微生物工程工艺学nnd教学内容.doc

Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。微生物工程工艺学nnd-绪论菌种的来源发酵培养基种子的扩大培养发酵动力学基本概念氧的供需对发酵的影响发酵过程控制（代谢控制，参数检测，PH，温度，染菌，泡沫）工程菌动物细胞培养1、 举出几例微生物大规模表达的产品,及其产生菌的特点？A.蛋白酶表达产物一般分泌至胞外，能利用廉价的氮源，生长温度较高，生长速度快,纯化、分离及分析快速；安全性高，得到FDA的批准的菌种。B.单细胞蛋白生长迅速，营养要求不高，易培养，能利用廉价的培养基或生产废物。适合大规模工业化生产，产量高，质量好。安全性高，得到FDA的批准的菌种。C.不饱和脂肪酸生长温度较低，安全性高，能利用廉价的碳源，不饱和脂肪酸含量高D.抗生素生产性能稳定，产量高，不产色素，能利用廉价原料F.氨基酸   代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单2、工业化菌种的要求？A能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物B有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强C.遗传性能要相对稳定D.不易感染它种微生物或噬菌体E.产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）F.生产特性要符合工艺要求3、讨论：生产抗生素的微生物能不能生产氨基酸？不能。像这种工业生产的产品都是对应的特定微生物来生产的，有的甚至基因修饰促进产量的提高，微生物一般不能通用4、讨论：微生物（包括动、植物）可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产，对于某一种特定的产品，为何只有特定的微生物才具有大量表达的潜力？在不同的环境条件下，微生物细胞对遗传信息作选择性的表达，实现代谢的自动调节。代谢的协调能保证在任何特定时刻、特定的细胞空间，只合成必要的酶系（参与代谢的多种酶）和刚够用的酶量。一旦特定物质的合成达到足够的量，与这些物质合成有关的酶就不再合成了。并且，已合成的酶的活力受到许多调节机制的控制，以确保新陈代谢全面协调，、为细胞的经济运行提供保证。因此，细胞固有的生产关系支持细胞自身的增殖（生产细胞），不支持（人的）目的产物的过量生产（生产特定的初级代谢产物）。而工业化生产要求特定表达某种或某类物质，只有正常代谢被打破，代谢协调失常的微生物才能达到要求5、自然界分离微生物的一般操作步骤？样品的采取预处理培养菌落的选择初筛复筛性能的鉴定菌种保藏6、从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集富集？自然界中目的微生物含量很少，非目的微生物种类繁多，进行富集培养，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，使筛选变得可能。7、菌种选育分子改造的目的？防止菌种退化;解决生产实际问题;提高生产能力;提高产品质量;开发新产品.8、以目前的研究水平，土壤中能够培养的微生物大概占总数的多少？什么是16sRNA同源性分析？目前能够培养的微生物不到总数的1%。以16sRNA为靶基因，设计引物，建立pcr扩增体系，再通过DNA测序进行细菌同源性分析。9、什么叫自然选育？自然选育在工艺生产中的意义？自然选育就是不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。自然选育在工业生产上的意义：自然选育可以有效地用于高性能突变株的分离。然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。10、什么是正突变？什么是负突变？什么是结构类似物？生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。11、什么是诱变育种？常用的诱变剂有哪些？诱变育种是指用物理、化学因素诱导植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株，进而培育成新的品种或种质的育种方法。诱变剂有两大类：物理诱变剂和化学诱变剂。常用的物理诱变剂有紫外线、x射线、射线(如Co60等)、等离子、快中子、射线、射线、超声波等。常用的化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等。12、什么是基因的重组？什么是基因的直接进化？二者有何区别？基因的重组：是由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程基因的直接进化：在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。基因的直接进化，可使已有基因获得新的特性，可获得自然界中不存在的基因，可解决许多新的理论和应用问题13、什么是培养基?发酵培养基的特点和要求？培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。培养基能够满足产物最经济的合成。发酵后所形成的副产物尽可能的少。培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。/所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。14、用的碳源有哪些？常用的糖类有哪些，各自有何特点？碳源:糖类（淀粉、葡萄糖、蔗糖等）、油脂（动、植物油）、有机酸（琥珀酸、柠檬酸、乳酸、乙酸等）和低碳醇（甲醇、乙醇等）。葡萄糖，所有的微生物都能利用葡萄糖，但是会引起葡萄糖效应糖蜜，是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。淀粉、糊精，缺点：难利用、发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的-淀粉酶。成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格低，可以解除葡萄糖效应。15、什么是生理性酸性物质？什么是生理性碱性物质？经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的营养物叫生理酸性物质，若菌体代谢后能产生碱性物质的营养物称为生理碱性物质16、常用的无机氮源和有机氮源有哪些？有机氮源在发酵培养基中的作用？常用的有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉、蛋白胨等；常用的无机氮源有氨水、铵盐和硝酸盐。有机氮源在发酵培养基中的作用有：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。诱导某些酶的产生。17、什么是前体？前体添加的方式？前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。前体使用时普遍采用流加的方法。18、什么是生长因子？生长因子的来源？凡是微生物生长不可缺少而细胞自身不能合成的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。有机氮源是这些生长因子的重要来源19、什么是产物促进剂？产物促进剂举例？是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。20、什么是理论转化率？什么是实际转化率？理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小21、培养基设计的一般步骤？1.根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；2.通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；3.当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。22、培养基成分选择考虑的问题？1.菌种的同化能力2.代谢的阻遏和诱导3.合适的C、N比4.pH的要求23、读书报告：举例说明培养基设计的方法与步骤？目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。24、讨论：培养基优化在发酵优化控制中的作用与地位？发酵优化控制分两个阶段：第一阶段控制菌体的生长，目的是使长好的菌体能处在最佳的产物合成状态。培养基优化应该保证菌体快速生长，有利于产物合成和分泌的酶系开启，而不利于产物合成酶系的关闭，处于最佳的产物合成状态，并且副产物合成和分泌的酶系尽可能的少开启第二阶段控控制产物的合成。该阶段，培养基优化应使产物合成能较长时间保持在最大合成速度。副产物的的合成速率尽可能小。25、什么是种子的扩大培养？种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。26、种子扩大培养的目的与要求？种子扩培的目的：接种量的需要，菌种的驯化，缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：总量及浓度能满足要求，生理状况稳定，个体与群体，活力强，移种至发酵后，能够迅速生长，无杂菌污染27、种子扩大培养的一般步骤？休眠孢子母斜面活化摇瓶种子或茄子瓶斜面或固体培养基孢子一级种子罐二级种子罐发酵罐28、在大规模发酵的种子制备过程中，实验室阶段和生产车间阶段在培养基和培养物选择上各有何特点？实验室阶段培养物选择的原则：种子能扩培到一定的量和质，获得一定数量和质量的孢子/菌体。培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。生产车间阶段培养物的选择原则最终一般都是获得一定数量的菌丝体。培养基选择首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本二是驯化29、什么是接种量？对于细菌、放线菌及霉菌常用的接种量是多少？接种量移入种子的体积/接种后培养液的体积细菌5、放线菌20霉菌1030、什么时发酵级数？发酵级数对发酵有何影响，影响发酵级数的因素有哪些？一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数发酵级数对发酵影响：1.种子级数少，可简化工艺和控制，减少染菌机会2.种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会3.级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。4.在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面影响发酵级数的因素：(1)菌种生长特性,孢子发芽及菌体繁殖速度;(2)发酵规模.（3）工艺要求.（4）接种量的影响.31、什么是种龄？事宜种龄确定的依据？种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。32、读书报告：结合具体的产品理解种子质量控制的方法，以及认识种子质量对发酵的影响？影响斜面种子质量的因素:(1)原材料质量，水质，培养基pH.(2)灭菌条件，(3)接种量，(4)温度，通风、(5)培养时间(6)有害气体或挥发物(7)冷藏条件种子质量好：1.缩短发酵时间、保证生产水平.2.无杂菌污染.3移种至发酵后，能够迅速生长.4.泡末产生少.5.产物生成速率大.6.副产物合成少.7.对下游分离纯化有利33、接种、倒种、双种？接种：接入种子罐后直接移种到发酵罐。双种：两个种子罐种子接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。34、么是菌体的生长比速？产物的形成比速？基质的消耗比速？维持消耗？菌体的比生长速率：单位重量的菌体瞬时增量=（dx/dt）/x；单位为1/h，其中x菌体浓度（g/L）产物的形成比速：单位时间内单位菌体形成产物（菌体）的量=（dp/dt）/x,；单位为1/h，其中p产物浓度（g/L）基质的比消耗速率:单位时间内单位菌体消耗基质的量 =（ds/dt）/x；单位为1/h，其中s底物浓度（g/L）35、什么是Monod方程其使用条件如何？各参数的意义与求解？当培养基中不存在抑制细胞生长的物质时，细胞的生长速率与基质浓度关系（Monod方程式）如下：=maxS/（Ks+S）：菌体的生长比速.S：限制性基质浓度.Ks：半饱和常数.max:最大比生长速度Monod方程的参数求解(双倒数法)：将Monod方程取倒数可得：1/=1/max+Ks/maxS或S/=S/max+Ks/max这样通过测定不同限制性基质浓度下，微生物的比生长速度，就可以通过回归分析计算出Monod方程的两个参数。36、什么是初级代谢产物？什么是次级代谢产物？初级代谢产物是指微生物产生的，生长和繁殖所必需的物质，如蛋白质、核酸等。次级代谢产物是指由微生物产生的，与微生物生长、繁殖无关的一类物质。37、什么是一类发酵？二类发酵？三类发酵？一类发酵：产物形成与底物利用直接相关，为生长联系型，又称简单发酵型，产物直接由碳源代谢而来,产物生成速度的变化与微生物对碳源利用速度的变化是平行的，产物生成与微生物的生长也是平行的。在这些发酵过程中，菌体的生长、基质的消耗、产物的生成三个速度都有一个高峰，三高峰几乎同时出现。二类发酵：产物形成与底物利用间接相关，为部分生长联系型，又称中间发酵型，产物不是碳源的直接氧化产物，而是菌体代谢的主流产物。它的特点是在发酵的第一时期碳源大量消耗用于菌体的迅速增长而产物的形成很少或全无，第二时期碳源大量消耗用于产物的高速合成及菌体的生长。三类发酵：产物形成与底物利用不相关，为非生长联系型，又称复杂发酵型，产物的生成在菌体生长和基质消耗完以后才开始，与菌体生长不相关，与基质消耗无直接关系，所形成的产物为次级代谢产物。38、什么是连续培养？什么是连续培养的稀释率？由于新鲜培养基不断补充，所以不会发生营养物的枯竭，另一方面，发酵液不断取出，发酵罐内的微生物始终处于旺盛的指数生长期，罐内细胞浓度X、比生长速率、以及t,pH等都保持恒定。稀释率(D):补料速度与反应器体积的比值(h-1)39、解释连续培养富集微生物的原理？菌的积累速率=生长速率-流出速率,调节培养基,使目的菌的流出速率<生长速率,杂菌的流出速率>生长速率,就起到富集作用40、为何氧容易成为好氧发酵的限制性因素？氧是需氧微生物生长所必需的。氧往往容易成为控制因素，是因为氧在水中的溶解度很低，培养基因含有大量的有机和无机物质，氧的溶解度比水中还要更低。在对数生长期即使发酵液中的氧浓度达到饱和，若此时终止供氧，发酵液中的溶氧可在几分钟内全部耗尽，使溶氧成为控制因素。41、比耗氧速度和呼吸强度的概念？比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：单位时间内单位重量的细胞所消耗的氧气，mmolO2·g菌-1·h-142、临界饱和溶氧浓度、临界溶氧浓度、氧饱和度的概念？临界氧浓度：CCr临界氧浓度：指不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度。氧饱和度：发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度饱和溶氧浓度：在一定温度和压力下，空气中的氧在水中的溶解度。(mol/m3)43、微生物的临界溶氧浓度一般多少，发酵过程中的氧容易不容易满足？一般对于微生物：CCr:115%饱和浓度一般微生物的临界溶氧浓度很小，发酵过程中氧很容易满足。44、影响微生物需氧的因素有哪些？细胞浓度直接影响培养液的摄氧率，在分批发酵中摄氧率变化很大，不同生长阶段需氧不同，对数生长后期达最大值。培养基的成分和浓度显著影响微生物的摄氧率，碳源种类对细胞的需氧量有很大影响，一般葡萄糖的利用速度比其他的糖要快。45、发酵液中的体积氧传递方程？其中Kla的物理意义是什么？以单位体积的液体中所具有的氧的传递面积为a(m2/m3)Nv=KL(C*C）KL以氧浓度为推动力的容积氧传递系数，反映了设备的供氧能力 46、如何调节摇瓶发酵的供氧水平？往复，频率80-120分/次，振幅8cm旋转，偏心距转速250rpm装液量，一般取1/10左右：250ml            15-25ml500ml               30ml750ml               80ml47、如何调节通气搅拌发酵罐的供氧水平？一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好。48、如何测定发酵液中的溶氧浓度，以及发酵罐的Kla?化学法，溶氧电极法。1、亚硫酸盐法（冷膜）2、平衡法rKla=C*-CL3、动态法49、氧的供需研究与反应器设计与放大的关系？发酵过程放大困难的原因就在放大时不可能同时做到几何相似、流体运动学相似和流体动力学相似，当在小试研究时某一个对生产产生影响的重要因素没有被观察到，而这个因素恰恰在放大时成为关键因子时，就会造成整个发酵过程的失败(供氧、混合、剪切）。50、发酵过程中溶氧浓度监控的意义？1、考察工艺控制是否满足要求2、其它异常情况的表征，染菌、噬菌体、设备和操作故障3、间接控制的措施51、微生物生长可分为几个阶段？次级代谢产物在什么阶段开始合成？迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量合成。52、发酵过程的参数检测有什么意义？生产中主要检测到参数有哪些？发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等53、发酵过程糖代谢、氮代谢有什么规律，为什么？糖代谢：特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一氮代谢：氨基酸被利用后产生NH3，pH会上升；尿素被分解成NH3，pH上升。微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。糖的消耗反映产生菌的生长繁殖情况，反映产物合成的活力。菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。54、测定菌的生长采取哪些方法？不同种的微生物各采取什么方法合适？菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。菌形态显微镜观察菌浓测定方法测粘度压缩体积法（离心）静置沉降体积法光密度测定法OD600660适合于细菌、酵母55、抗生素、酶的单位的定义抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（U）来表示在250C下，以最适的底物浓度，最适的缓冲液离子强度，以及最适的pH诸条件下，每分钟能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性单位。56、抗生素效价的测定可采用哪几种方法？1、化学法（1）滴定法（2）比色法（3）测压法2、物理法：许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋光性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或抗生素的含量。3、生物法：生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准57、生物法测定抗生素效价有什么优点？其原理恰好与临床应用的要求相一致，而且此法灵敏度高，需用的检品量较小，这是其它方法不能比的。58、高浓度磷抑制刺激代谢产物合成的机理是什么？磷酸盐影响金霉素的合成。当培养液中的磷酸盐耗竭后才进入生产期。因金霉素的合成没有磷酸化这一步。磷酸盐不是通过磷酸酯酶的负向反馈调节起作用的，而是通过高能荷一直抗生素的合成59、发酵过程为什么要补料？补些什么？在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。发酵基质和缓冲液等。60、补料过多或过少对发酵有什么影响？投料过多造成菌体细胞大量生长，无法稳定的产生发酵产物，导致菌体生产力下降，同时改变发酵液流变学性质。如果补料过少,则使菌体过早进入衰退期，引起菌体衰老和自，同样使生产力下降。61、准确判断发酵终点有什么好处？依据哪些参数来判断？可以提高产物的生产能力和经济效益。经济因素，产品质量因素，特殊因素62、发酵过程中pH会不会发生变化为什么？发酵过程中pH是不断变化的1）糖代谢特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一2）氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降4）某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。5）菌体自溶pH上升，发酵后期，pH上升6）杂菌的污染，pH下降63、pH对发酵的影响表现在哪些方面？（1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻。（2）pH影响微生物细胞膜所带电荷。从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行。（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。（4）pH值影响代谢方向。pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在pH23时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。（5）pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响。64、为了确定发酵的最佳pH,我们该如何实验？配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况65、发酵过程的pH控制可以采取哪些措施？基础培养基调节pH在基础料中加入维持pH的物质通过补料调节pH当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH选择合适的pH调节剂发酵的不同阶段采取不同的pH值66、根据微生物对温度的依赖可分类成哪几类微生物？嗜冷菌适应于0260C生长，嗜温菌适应于15430C生长，嗜热菌适应于37650C生长，嗜高温菌适应于650C以上生长67、微生物对温度要求不同的原理是什么？1、微生物对温度的要求不同与它们的膜结构物理化学性质有密切关系2、蛋白质结构3、蛋白质合成4、合成冷休克蛋白68、发酵过程的温度会不会变化？为什么发酵热是引起发酵过程温度变化的原因69、发酵热的定义发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。70、生物热的大小与哪些因素有关？生物热与发酵类型有关：微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多生物热的大小与呼吸作用强弱有关：在培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。菌体在对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温度。培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，此外培养基营养越丰富，生物热也越大。71、温度对发酵有哪些影响？（1）温度影响反应速率发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。从阿累尼乌斯方程式可以看到  dlnKr/dt=E/RT2（平方）（2）温度影响发酵方向（3）温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。72、发酵过程温度的选择有什么依据？1、根据菌种及生长阶段选择：微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。如四环素生长阶段280C，合成期260C后期再升温；黑曲霉生长370C，产糖化酶32340C。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长30320C，产酸34370C。最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。2、根据培养条件选择温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。3、根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。（如何维持适度的菌体浓度和延长分泌期？适当降低培养温度可以延缓菌体的衰老和维持相当数量的有强生产能力的菌丝体存在）73、染菌对发酵有什么危害，对提炼有什么危害？染菌对发酵的危害：干扰生产菌的正常代谢，降低产量改变pH，降解某些产物污染不同的微生物，不同阶段染菌危害染菌对提炼的危害：过滤困难而大幅度降低过滤收率有机溶剂萃取时发生乳化74、有哪些原因会引起染菌？设备渗漏空气带菌种子带菌灭菌不彻底技术管理不善75、染菌以后应采取什么措施？发酵液必须灭菌后才可放下水道寻找染菌的原因染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒76、为什么会感染噬菌体？感染了噬菌体后应采取哪些措施？产生噬菌体的原因活菌体随意排放，造成噬菌体的感染源建立工厂环境清洁卫生制度感染噬菌体的培养物不得带入菌种室、摇瓶间发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到70800C杀死噬菌体，才可排放。环境用漂白粉消毒选育抗噬菌体的菌种77、泡沫对发酵有哪些有益之处，哪些有害之处？有利之处：气体分散、增加气液接触面积有害之处：降低生产能力；引起原料浪费；影响菌的呼吸；引起染菌78、发酵中泡沫形成的原因是什么？通气搅拌；培养基配比与原料组成；菌种、种子质量和接种量；灭菌质量79、没有外界作用力泡沫是否稳定？在什么条件下泡沫会稳定？不稳定。泡径大小溶液所含助泡物的类型助泡剂浓度起泡液的粘度温度、pH、表面电荷等80、罗氏假说对泡沫稳定的条件作了如何假释？在溶液中，溶解状态的溶质是稳泡剂；不溶状态的溶质，当浸入系数与铺展系数均为正值时即是消泡剂。81、植物油的消泡机理是什么？当其溶入泡沫液,会显著降低该处的表面张力。因为这些物质一般对水的溶解度较小,表面张力的降低仅限于泡沫的局部,而泡沫周围的表面张力几乎没有变化。表面张力降低的部分被强烈地向四周牵引、延伸,最后破裂。82、对消泡剂有哪些要求？（1）在起泡液中不溶或难溶（2）表面张力低于起泡液（3）与起泡液有一定程度的亲和性（4）与起泡液不发生化学反应（5）挥发性小，作用时间长83、常用的消泡剂有哪几类？天然油脂；聚醚类消泡剂；高碳醇；硅酮类84、对于黏稠的发酵液应选怎样的消泡剂，对于较稀的发酵液应选怎样的消泡剂？聚醚类GP型的消泡剂亲水性差，在发泡介质中的溶解度小，所以宜使用在稀薄的发酵液中。聚醚类GPE型消泡剂亲水性较好，在发泡介质中易铺展，消泡能力强，但溶解度也较大，消泡活性维持时间短，因此用在粘稠发酵液中效果较好。85、用于在线检测的传感器必须符合哪些要求？1插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据）2传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好）3传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。（响应快、灵敏）4传感器性能要稳定，受气泡影响小。86、pH电极的指示电极能测定pH值的原理是什么？pH电极实际上是由参比电极与指示电极组成的一个自发电池，该电池的表达式可写为：参比电极溶液X指示电极该电池的参比电极的输出电位恒定，指示电极的输出电位随被测体系中氢离子活度而变化。因此整个自发电池的电动势就是被测体系中氢离子活度的函数。式中E0对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从电位差计的E值可测出pH值。87、pH电极的测量范围有没有限制？使用时应注意哪些问题？在碱性范围内pH>10k降低，测量值偏高在酸性范围内pH<1k升高，测量值偏低1对于蛋白质等粘度较大的测量体系，容易在玻璃电极敏感膜上产生沉积，应设法缩短电极的沉浸时间或设法对电极表面进行清洗，工业测试中常用特制毛刷或超声波清洗电极表面。2强碱或其它对膜材料有腐蚀性的溶液，如氢氟酸溶液会破坏电极3脱水性介质，如无水乙醇、浓硫酸会破坏水合硅胶层88、溶氧电极能够测定液体中溶氧浓度的原理是什么？阴极由铂、银、金等贵金属组成，阳极由铅、锡、铝等组成。当给电极施加极谱电压（0.60.8V负电压）时，溶液中的氧就在阴极被还原。当产生的电流与溶液中氧含量成正比时，此时的电极电流为饱和电流，此时的电压为极谱电压。氧浓度与饱和电流成正比关系。89、影响溶氧电极测定的灵敏度和准确性的因素有哪些？（1） 电极的灵敏度：电极的阴极表面覆盖了半透膜之后，在一定条件下当膜成为氧扩散的控制因素时，氧分压的变化与电流输出的稳态有以下对应式：IS=NFA(pm/dm)pO2（2）温度的影响：氧在溶液中的溶解度随温度上升而下降温度上升使膜穿透系数增加，且氧的内相扩散增加，增加了电化学反应速率。90、哪些仪器可以测定尾气氧和尾气二氧化碳？测定原理是什么？尾气测定仪是不分光红外线二氧化碳测定仪（简称IR），除了单原子气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段（即微米级）具有不同的红外吸收光谱，CO2的红外吸收峰在2.62.9m和4.14.5m之间有两个吸收峰，根据吸收峰值可以求出CO2的所含浓度。热磁氧分析仪测定原理是氧具有高顺磁性。在磁场中，氧气的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少。将排气通入热磁氧分析仪，就可测出排气氧的含量。91、利用基因工程菌生产，有什么优势？常用的宿主菌有哪些？它较筛选菌会有针对性、易繁殖、易培养、有特殊的代谢产物等特点。1、大肠杆菌如果产品翻译后不需要修饰，大肠杆菌是最普遍选用的宿主。优点：人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因操作；大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓度（50g/l）；大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。2、G+细菌枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是G+菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌（excretion）到胞外。它的这一性质对生产非常有吸引力。3、低等真核细胞酵母菌酿酒酵母是第一个被人利用的生物，它的最大生长速率是大肠杆菌的25%，酵母比最大的细菌大，容易从发酵液中回收。酵母有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。4、哺乳动物细胞哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，而且所有转录后处理与在整个动物中相同，在某种情况下可能转录后修饰有些不同但它可提供最接近于天然副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞外。92、利用基因工程菌生产有哪些特点？1基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌往往比未丢失的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。2基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。93、重组菌基因不稳定性的原因有哪些？分离丢失、结构不稳定性宿主细胞调节突变生长速率占优势的不稳定性94、在基因工程菌培养过程中为什么质粒会丢失？分列不稳定：当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离丢失。结构不稳定：某些细胞保留质粒，但质粒结构发生改变，而不产生外源蛋白，减少对细胞的有害影响95、基因工程菌高表达的障碍是什么？外源基因的不稳定，造成表达的下降。高生长速率与高表达之间的矛盾乙酸的产生蛋白的降解96、常规的高密度培养的措施有哪些？（1）选取最佳培养基成分和各成分含量。（2）补料，这是工程菌高密度培养的重要手段之一。（3）提高溶解氧的浓度，提高好氧菌和兼性厌氧菌培养时的溶氧量也是高密度培养的重要手段之一。（4）防止有害代谢产物的生成。97、重组菌与传统微生物在产物表达上有什么区别？98、与大肠杆菌相比酵母作为宿主菌有什么优点？99、重组菌与传统菌在发酵过程控制中有哪些相同之处？100、重组大肠杆菌的诱导因子有哪些？重组酵母的诱导因子有哪些？一、填空（20分，每空1分）1.生长因子如氨基酸和核苷酸产生菌的分离用随机分离方法初筛，其方法主要是通过观察分离菌能否促进的生长，来检出生长因子产生菌。2.紫外线的作用机制主要是形成以改变DNA生物活性，造成菌体变异甚至死亡。3.目前常用的获得目的基因的方法有、和。4.末端产物（终产物）阻遏方式普遍存在于、生物合成途径中。5.按照操纵子模型理论，、和构成操纵子。6.在酵母发酵液中添加，发酵的终产物是。7.通过前体单体聚合的次级代谢物有、和等抗生素。8.抗生素生物合成中的所有甲基化作用均以作为甲基供体。9