分子生物学实验方法与步骤(1)资料.doc

Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。分子生物学实验方法与步骤(1)-DNA分子的限制性内切酶消化限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50l体积1小时内完全切开1g噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（buffer，10×、5×）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2.20l体积反应体系如下：DNA0.2-1g10×酶切buffer2.0l限制性内切酶1-2u（单位）加ddH2O至20l   限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为37水浴消化1hr。3.用于回收酶切片段时，反应总体积可达50-200l，各反应组分需相应增加。4.多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。5.酶切结束时，加入0.5MEDTA（pH8.0）使终浓度达10mM，以终止反应。或将反应管在65水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。6.如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：终止反应后，加入0.6体积的5M乙酸铵（或1/10体积3MNaAc）和2倍体积无水乙醇，在冰上放置5min，然后于4离心12000g×5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中（pH7.6）。7.如要纯化消化后的DNA，可用等体积酚/氯仿（11）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。二、电泳检测取质粒酶切产物适量，加适当loadingbuffer混匀上样，以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体（如有）作对照，采用1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动，至合适位置取出置紫外灯下检测，摄片。三、注意事项1.浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。2.购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20冰箱。3.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。4.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。5.注意星号酶切活力。DNA片段回收与纯化质粒、噬菌体等经酶切，电泳；PCR产物经电泳后，常常需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记等。DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒供应。一、冻融法1.紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条（小于0.6g）捣碎，置于1.5ml离心管中；2.加入等体积的Tris-HCl饱和酚（pH7.6），振荡混匀；3.-20放置5-10min；4.4离心10000g×5min，上层液转移置另一离心管中；5.加入1/4体积H2O于含胶的离心管中，振荡混匀；6.-20，放置5-10min；7.4离心10000g×5min，合并上清液；8.用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清；9.加入1/10体积3MNaAc（pH5.2）、2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀；10.-20，静置30min；11.4离心13000g×10min，弃上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；12.加适量H2O或TE溶解沉淀。二、DNA回收试剂盒（QIAquickGelExtractionKitProtocol）1.  紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。2.  加入BufferQG（每100mg凝胶加BufferQG300l），置50水浴10min。3.  若回收片段小于500bp或大于4kb，则需加入异丙醇（每100mg凝胶加异丙醇100l），混匀。4.  将小柱放在2ml收集管上，将上述溶液加于柱上。5.  4离心13000g×1min，弃去收集管中液体。6.  加入500lBufferQG于柱上，4离心13000g×1min，弃去收集管中液体。7.  加入750lBufferPE于柱上，4离心13000g×1min，弃去收集管中液体。8.  4离心13000g×1min。弃去收集管。9.  将柱放于一新1.5ml离心管上，加50lEB于柱上。放置1min，4离心13000g×1min。10.取5l回收DNA电泳检测。三、注意事项紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。mRNA差别显示技术mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（DifferentialDisplayofreverseTranscriptionalPCR）简称为ddRT-PCR。它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。差别基因表达（differentialgeneexpress）是细胞分化的基础。mRNA差别显示技术正是对组织特异性表达的基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。该方法的基本原理是首先选取不同的组织样品或不同发育阶段的同一组织样品或同一组织样品经不同药物处理诱导的样品，经总RNA提取后，进行mRNA反转录合成cDNA。此cDNA的合成是采用Oligo（dT）12MN为引物，其中M为A，C，G中的任意一种，N为A，C，G或T中的任意一种，所以共有12种oligo（dT）12MN引物，其中M称为锚定碱基，起增大引物Tm值的作用，N称为分类碱基，对反转录进行分类。用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，从而使反转录的cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类（目前较为流行的方法是进行4种归类，即M为简并碱基的形式存在），在此基础上对每一类cDNA进行随机引物和反转录引物PCR扩增，通过对组织样品的同一类cDNA的PCR选择性扩增产物凝胶电泳分析，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上组织特异性的表达。如此众多种类的mRNA反转录产物经PCR选择扩增后其类型依然为数众多，很难用电泳系统加以快速准确地分离。因而需要对反转录产物cDNA进行归类处理，减轻不同PCR产物电泳分离的难度，提高分离的准确率。（见示意图）一、实验流程：对照组的总RNA提取mRNA完整性鉴定实验组的总RNA提取mRNA完整性鉴定锚定引物逆转录成cDNA锚定引物逆转录成cDNA采用随机引物和逆转录引物进行选择性PCR扩增采用随机引物和逆转录引物进行选择性PCR扩增扩增产物进行凝胶电泳分析ß差异性条带的回收与第二次扩增ßNorthern杂交，Southern杂交再次确定差异性条带的真实性ß差异性条带的克隆、测序、分析，DNA及氨基酸序列联机检索ß以差异性条带为探针克隆出基因组文库中的基因序列及cDNA文库中的全长cDNA序列ß基因功能的鉴定：knockoutdominantnegativemutation原核系统或真核系统中的表达翻译。抗体的制备，细胞内的定位，抗体抑活等等。onehybrid判断出该基因的“启动”基因。twohybrid判断出该基因的产物的作用途径。这里以CLONTECH公司生产的DeltaTMDifferentialDisplayKit为例，介绍具体的实验步骤。该试剂盒中含有10种任意引物和9种Oligo(dT)引物。操作步骤1总RNA的提取（见Northern杂交）2第一链合成：(1)总RNA样品2g；cDNA合成引物1l；加ddH2O补至5l。将管标号为1A,2A,PCA等。PC为阳性对照。(2)混匀后稍离心。(3）70孵育3min，冰浴2min后稍离心。(4）准备dNTPmix(以5管为例)每管5管5×第一链缓冲液2l10ldNTPmix（各5mM）2l10lMMLV逆转录酶（200u/l）1l5l总体积5l25l(5）每管加入5l，混匀后稍离心。(6）42孵育1hr。(7）7510min终止反应后置冰上，稍离心。(8)将2l反应液分别转至新管中（新管标号为1B,2B,PCB等）。(9)将78lddH2O分别加入B管中,混匀。(10)将72lddH2O分别加入A管中，混匀。(11）将所有cDNA稀释液-20保存待用。3dd-PCR:以引物P1,T9为例说明（0.5mlPCR管,1代表对照组,2代表实验组）管号cDNA样品引物(1)1AP1,T9(2)1BP1,T9(3)2AP1,T9(4)2BP1,T9(5)H2OP1,T9(6)RNA1P1,T9(7)RNA2P1,T9以下为阳性对照反应体系(8)PC1AP10,T8(9)PC1BP10,T8(10)PC2AP10,T8(11)PC2BP10,T8(12)H2OP10,T8(13)PCRNA1P10,T8(14)PCRNA2P10,T8在PCR管中加入:cDNA样品1lP引物1lT引物1l准备其它PCR试剂的混合液:(在另一管中加入)成分每管(l)所需管数(n=14)10×buffer2.02nddH2O14.014ndNTPmix0.20.2n-32PdATP0.40.4nTaq酶0.40.4n终体积17.017n混匀后稍离心。将17lPCR混合液加入各反应管，则各管总体积为20l。开始PCR扩增。PCR循环参数：在GeneAmpPCRSystems2400&9600扩增仪上执行以下程序：945min1cycles405min685min9430sec2cycles4030sec685min9420sec23cycles4030sec682min1cycles687min。反应结束后置-20保存备用。4电泳和放射自显影(1）配制6%变性聚丙烯酰胺凝胶，灌注测序板。(2）预电泳30min。(3）每个dd-PCR反应取出5l于一新微量离心管中，加5lloadingbuffer，混匀，离心，置94变性2min。立即置冰浴。(4)停止预电泳，冲洗加样孔。(5)加样2l。70W电泳2.75hr至二甲苯青到达胶的底部。(6）下胶：（同测序胶）(7）干胶：在胶表面覆上保鲜膜，80干胶30min。(8)X光片-70曝光过夜或更长时间(根据射线强度而定)。图2-6显示了dd-PCR放射自显影的X光片5差异条带回收再扩增(1）X光片经D72显影、酸性定影液定影后，水洗晾干。置X光片灯上比较寻找差异条带。用一次性手术刀片在胶上切割差异条带，加ddH2O20l，沸水浴15min，离心取上清为模板。(3)以原引物扩增：回收DNA7l10×PCRbuffer5l5mMdNTPmix0.5l引物P2.5l引物T2.5lTaq酶2l加ddH2O至总体积为50l执行PCR程序:933min；931min601min682min，20次循环；685min。取PCR产物10l2%琼脂糖电泳检测。PCR产物乙醇沉淀，10lddH2O溶解。6以PCR产物为探针，标记后进行Northern杂交，证实基因的真实性。7PCR产物的TA克隆。8DNA序列测定。9检索分析。mRNA的分离与纯化真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5端帽子结构（m7G）和3端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3端存在20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。   mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA3末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA一、试剂准备13M醋酸钠（pH5.2）20.1MNaOH31×上样缓冲液：20mMTris-HCl(pH7.6)；0.5MNaCl；1MEDTA（pH8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH7.6)、NaCl、EDTA（pH8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65时，加入经65温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%。4洗脱缓冲液：10mMTris-HCl(pH7.6)；1mMEDTA(pH8.0)；0.05%SDS5无水乙醇、70%乙醇6DEPC二、操作步骤1将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。2用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPCH2O洗柱。3使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。4将RNA溶解于DEPCH2O中，在65中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。5将所有流出液于65加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。6用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。7用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。8OD260测定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10体积3MNaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20放置30min。94离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。注意：此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到。4离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。10.用适量的DEPCH2O溶解RNA。三、注意事项1整个实验过程必须防止Rnase的污染。2步骤（4）中将RNA溶液置65中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNAPoly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。3十二烷基肌氨酸钠盐在18以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18最好用LiCl替代NaCl。4寡聚（dT）-纤维素柱可在4贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌ddH2O、上样缓冲液洗柱。5一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5gPoly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。NorthernBlot继分析DNA的Southern杂交方法出现后，1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA或含polyA尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与Southern相对应而定名的Northern杂交技术。这一技术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mRNA最为常用的经典方法。与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标RNA的丰度）。但与Soughern杂交不同的是，总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳；此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。一、试剂准备1.   0.5MEDTA:EDTA16.61g加ddH2O至80ml,调pH至8.0,定容至100ml。250mMNaAc:NaAc3.4g加ddH2O至500ml,加DEPC0.5ml,振荡,37过夜，高压灭菌。35×甲醛凝胶电泳缓冲液:MOPS3-(N-玛琳代)丙磺酸10.3g加50mMNaAc400ml,用2NNaOH调pH至7.0,再加入0.5MEDTA10ml,加DEPCH2O至500ml。无菌抽滤，室温避光保存。420×SSC:NaCl175.3g、柠檬酸三钠88.2g，加ddH2O至800ml，用2NNaOH调pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC处理、高压灭菌。5.6×SSC:20×SSC300ml加ddH2O至1000ml。DEPC处理,高压灭菌。650×Denhardt:聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加ddH2O至50ml,无菌抽滤、分装。71MNa2HPO4:Na2HPO4·12H2O35.81g,加ddH2O至100ml。8.1MNaH2PO4:NaH2PO4·2H2O15.6g,加ddH2O至100ml。9.0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.6):Na2HPO435.2ml加NaH2PO464.8ml。10.STE缓冲液:1MTris-HCl(pH8.0)2.5ml,0.5MEDTA,0.5ml,5MNaCl5ml，加ddH2O至250ml。11.预杂交液:20×SSC5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt4ml,1M磷酸钠缓冲液0.2ml（pH6.6）,10%SDS1ml,总体积20ml。临用前加入变性鲑鱼精DNA（10mg/ml）,使终浓度为4l/ml。12.DEPCH2O:1000mlddH2O中加入DEPC1ml，充分振荡，37过夜，高压灭菌。二、操作步骤1.总RNA提取：见相关内容。2. 变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入DEPCH2O12.4ml，加热熔化，于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min。3.样品制备：取总RNA4.5l(约20-30g)，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0l、37%甲醛3.6l、甲酰胺10l，65温育15min、冰浴5min。加入EB（1g/l）1l、上样缓冲液2l。4.电泳：上样，50V电泳（电泳时间约2hr左右）。电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察RNA的完整性，记录18S、28S条带的位置（离加样孔的距离）。5.   将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜：(1)按胶块大小剪取膜一张，用DEPC水中浸湿后，置于20×SSC中浸泡1hr。剪去膜一角。(2)将胶块切去一角，并在20×SSC浸泡15min×2次。(3)用长和宽均大于凝胶的一块有机玻璃板作为平台，将其放入大的干烤皿上，上面放一张Whatman3MM滤纸，倒入20×SSC使液面略低于平台表面，当平台上方的3MM滤纸湿透后，用玻棒赶出所有气泡。(4)将凝胶翻转后置于平台上湿润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。(5)用Parafilm膜围绕凝胶四周，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至胶上方的纸巾。(6)在凝胶上方放置预先已浸湿的尼龙膜，排除膜与凝胶之间的气泡。(7)将二张已湿润的、与凝胶大小相同的3MM滤纸置于膜的上方，排除滤纸与滤膜之间的气泡。(8)将一叠（5-8cm厚）略小于3MM滤纸的纸巾置于3MM滤纸的上方，并在纸巾上方放一块玻璃，然后用一个重约500克的重物压在玻璃板上。其目的是建立液体自液池经凝胶向膜上行流路，以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在膜上。6.使上述RNA转移持续进行15hr左右。在转膜过程中，当纸巾浸湿后，应更换新的纸巾。7.转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸。将膜在6×SSC中浸泡5min，以去除膜上残留的凝胶。8.将凝胶置紫外灯下，观察胶块上有无残留的RNA。9.膜置80，真空干烤1-2hr。烤干后的膜用塑料袋密封，4保存备用。10.探针标记(Prime-a-GeneLabelingSystem,Promega公司)：（1） 取模板DNA25ng于0.5ml离心管中，95-100变性5min，冰浴5min。（2） dNTPmix的制备:取dGTP1l、dATP1l、dTTP1l混匀。（3）将下列反应成份混合，加入上述微量离心管中：dNTPmix2.0lBSA(10mg/ml)2.0l5×buffer10.0lKlenow酶(5u/l)1.0l-32P-dCTP5.0l加入适量ddH2O使反应总体积达50l，轻轻混匀。室温下反应1hr。11.预杂交：将膜的反面紧贴杂交瓶，加入预杂交液5ml，42预杂交3hr。12.杂交：将变性的探针（95-100变性5min，冰浴5min）加入到预杂交液中，42杂交16hr。13.洗膜：(1)倾去杂交液。(2)2×SSC/0.1%SDS室温洗15min。(3)0.2×SSC/0.1%SDS，55洗15min×2次。14.压片：将膜用ddH2O漂洗片刻，用滤纸吸去膜上水份。用薄型塑料纸将膜包好，置于暗盒中，在暗室中压上X光片。暗盒置-70放射自显影37天左右。三、注意事项1操作时必须仔细、小心，严格按同位素操作规程进行，以防止同位素污染。2必要时，可采用SephadesG-50柱层析法纯化标记的探针（见本节附录），以去除标记反应中未结合的（游离的）核苷酸。3膜的重复使用：结合了待测RNA的膜与探针杂交后，可经碱或热变性方法将探针洗脱，膜可反复使用与其它探针杂交。方法如下：杂交的膜（注意：杂交过的膜在保存过程中不能干燥，否则探针将会与膜形成不可逆的结合）置1000.5%SDS中煮沸3min，自然冷却至室温后，将膜放入双蒸水中漂洗2-3遍。取出膜，用滤纸吸去膜表面的水份。将膜直接进行另一种探针的杂交或用保鲜膜包好，室温下真空保存。PCR产物的克隆PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。   平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoRV或SmaI切成平头；PCR产物纯化后，可以在22用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的35外切酶活性和53的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfuDNA聚合酶或NewEnglandBiolabs公司的VentDNA聚合酶，这两种酶有53校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG8000，也只能很有限地提高效率。   粘头连接也可以大致分为两类，一类粘头连接是用某种方法，在载体和PCR产物上产生长的可互补的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5端加入一段某种限制酶的识别序列。如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列，就可以做到定向连接。另一类利用部分PCR产物3端带有一个凸出的dAMP的特性，构建3端带有凸出的dTMP的载体。一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，在70或72下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用TaqDNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理12小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。如果使用ddTTP，效果会更好。这种方法一般称为加T/A法克隆，比平头连接效率高50100倍。一、PCR产物的TA克隆1.TA克隆构建原理：TA克隆系统由Invitrogen公司（SanDiego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。2.操作步骤连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。10l体积反应体系如下：取T载体1l(50ng)，加入等摩尔数PCR产物。 加入含ATP的10×Buffer1l，T4DNA连接酶合适单位，用ddH2O补足至10l。稍加离心，通常为14-16水浴连接8-14hr，或4过夜。转染，蓝白斑筛选同前。二、注意事项1.要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。2.PCR产物在TA克隆前要通过纯化。3.在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。RNA操作中的一般要求在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。   在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。   外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。一、防止RNA酶污染的措施1.  所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。2.  塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.  有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4.  配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。5.  操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.  设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。RNA酶保护试验   RNA酶保护试验(RNaseProtectionAssay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：1检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。2由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。3由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。4步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。5RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。6一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。7检测分子长度可以任意设置，灵活性大。   RPA的缺点是需要同位素标记探针。一、试剂准备1GACUPOOL：取100mMATP、CTP、GTP各2.78l、100mMUTP0.06l，加DEPCH2O至100l。2.   杂交缓冲液:PIPES0.134g、0.5MEDTA（pH8.0）20l、5MNaCl0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPCH2O至10ml。3.   RNase消化液：5MNaCl120l、1MTris-HCl(pH7.4)20l、0.5MEDTA（pH8.0）20l、RNaseA(10mg/ml)8l、RNaseT1(250U/l)1l，加DEPCH2O至2ml二、操作步骤1反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。（1）设计含T7启动子的PCR引物由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5-端要含T7启动子序列:T7启动子序列为：5-TAATACGACTCACTATAGGG引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：上游引物下游引物T7启动子序列下游引物（2）PCR先用上游引物和下游引物进行PCR，再以PCR产物为模板,用上游引物和下游引物-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。（3）探针合成标记与纯化在0.5ml离心管中加入下列试剂：RNasin（40U/l）0.5lGACUPOOLGAC（含GTP、CTP、ATP各2.75mM,UTP61M）2l-32PUTP(10Ci/l)2.5lDTT(二硫苏糖醇，0.1M)1l5×转录buffer2l模板（50ng/l）1lT7RNA聚合酶(15U)1l混合后，短暂离心，37OC保温1hr。加入DNase（10U/l）1l,37OC15min,然后75OC10min以灭活DNAse和T7RNA聚合酶。加入：饱和酚50l氯仿50l酵母tRNA（2g/l）4lDEPCH2O100l室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5ml离心管中，加入100l氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml离心管中，再加入3MNaAc10l、预冷无水乙醇250l，混匀后，-20OC静置30min。4OC离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100l洗涤，4OC离心13500g×2min,弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50l杂交缓冲液溶解沉淀，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。（参见本节电泳步骤）。2杂交（1）       RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1g/l。（2）取8lRNA加入1-3l探针（根据探针检测结果调整）于0.5ml离心管中。（2）       80OC保温2min，然后40-45OC下杂交12-18hr。3.消化(1)杂交管于37OC保温15min，加入RNase消化液，37OC保温30min。(2)加入10%SDS10l、10g/l蛋白酶K20l，混匀，37OC保温10min。(3)加入65l饱和酚和65l氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。(4)转移上层液到另一0.5离心管中，加入10l酵母tRNA和3MNaAc15l，再加入200l异丙醇，混匀后，置-20OC30min，4OC离心,135000g×10min。(5)  弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8l上样缓冲液溶解沉淀。4、电泳与放射自显影（1）配制凝胶：(50ml)40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1）6.25ml5×TBE10ml尿素24g加H2O至50ml溶解后加入25%过硫酸胺50l，TEMED50l，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。（2）预电泳以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50OC。待胶板温度达50OC时，暂停电泳，准备加样。（3）加样将已溶解在加样缓冲液中的样品80OC加热2min，立即加