成功的质粒总大小为7300bp左右，从而构建了c-MYC启片动子荧光报告质粒PGL3-Basic/c-MYCpromoter(Fig.1,Fig.2）。图1.c-Myc基因结构Fig1.Structureofc-MYCgene图2.pGL3-Basic/c-mycpromoter的酶切鉴定Fig.2IdentifictionofpGL3-Basic/c-MycpromoterdigestedwithNheIandEcoRVLane1:DNAmarkerDL15000;Lane2:PGL3-Basic/c-mycpromoterplasmid;Lane3,4:PGL3-Basic/c-mycpromoterplasmiddigestbyNheIandEcoRVLane5:DNAmarkerDL20003.2c-MYC启动子突变体的构建以pGL3-Basic/c-MYCpromoter为模板进行PCR定点突变，扩增产物转化XL-bulez菌，挑取到含有PGL3-Basic/c-MYCpromoter突变位点的质粒，经过测序，发现c-MYC启动子NHEIII1的G12A突变成功(Fig.3)，由此获得了pGL3-Basci/c-MYCpromotermutant。AB图3.PGL3-Basci/c-mycpromotermutant质粒的酶切鉴定和测序结果Fig3.IdentificationofPGL3-Basci/c-MycpromotermutantdigestedwithNheIandEcoRV(A)andthesequencereport(B)3.3TETA对c-MYC启动子的调节作用为了考察TETA对c-MYCNHEIII1启动子转录活性的影响，我们分别用不同浓度的TETA处理转染了野生型和突变型报告基因质粒的293细胞，结果发现，与对照组相比，加入TETA的细胞孔的荧光值明显下降；100µMTETA作用8小时对报告基因的转录抑制率可以达到66.2%，即使TETA浓度低至nM水平，也有明显的抑制作用，0.1µMTETA作用8小时对报告基因的抑制率为30.4%。但是，当我们对c-MYCNHEIII1启动子形成G四链体的关键核苷酸突变之后，TETA的这种抑制作用明显下降，0.1和100µMTETA作用8小时的抑制率分别为4.3%和25.7%，表明TETA对c-MYCNHEIII1启动子的转录活性的抑制作用与其稳定该序列形成的G四链体结构有关。实验结果如图4所示。图4.TETA对c-MYC启动子转录活性的抑制作用Fig4.Triethylenetetramineinhibitsthetranscriptingactivityofc-MYCpromoterNHEIII1.AftertheHEK293cellsweretransfectedwithplasmidofwildandmutantedc-MYCNHEIII1promoterfor24h,thecellswerereplatedin96wellplate,afterthecellsattached,indicatedconcentrationsofTETAwereadded,andcontinuetoincubatefor6-8h,afterthat,theluciferaseactivitiesweredetectedwithitssubstrate(Brightglo).Allthedataareshownasmean±SDfromthreeindependentexperiments.*，p<0.01Vscontrol.4讨论c-MYC与肿瘤有着密切的联系，其蛋白的过表达将直接或间接导致肿瘤的发生，而c-MYC蛋白的表达水平最主要取决于其启动子的转录活性高低。c-MYC的启动子属于内启动，包含在外显子1中。经研究发现，c-MYC启动子中存在一段富含鸟嘌呤的重复序列，即G4-DNA结构，其主要控制着该蛋白的转录。实验证实，K+离子存在时，NHEIII1区碱基能够形成4种平行结构的G4-DNA12,13。当能够提高G4-DNA稳定的阳离子卟啉化合物TMPyP4作用与肿瘤细胞时，细胞中c-MYCmRNA及蛋白水平均被下调；与之相对应当NHEIII1区的DNA序列发生GA突变时，G4-DNA的稳定性降低，c-MYC启动子的转录活性能提高3倍14。Lemarteleur等发现三嗪衍生物9944，阳离子卟啉化合物TMPyP4等多种已报道的通过G4-DNA能够有效的稳定c-MYC启动子NHEIII1区形成G4-DNA结构，并有可能在肿瘤细胞中抑制c-MYC基因的转录，从而有可能阻止肿瘤细胞周期的进程。我们前期研究发现，TETA能稳定人端粒DNA以及c-MYCNHEIII1形成的G四链体DNA结构,并能抑制c-MYC基因的表达15。但是，我们还没有获得TETA抑制c-MYC表达的直接证据。本文中，我们通过基因定点突变技术，利用报告基因法对TETA调节c-MYCNHEIII1启动子的转录活性进行了分析，实验结果表明，TETA可能通过c-MYC启动子的G4-DNA结构对其启动子的转录活性具有调节作用。本实验构建了c-MYC全长启动子的荧光报告质粒PGL3-Basic/c-MYCNHEIII1promoter，其中包含其P1和P2启动子(图1)。以此质粒为模板，在其启动子的G4-DNA区域内设计一突变位点，将G12突变为A，以破坏其结构，从而改变启动子的转录活性。由于该突变位点位于富含GC区，因此采用QuikChangeXLSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene)试剂盒进行突变，以保证突变成功。经过生物公司测序，我们成功获得突变体质粒PGL3-Basci/c-MYCpromotermutant。将此两种质粒转染HEK293细胞后，我们发现，当加入TETA作用后，野生型启动子的转录活性明显下降，且呈剂量依赖关系，但对突变体，这种抑制作用明显下降，提示TETA抑制c-MYC基因表达可能与其在体内能与c-MYC启动子的超敏元件相互作用，增加G4-DNA结构的稳定性有关。大量的研究结果证实，c-MYCNHEIII1形成的G4-DNA在不同条件下有不同的结构(图5)，主要包括篮式结构和椅式结构16。该突变位点为G12，处于形成G四链体结构的关键位置，当其被突变以后，造成其G四链体结构的不稳定，使得G4-DNA松散，从而可能增加了启动子与转录调节因子作用的机会或增加了转录酶通过该区域的机会，从而增加了其转录活性。我们也同时发现，高浓度的TETA对突变型的c-MYCNHEIII1启动子的转录活性仍有一定的抑制作用，这可能是由于其单一位突变不能完全破坏其高级结构，仍能在一定程度上形成G-四链体DNA结构。图5.突变位点在G4-DNA结构的示意(AbstractfromPNAS,2002；99(18):1159311598)致谢本项目得到国家自然基金(30600813,30701020)、教育部新世纪优秀人才计划（NCET-07-0913）以及重庆市科委重点基础项目（CSTC,2005BA5023）的资助。参考文献1 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