丙型肝炎病毒p7病毒维罗哌啶的结构和功能特性.docx

丙型肝炎病毒p7病毒维罗哌咤的结构和功能特性抽象丙型肝炎病毒（HCV）感染在人群中的高患病率引发了密集的研究工作，从而导致了治愈性抗病毒疗法的开展。此外，HCVB 成为研究控制正链RNA病毒复制周期的基本原理的典范。事实上，对于大多数HCV蛋白，已经建立了基于高分辨率X射线和 NMR （核磁共振）的结构，并且对其生化和生物学特性有了深刻的了解。一个例子是p7, 一种小型疏水性蛋白质，对于RNA 复制是可有可无的，但对于感染细胞中传染性HCV颗粒的产生和释放至关重要。由于其能够插入膜并组装成作为极简离子通道 的均聚低聚物，HCV p7是维罗波林家族的成员。本综述综述了不同HCV基因型p7的结构和双孑L/离子通道活性的最新发现。 详细描述和讨论了 HCV p7在其单体和低聚态下提出的替代构象和拓扑结构。我们还总结了 p7在HCV复制周期中可能发挥的 不同作用，并强调了离子通道/孔样功能以及p7与其通道活性无关的其他作用。最后，我们讨论了利用维罗哌汀抑制剂拮抗p7 离子通道/孔样活性的可能性。关键字:丙型肝炎病毒;p7蛋白;维罗波林斯;小膜蛋白;离子通道活性;低聚结构;毛孔样功能;病毒组装和释放;抗病毒靶标引言丙型肝炎病毒（HCV）.在黄病毒科中彩位肝病毒膜。HCV是一种正链RNA病毒，编码单个多蛋白前体，该前体由粗 糙内质网（ER）处的RNA翻译产生。该多蛋白以优先但不是强制性的顺序蛋白水解加工成10种成熟蛋白质（图1） 2, 3o 其中，p7将结构蛋白（助核心和包膜糖蛋白E1和E2）与非结构蛋白别离，这些非结构蛋白对病毒RNA复制至关重要（NS3, NS4A, NS4B, NS5A和NS5B）。重要的是，多蛋白加工是产生裂解中间体的调节事件，p7对此进行了最好的说明。事实 上，p7作为别离产物的鉴定并不明显或不可预测。这是由于E2-p7-NS2和E2-p7前体在ER处的信号肽酶裂解效率低下5, 6, 7（图 1）。由于缺乏足够的细胞培养模型在培养细胞中繁殖HCV以及识别p7的可靠抗体的可用性有限，最初将p7的不同功能归因 于病毒生命周期的尝试变得复杂。基于HCV复制因子（解NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B和NTRs）的自我复制亚基因 组relicon的初始开发说明，结构蛋白和p7对于病毒RNA复制是可有可无的8。然而，由于这些再克隆子仅概括HCV复制周 期的细胞内步骤，因此无法解决p7在病毒产生中的可能作用。到那时，人们推测p7可能是一种膜通透蛋白，并参与病毒的产生/释放9。这一假设基于对p7膜拓扑影外勃预测，该拓 扑结构与相关鼠疫病毒的p7蛋白和。病毒的6K蛋白相似，后者是经过充分研究的病毒科成员10, 11。逋过体力研究获得了 对HCV p7的离子通道/孔样活性的强支持，证明了对阳离子的局部选择性，但也对小分子具有选择性12, 13, 14, 15, 16, 17。然而，关于HCV p7在病毒产生中的作用的研究只有在对一名日本爆发性肝炎患者进行基因型（Gt） 2a别离株（指定为 JFH-1）的分子克隆后才成为可能18, 19。这种别离株在人肝癌细胞系中有效复制并产生感染性病毒颗粒，用于证明p7对于 颗粒组装和释放至关重要20, 21,这一发现与早期一项研究说明p7对于伏的生产性HCV传播至关重要的研究一致22.通过 使用一系列基因内和基因间嵌合HCV基因组，这些观察结果被扩展到许多其他HCV Gts20, 21。有趣的是，通过使用HCV 样颗粒和p7抑制剂，已经提出了 p7作为病毒进入的增强子的贡献23, 24o然而，在感染性病毒颗粒中检测p7的困难，以及 p7缺失不影响HCV特异性感染性的观察结果引起了争议20, 25o5NTRHCVssRNA AUGPolyprotein processingH2N9.6 KbE2 同 NS2 )' NS3 网 NS4751 81410301662 1716NS2p7 precursorsViroporinNS2NS3图1.HCV基因组组织，多蛋白处理和p7前体。HCV RNA基因组的示意图，包括5和3,末端的非翻译区域（NTR）以及编码 区域显示在顶部。AUG和UGA分别表示长开放阅读框的起始和停止密码子。由IRES依赖性RNA翻译和裂解产物产生的多蛋 白前体如下所示。数字是指JFH-1别离株的氨基酸位置（GenBank加入编号AB047639）。非结构蛋白以粉红色描绘，p7以 黄色描绘，结构蛋白以绿色描绘。负责多蛋白裂解的细胞和病毒蛋白酶由剪刀表示并在框中指定。SPP,信号肽肽酶;SP,信号 肽酶。突出显示p7前体和p7oViroporins是由RNA和DNA病毒中鉴定的不断增长的病毒蛋白家族形成的。这些蛋白质能够低聚，在宿主细胞膜中形成 亲水性孔/离子通道26, 27。Viroporins具有共同的特征，例如它们的小尺寸，疏水性，至少一个两相跨膜结构域的存在和细胞 致病性。感染期间维罗波林表达的主要后果是靶膜上的离子梯度破坏，从而改变生理细胞功能27, 28。另一方面，维罗波林作 用导致为病毒生命周期的不同步骤建立有利的环境，通常但不完全是病毒粒子的组装及其从感染细胞中释放26。例如，在HIV-1 VPU、avirus 6K,甲型流感病毒M2、SARS-CoV （严重急性呼吸综合征冠状病毒）E和HCVp7的情况下，删除维罗蛋白编码 序列会降低传染性病毒颗粒的产生和致病性22, 29, 30, 31, 32, 33。在以下局部中，我们将讨论与HCVp7维罗蛋白的结构和功能相关的主要发现，以及其在抗病毒治疗中的可能用途。1. HCV p7拓扑结构和结构基于蛋白质结构和膜拓扑结构，已经定义了两个主要类（I和II）和两个子类（a和b）的玻璃体。还提出了第三类包括具 有3个疏水结构域的维罗波林26。在这方面，HCV p7是IIA类维罗哌咤;它具有63个氨基酸残基的长度，形成两个跨膜跨区 域，这些区域由碱性细胞质环隔开，N-和C-末端都面向ER管腔9（图2A）。然而，已经提出了一种将C端暴露于细胞质的 替代拓扑结构，作为从E2-p7前体蛋白的表达中推导出来的34。一些实验室报告了 p7在伏力形成均聚物并组装成离子通道样 结构的倾向12, 13, 14, 15, 16, 17, 35o这些结果基于使用插入人工脂质双层的重组p7或合成肽、非洲爪蟾卵母细胞中 p7的过表达和电生理记录技术，包括膜片钳和双电极电压钳12, 13, 14, 15, 17, 35o在电子显微镜（EM）,生化数据和 计算建模技术的支持下，在HCV p7序列的才裳物分析中预测了单体的发夹状结构，N端跨膜结构域（TMD）衬里在孔隙的管 腔内12, 36, 37（图2A）。使用透射EM （TEM）和基于计算机的图像分析的初步研究说明，p7融合蛋白在脂质体中形成六 聚体和七聚糖复合物的混合物12, 15。p7平衡沉降实验的结果与包含6个±1亚基的不同p7低聚态的形成一致，其异质性强 烈依赖于洗涤剂17。因此，在生物膜中，p7可能以可变尺寸的低聚物混合物的形式存在。随后的TEM研究结合化学合成的 Gt2a全长p7的单颗粒重建，在pH7.0下在短链DHPC（1, 2-二庚酰基-松果酸甘油-3-磷酸胆碱）洗涤剂胶束中溶解，以16A 的分辨率提供了六聚体p7通道的第一个3D结构16。发现p7通道以花形复合体的形式存在，其中6个花瓣从圆锥形基部出现。 通过本研究生成第一个EM密度图，可以将模拟的p7单体建模为具有高拟合值（97.3%）的六聚体体积，并预测它们在通道下 部的相互作用。此外，该复合物的拓扑结构说明每个单体中的N-和C-末端暴露于花瓣的尖端，可以通过用p7特异性抗体进行 免疫金标记来确认。因此，建议将通道的更开放局部突出到ER管腔中（图2B）。这种基于EM的3D模型随后被用作从NMR 求解的单体结构中重建其他Gts的p7通道的有用模板38。目前，已经报道了 HCV p7单体的四种基于NMR的结构（图2A）。首先，Monserret及其同事从溶解在三氟乙醇/水混 合物中的Gt1b获得了 p7的第二个TMD的结构，并根据膜模拟实验的结构数据提出了 p7单体的模型17。Foster及其同事在 甲醇中获得了全长p7的NMR结构39。Cook及其同事的结构揭示了 pH 4.0时的Gt1b p7单体，并重组为由含有短酰基链的 DHPC形成的胶束40。有趣的是，欧阳及其同事报告的基于NMR的结构在DPC胶束（解含有更长酰基链的十二烷基磷胆碱） 中用p7测定，并根据平行负染色EM实验假设具有六聚体低聚物尺寸35。虽然在Gt1b的不同HCVp7亚型之间发现了明显的相似性，但Gt5ap7的结构存在明显的差异35（图2A, B）。Gt1b 的单体表现出经典的“发夹状”构象，而Gt5a p7单体表现出以不寻常的方式倾斜的。螺旋元件的扩展和更复杂的分布（图2A, B） o在发夹模型中，可以根据报告的结构通过可变定位来区分三个或四个螺旋段（图2C）。在Opella和Penin组的结构中， 己经提出了通过柔性转弯连接到第一个TM螺旋的N端。螺旋，以与分子动力学模拟推导出的脂质双层的头基相互作用17,40。 膜界面处的螺旋区域可能与随后的跨膜螺旋采用几乎垂直的角度40。在Ghffin基团的结构中，Gt1bp7 （别离物J4）的前两个 螺旋段表现为单个跨膜螺旋39（图2A）。此外，在所有Gt1b结构中，胞质环将第一跨膜区域与第二跨膜区域分开，后者表现 出一定的变异性，包括位于不同位置的一个或两个螺旋元件17, 39, 40o大多数C端部件被建议为结构化或包括一个短而灵 活的螺旋（图2A, C）。总体而言，p7似乎是一种灵活的蛋白质，由不同组观察到的结构差异支持。需要注意的是脂质或有机 溶剂的作用，它们决定了膜的组成和厚度，从而影响p7的最终构象37, 41。p7 Gt 1bStrain:HCV-JJ4J4(FLER membraneER lumenCytoplasm图2.p7单体和六聚体的结构。（A）从核磁共振结构17推导出的HCVp7Gt1b （HCV-J）的膜拓扑结构如左图所示。基于核 磁共振的p7结构（2MTS;中间。经40许可改编。版权2013美国化学学会）和Gt1b别离株J4的Flag-p7 （3ZD0;右） 在中间面板中显示为色带39, 40o从NMR结构推导出的HCVp7 Gt5a膜拓扑结构的示意图如图35所示。标明了为每个结 构提出的。螺旋。Gt1b p7的胞质环或Gt5a p7的螺旋2中的基本保守残基以蓝色粗体字母表示。Flag-p7结构中的黄色区域 表示FLAG。螺旋和额外的残留物。请注意，所示的Gt1b p7的单体结构表现出“发夹”构象，而Gt5a的p7单体采用“订书钉” 构象（B）上图：Gt2a HCV别离物的p7六聚体的EM密度图，垂直（左）和上（右）视图16。将模拟的p7单体（紫 色和蓝色）安装到花形图中，其N和C端面向花瓣尖端。p7的拓扑结构如描述中所述，N端和C端均暴露于ER管腔9, 16。 中间面板：基于NMR的Gt5a HCV别离株（2M6X）的p7的六聚体结构35。单体结构中的。螺旋以颜色突出显示。残 留物Gly34驻留在保守的碱性残基之间，对应于第二。螺旋中的扭结。底板;从核磁共振数据（3ZD0）推导出的Gt1b HCV分 离物J4的p7的七烷基模型39。突出显示His17和Phe25的侧链；（C）来自代表性Gts的p7序列的多重比对，包括（A）和 （C）中显示的两个菌株的p7o数字是指用作参考的Gt2a （JFH-1） p7中的氨基酸位置。保守的基本残留物以蓝色和粗体表示。 以粗体和黑色字母突出显示的残基己被建议参与离子门控并驻留在低聚通道的孔腔中。顶部和底局部别显示了与（A）和（B） （相同颜色）中p7单体结构相对应的。螺旋，转弯和环区域的示意图。尽管Gt1bp7单体中二级结构元素的数量和分布存在差异，但令人惊讶的是，所有这些通道亚基都具有发夹构象，并且反 平行TM区域略微倾斜到脂质双层（图2A, C） o在这方面，尚不清楚为什么Gt5a的p7单体呈现出不寻常且独特的构象（图 2A,右图）。然而，该结构代表了从基于NMR的六聚体复合物中提取p7亚基构象的第一个例子35。它揭示了三个以锐角倾 斜的。螺旋区域，并采用弯曲的“钉状”构象，其中第一个和第三个螺旋通过Gly 34处扭结的第二个螺旋别离（图2B）。有趣的 是，该残基位于两个高度保守的碱性氨基酸残基（K/R33, R35）之间，这两个残基对病毒颗粒在鑫内的传染性至关重要，对 p7离子通道活性也很重要22, 42o与Gt1bp7的模型相比，不同Gts的p7蛋白之间的螺旋元件的不同定位以及组装通道内单 体的更扩展排列揭示了意想不到的特征，例如缺乏连接两个跨膜区域的非结构化环或嵌入脂质双层的C端区域（图2B）。欧阳及其同事的研究还提供了有关孔隙整体结构的重要细节。有趣的是，嵌入膜中的p7低聚物表现出类似于花状形状模 型的漏斗状形状，并且具有高精度（相关系数0.94）的EM图谱，即使用于重建用于NMR和EM分析的p7的洗涤剂浓度不相 同。这种六聚体结构通过单体之间的多重相互作用来稳定，使得一个单体的第三个C端螺旋（H3）与相邻单体的第二个螺旋（H2） 和连续单体的第一个N端螺旋（H1）相互作用（图2B）。这种亚基的复杂重排可能引起共折叠过程，至少在DPC存在下蛋白 质“复性”期间使用的林条件下43。然而，这种结构是否可以在生理背景下获得仍然是一个谜，因为这种共折叠不能用我们目 前对纤维索蛋白质折叠的理解来解释。先前基于NMR和EM的研究说明，单体内相互作用在这种结构中不存在，这一事实是新 颖且值得注意的。在该NMR结构中，亲水通道的较窄局部由H1螺旋（N-termini）的紧密结合形成，随后由H2螺旋形成的更 宽的区域形成。根据这项研究，结构突起或“花瓣”主要对应于围绕和包装中心腔的H3螺旋，而H2螺旋和H2-H3互连区域的后 半局部代表花瓣尖端。因此，这种花朵状的架构呈现出与前面描述的拓扑结构不同的拓扑结构16, 35（图2B） o来自Gt1b 和Gt5a的p7单体之间存在替代结构，至少局部可以通过氨基酸序列的遗传多样性和每项研究中使用的实验条件来解释。但是, 其他可能性可能会解释与Gt相关的明显结构差异。在感染不同Gts的HCV的细胞中理想地进一步表征p7结构将有助于证实这 一新发现。Gt1a、1b和2a的六聚体或七聚体p7通道的模型是通过分子动力学获得的，这些结构是使用插入脂质双层的相应单体的 预测结构或基于NMR的结构37, 38, 39, 40。在这些研究中，p7束显示第一个TMD的腔方向，其中C端TM区域面向膜 疏水相并围绕通道（图2B）。引人注目的是，塞干才算物的Gt5ap7单体二级结构研究中，预测了发夹状褶皱，让人联想到 Gt1bp7的NMR结构38。在此基础上，报道的组装到通道中的Gt5a单体的弯曲“订书钉状”构象无法先麴地预测。同样，欧阳 及其同事报告的完整Gt5a低聚p7复合物的结构在计算机预测的p7单体构象下也是不可预测的。因此，可以预期在齐聚时在 单体p7发夹中诱导构象变化。在这种情况下，与低聚物相比，p7单体可能发挥不同的功能，这与HCV生命周期中p7的不同 报告功能一致，这些功能依赖于或独立于离子通道活性（见以下各节）。然而，对Gt5a p7六聚体的其他分析揭示了反对在生 理膜环境中存在这种结构的特征。其中之一是存在18个带正电的侧链，对应于暴露于疏水膜相的精氨酸残基44。虽然这可能 是由于胶束的组成和形状，但在细胞膜环境中很难调和。另一个例子是在p7六聚体中存在几个嵌入脂质膜疏水核心的亲水空腔 41 o因此，鉴于p7的非常灵活的结构及其与脂质的相互作用，获得生理上相关的结构将需要在真正的膜样环境中研究p7,模 拟ER的组成和厚度。尽管已经确定不同HCV Gts的p7左雄外形成异质大小的均质低聚物，但感染肝细胞中是否存在这种p7物种混合物仍有 待确定。此外，细胞中p7膜拓扑的初步研究基于别离的p7或E2-p7前体的表达，因此，需要使用编码来自不同Gts的p7全 功能（标记版本）的全长HCV基因组在基于感染的系统中进行验证。在感染细胞中形成的p7复合物的生化表征应该允许确定 为p7单体提出的结构/构象的生理相关性，到目前为止，这些结构/构象主要是从基于NMR的体外方法中推导出来的。2. HCV p7离子通道和孔状功能由于其体积小、疏水性高以及细胞膜中形成低聚物的倾向，玻璃蛋白是解释被不同病毒感染的细胞中膜通透性变化的理想 候选者26。这种膜改变在评估小化合物进入或释放进入或释放培养细胞和人造脂质体的研究中得到了进一步的描述。例如，抗 生素潮霉素B （HB;分子量为527.5道尔顿）已被广泛用作探针，以评估各种病毒蛋白个体表达时膜通透性增加45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54。虽然这是一种间接测定（砂HB选择性地进入具有增强膜通透性的细胞并抑制蛋白质合成）， 并且细胞外表存在玻璃蛋白不是病毒感染细胞的共同标志，但这种方法对于研究许多家庭成员的维罗波林功能具有无可估量的 价值。然而，HB是直接通过细胞外表的维罗蛋白组装孔进入细胞，还是通过内吞作用的上调间接发生，仍有待探索。其他生物 物理测定最初用于监测预加载脂质体中具有定义大小的染料的释放，以确定这些蛋白质的孔样性质以及预测其内通道的大小 55,56,57。使用基于脂质体的小型荧光探针（如拔基荧光素（0.37 KDa）或pH传感器HPTS（8-羟基由1,3,6-三磺酸;0.52KDa） 等类似脂质体的方法，用于证实不同Gts的HCVp7形成孔隙24, 58o该系统也已适用于旨在寻找HCV p7特异性抑制剂的高 通量筛选40, 59, 60o综上所述，所有这些体处测定都证明了 p7的非选择性孔隙特性，但是需要进一步的研究来证实假设大 分子通过p7直接进入培养细胞。虽然甲型流感病毒的M2蛋白和小球藻病毒PBCV-1的Kev蛋白分别对质子和钾具有高选择性61, 62,但大多数维罗普 鸟表现出低离子选择性。HCVp7似乎也是如此，其对阳离子邸1离子的偏好较小，如人工双层和小洌小蟾卵母细胞的电生理记 录技术所示12, 13, 14, 15, 17, 35o最近的研究为来自不同Gts （加1a、1b和2a）的p7在别离的细胞内膜囊泡和HCV 感染细胞中的质子电导提供了强有力的证据58, 63oHCV p7与甲型流感病毒（IAV）的M2维罗蛋白的功能相似性及其常见的酸活化质子通道活性说明，两种维罗普鸟可能 具有相似的质子门控机制。M2的门控机制已被广泛研究。它涉及TM区域的序列基序，其中两个关键氨基酸投射到孔的中心： 质子传导残基His37和Trp41,被鉴定为质子“门”64。根据用单体p7获得的NMR数据，潜在的等效残基排列在通道的管腔内。 这些残基对应于Gt2a和5a中存在的保守氨基酸残基His17和Tyr/Trp21,但在Gt1a或1b中不存在，其中Ser被发现（图 20 o 一些基于诱变的研究证实了这些残基和Gts之间差异的其他残基的功能相关性20, 65, 66, 67, 68, 69, 70c此外， 基于脂质体的测定法提出了 Phe25作为“门”残基的作用，这些测定法测量丙氨酸替代Phe25所赋予的增强的通透能力71。通 过使用分子动力学模拟，观察到Phe25残基与Ile32 一起形成水渗透的能量屏障37。根据其序列和结构发散，Gt5a p7的六 聚体结构在其假设的阳离子选择性的基础上揭示了另一种门控机制.在这里，两个收缩点将调节离子通量：由Arg35在较宽（C 端）开口处形成的基本环和在窄基部由Asn9和Ile6形成的双环。虽然Gt5ap7的阳离子通道活性尚未得到证实，但在Gt2a的 情况下，氨基酸在等效位置的突变（Arg35;His9）阳离子通道活性降低35。虽然结构数据不能最终验证所提出的Gt5a浇注系 统，但它仍然支持这些残基对p7离子通道活性的功能影响。p7的其他通道结构将被要求说明p7的Phe25和Ile32是作为所有 HCV Gts中的栅极残基，还是仅在一些不同的Gts或亚型中起作用。止匕外，必须考虑到脂质环境会影响p7结构，从而影响其电 生理特性72。事实上，最近的一项研究说明，至少在基于脂质体的测定中，Gt1a的p7的两种不同构象（可能受脂质环境的影 响）可能解释了质子选择性（受a螺旋结构含量的影响）和对大分子的通透性（受p结构含量的影响）73。尽管高含量的p 结构被认为是一种伪影，但这项研究证实了 p7结构的可塑性，并说明可能存在p7的替代构象，从而解释了 p7在HCV感染细 胞中的多种功能。尽管在过去几年中HCV领域取得了很大进展，但我们离全面了解p7维罗蛋白的结构功能关系还很远。这主要是由于 使用不同的HCV Gts和亚型，用于蛋白质纯化和检测的标签的存在，以及应用于不同实验室的实验条件和技术。因此，该领域 的未来研究将需要对p7进行多学科和Gt交叉比拟分析，以区分哪些报道的生物物理和功能性然力通道特性在HCV感染的细胞 中起作用。3. p7通道活性在感染性HCV颗粒的产生和释放中的作用已经提出，p7通过平衡穿过酸性区室膜的质子梯度，在HCV感染的细胞中充当低pH激活通道，类似于IAVM2维罗蛋 白58, 63, 64o质子从酸性区室腔向细胞质的耗散导致此类细胞器的阿卡林化，这是病毒组装的最后步骤和随后的病毒粒子 传出所必需的20, 58, 63o胞质环中保守的双基序受累的突变体无法调节质子梯度，导致人工脂质双层中的孔样和离子通道 活性受损12, 58, 63o此外，含有这种突变的肽显示出膜结合亲和力降低74。尽管其中一些突变与E2-p7-NS2前体的延迟 裂解（例如，Gt2a中的RR33/35和Gt1b和1a中的KR33/35）或E2降解（例如RGR33-35 / AAA）的延迟裂解有关，这可 能是病毒产生受损的原因，但最近的研究现已证实了碱性残基对p7离子通道活性的重要性，并指出p7的质子通道活性与HCV 感染性颗粒的产生之间存在直接联系20, 33, 63o与该观察结果一致的是IAV M2维罗波林局部恢复病毒产生，或者使用转扩 试验通过Gt1 b p7挽救Gt2a p7突变体58, 63。同样，通过使用液泡型质子ATP酶的抑制剂巴菲霉素A1对内体囊泡酸化 的药理学抑制，实现了传染性病毒产生的局部挽救。因此，有人建议在感染病毒粒子分泌之前进行pH依赖性成熟过程。感染性 细胞内颗粒对酸性pH处理高度敏感，而分泌的病毒粒子耐酸58,这一事实进一步强化了这一假设。此外，分泌的病毒颗粒的 酸稳定性似乎以Gt依赖性方式受到p7的影响69。考虑到所有这些数据，p7离子通道可以被视为HCV颗粒pH介导的成熟过 程的调制潜。然而，这种成熟过程是如何调节的，并在出口过程中赋予分泌颗粒“耐酸性”特征尚不清楚。预防HCV包膜糖蛋白 的过早构象改变，让人联想到其他人提出的IAV M2的功能，是一种有吸引力的可能性，值得进一步研究58, 75。最近研究表 明，HCV包膜糖蛋白与载脂蛋白相互作用，载脂蛋白是感染性病毒粒子的组成局部76, 77, 78, 79。由于p7也与包膜糖蛋 白相互作用，因此很容易推测p7也可能影响载脂蛋白掺入HCV颗粒或颗粒成熟，从而有助于病毒的产生和感染。4. 与离子/质子通道无关的p7的功能生化研究证实，p7主要（但不仅限于）与NS2相互作用，NS2被认为是病毒粒子组装的组织者25, 80, 81, 82, 83, 84, 85o这种相互作用不需要p7离子通道活性，而是可能通过p7相互作用招募包膜糖蛋白，这反过来又与NS2关联到HCV 组装的位点。通过这种方式，p7可以调节NS2和核心蛋白的亚细胞定位85, 86o此外，p7/NS2关联已被证明决定了受感染 细胞中核心从LD到ER的重新定位。这种再分配可能是HCV组装所必需的，反映了组装效率，与高感染性滴度相关86。除 了这些p7相互作用外，最近一项关于HCV蛋白相互作用网络的研窕还指出，核心和两种包膜糖蛋白E1和E2是p7的新直接 结合伙伴87,而遗传数据说明p7与NS5A之间存在NS2依赖性关联88。通过使用基于表达的系统，发现p7主要局限于ER,但也局限于靠近线粒体的膜和质膜9, 58, 89, 90。然而，由于缺 乏p7特异性抗体，这些研究受到限制，因此，必须使用生理功能不明确的标记版本的p7。直到最近，几个小组还产生了 JFH1 衍生的全长HCV基因组，这些基因组编码双HA标记或嵌合的2a/1b p7蛋白，这些蛋白具有完全的功能。这些研究揭示了 p7 在ER和核周区域的主要定位。止匕外，发现p7与E2糖蛋白以及NS5A、核心、NS2和NS3共定位25, 63。通常认为核衣壳的形成和HCV颗粒的包封是耦合反响。因此，包封中的阻断将阻止核衣壳组装，同时在LD外表上和包 膜糖蛋白在组装位点附近积累核心蛋白的细胞内积聚。与这些假设一致，对p7双基序突变体的研究揭示了细胞内感染性的Gt 依赖性降低，可能是由于病毒RNA不完全掺入到异常积聚在LD外表的核衣壳中，如Jc1 （J6/JFH1） HCV嵌合体所示63, 91, 92, 93.此外，这些未成熟的衣壳缺乏ER膜衍生的病毒包膜。引人注目的是，从感染了 JFH-1别离株突变HCV的细胞中别离 出密度与感染性HCV相当的非感染性核衣壳颗粒，因此可能具有具有E1 /E2糖蛋白的包膜。具有不同组装适应性的病毒之间 的这些明显差异至少局部可以通过p7, NS2和结构蛋白之间的Gt特异性相互作用来解释86。总体而言，这些发现说明p7参与HCV颗粒组装过程中的连续步骤，包括病毒基因组的早期封装，含RNA的核心复合物 从LD重新定位到ER并最终获得膜包膜。这些步骤缺乏以赋予JFH-1别离株的病毒颗粒传染性的事实认为，p7介导的颗粒成 熟是产生和释放传染性HCV病毒粒子的后期和限速步骤。在这方面，p7将具有两个功能；首先，通过介导包膜糖蛋白和NS2 之间的相互作用（这反过来又通过与NS3的关联'招募”复制品）来参与病毒颗粒的包封;其次，通过介导或调节HCV颗粒的细 胞内成熟步骤，使它们具有pH抗性和完全传染性。5. HCV p7通道作为抗病毒药物靶点据报道，许多化合物对HCVp7通道活性具有抑制作用。这些包括IAVM2viroporin的经典抑制剂，例如金刚烷，金刚烷 胺和金刚烷胺，亚氨基糖衍生物（例如，N-壬基脱氧诺吉霉素，A/N-DNJ）,六甲基阿米洛利（HMA）和GSK-2,葛兰素史克- 史密斯-Kline开发的特异性化合物。它们对体%p7的离子通道/孔样活性的影响已通过使用在人工脂质双层中重构的p7的电 生理学记录技术或基于脂质体的测定法进行了评估13, 14, 39, 58, 59, 68, 94。总体而言，这些化合物根据HCV Gt和亚 型抑制p7,并具有各种效率。例如，与金刚烷胺（分别为Kd 1.32和7.41）相比，金刚烷胺与Gt1b和Gt2a的p7 （分别为Kd 0.251和0.617）的理论结合亲和力较高，这反映在其较低的Kd值上，并解释了其抑制效力的增加71。这些化合物中的几种也已在受感染的细胞中进行了研究，发现它们能够以Gt依赖性方式将病毒产生减少多达10倍20, 39, 95o这种抑制性表型的特征是HCV颗粒分泌减少，但细胞内病毒粒子的感染性受损20, 24, 71。对于大多数这些化合 物，负责减少病毒分泌的机制知之甚少。在亚氨基糖衍生物A/N-DNJ的情况下，抑制a葡萄糖昔酶，导致糖基化模式和HCV E2 总水平的改变，可能是增加p7直接结合和抑制的机制13, 24。然而，最近有报道称，生产性HCV释放与抑制由p7介导的含 病毒区室的酸化有关，并且该过程被金刚烷和HMA阻断58。与p7离子通道在HCV早期感染步骤中的作用一致，已经描述了金刚烷类，GSK-2和A/N-DNJ的Gt依赖性病毒进入阻 滞24。然而，观察到无活性p7突变体不影响释放的HCV颗粒的特异性感染性与这种p7抑制机制不一致20。此外，p7离子 通道活性不太可能参与HCV的细胞间传播，这是从p7拮抗剂对这种病毒传播方式的有限抑制作用中推断出来的24, 96o因 此，p7主要被认为是阻止病毒释放的有吸引力的目标。利用p7七聚体（Gt1bJ4）的3D结构，在基于计算机的p7配体筛选中，对潜在的p7配体进行了筛选，从而鉴定出一系 列对J4/JFH-1病毒嵌合体具有改善抑制作用的化合物39。这些化合物与p7中的外周变构位点结合,预测为金刚烷胺结合口袋。 一致地，含有苯丙氨酸替代p7中Leu20的金刚烷胺耐药病毒的分泌被这些新药抑制。其他令人鼓舞的数据说明，在卑微摩尔 范围内的化合物浓度剂量足以抑制来自几种非1b Gts的嵌合病毒的产生。到目前为止，尚未报道对这些新型p7抑制剂的耐药 性。p7抑制剂的临床开发取得了有限的成功。与金刚烷胺在HCV细胞培养系统中的抗病毒疗效非常低20一致，与标准治疗 （peg-IFNo力口利巴韦林）相比，未发现基于金刚烷胺的联合治疗的临床益处97。到目前为止，金刚烷胺/peglFNa闲巴韦林三 联疗法唯一有希望的效果是早期病毒血症的降低，但这种效果没有伴有持续的病毒学反响98。也许已经报道了 BITRO开发的 阿米洛利衍生物BIT225对p7抑制剂最有效的效果，除HCV p7外，还靶向体外和感染细胞中鼠疫病毒BVDV的HIV viroporin Vpu和p799, 100。BIT225对HCV p7通道的抑制作用已通过对接测定得到提示，并在脂质双层系统中得到证实，但尚未报 告HCV感染背景下的数据100, 101。这些对接研究显示，阿米洛利衍生物似乎与六聚体p7 Gt1a结合效果最正确，与其他p7 抑制剂如金刚烷胺（-7.9千卡/摩尔）和A/N-DNJ （-6.5千卡/摩尔）相比,BIT225的结合能最低（-25.5千卡/摩尔）101。一 项针对24例初次Gt1 HCV患者的早期临床试验（lb/lla期）显示，在BIT225联合IFN。/利巴韦林联合治疗12周后，病 毒载量显著降低（： biotron 2011）。目前，一项2a/2期临床试验正在进行中，初步结果说明对几种HCV Gts具有活性，包括难以治疗的Gt3a和1a （ biotron .au;2015年5月29日）。此外，BIT225可能适用于治疗HCV/HIV合并感染患者。然而，鉴于靶向NS3 丝氨酸型蛋白酶，NS5A复制因子和NS5B RNA依赖性RNA聚合酶的可用抑制剂的效力很高，p7抑制剂的临床利基尚不清楚。选择性抗病毒治疗的一个限制是耐药性，不幸的是，p7抑制剂也不例外。在金刚烷类药物的病例中，在对三联疗法无反 应的患者中发现p7中Leu20Phe突变，赋予金刚烷胺耐药性71。如果亚氨基糖衍生物破坏了 p7寡聚，从而破坏了通道活性, 那么HCV Gt 3a中存在但Gt1b中不存在的Phe25Ala多态性通过稳定p7通道介导A/N-DNJ抗性71。6. 结论随着HCV高效且完全宽松的细胞培养模型的出现，我们对p7在病毒生命周期中的作用的了解已经大大增加。很明显， 这种蛋白质在感染性HCV颗粒的组装和释放中起着重要作用。这似乎是由p7的两个互补函数介导的。首先，通过与包膜糖蛋 白和NS2结合，它参与病毒颗粒包封的协调，其次，通过形成通道，它似乎是病毒粒子分泌所需的细胞内成熟步骤所必需的， 并使其具有pH抗性。最近通过冷冻电镜和NMR对p7同型六聚体结构的解析揭示了 p7亚基的意外排列，这与典型的发夹构象 不同，并提出了一种新的门控机制。虽然这些都是显著的成就，但仍有重要问题有待解决。例如，p7离子通道结构多样性的基 础是什么？ p7如何促进病毒释放？ p7如何使细胞内HCV颗粒耐pH?虽然从临床角度来看，慢性丙型肝炎可能被视为一个己解 决的问题，但对HCV的研究将继续为复杂的病毒-宿主细胞相互作用提供重要的见解。在这方而，对HCV p7的研究将有助 于揭示许多其他病毒也使用的病毒蛋白如何促进传染性后代颗粒的产生并最终促进致病性。