最新《食品安全国家标准》GB5009.210-2016-kw1.pdf

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 6食品安全国家标准食品中泛酸的测定2 0 1 6-0 8-3 1发布2 0 1 7-0 3-0 1实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发 布G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 6 前 言 本标准代替G B/T5 0 0 9.2 1 02 0 0 8 食品中泛酸的测定、G B5 4 1 3.1 72 0 1 0 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中泛酸的测定。本标准与G B/T5 0 0 9.2 1 02 0 0 8相比,主要变化如下:标准名称修改为“食品安全国家标准 食品中泛酸的测定”;增加了高效液相色谱方法;修改了食品的前处理方法;增加了检出限和定量限。G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 61 食品安全国家标准食品中泛酸的测定1 范围本标准规定了食品中泛酸和泛酸钙的测定方法。本标准第一法适用于食品中泛酸的测定,第二法适用于营养素补充剂类保健食品和配方食品中泛酸(钙)的测定。第一法 微生物法2 原理泛酸是植物乳杆菌L a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m(AT C C8 0 1 4)生长所必需的营养素,在一定控制条件下,将植物乳杆菌液接种至含有试样液的培养液中,培养一定时间后测定透光率(或吸光度值),根据泛酸含量与透光率(或吸光度值)的标准曲线计算出试样中泛酸的含量。3 试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6 6 8 2规定的二级水。3.1 试剂3.1.1 盐酸(HC l)。3.1.2 冰乙酸(C2H4O2)。3.1.3 氢氧化钠(N a OH)。3.1.4 氯化钠(N a C l)。3.1.5 碳酸钠(N a2C O3)。3.1.6 碳酸氢钾(KHC O3)。3.1.7 磷酸氢二钾(K2H P O4)。3.1.8 三水合乙酸钠(C2H3O2N a3 H2O)。3.1.9 三水合磷酸二氢钾(KH2P O43 H2O)。3.1.1 0 七水合硫酸镁(M g S O47 H2O)。3.1.1 1 七水合硫酸亚铁(F e S O47 H2O)。3.1.1 2 一水合硫酸锰(M n S O4H2O)。3.1.1 3 三羟甲基氨基甲烷(C4H1 1NO3)。3.1.1 4 葡萄糖(C6H1 2O6)。3.1.1 5 甲苯(C7H8)。3.1.1 6 无水乙醇(C2H6O)。3.1.1 7 阴离子交换树脂D o w e x18:粒度3 8m 7 5m。G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 62 3.1.1 8 碱性磷酸酶:酶活力2 3U/g。3.1.1 9 鸽子肝脏丙酮提取物干粉(l i v e ra c e t o n ep o w d e r,f r o mp i g e o n):酶活力0.1U/g。3.1.2 0 蛋白胨:含氮量1 0%。3.1.2 1 酵母提取物:含氮量1 0%。3.1.2 2 琼脂。3.2 试剂配制3.2.1 乙酸溶液(0.2m o l/L):吸取1 1.8m L冰乙酸,用水稀释至10 0 0m L,混匀。3.2.2 乙酸钠溶液(0.2m o l/L):称取2 7.2g三水合乙酸钠,加水溶解并稀释至10 0 0m L,混匀。3.2.3 盐酸溶液(1m o l/L):吸取8 3m L盐酸,加水稀释至10 0 0m L,混匀。3.2.4 盐酸浸泡液:吸取1 0 0m L盐酸与5 0倍水混合。3.2.5 氢氧化钠溶液(1m o l/L):称取4 0g氢氧化钠,加水溶解并稀释至10 0 0m L,混匀。3.2.6 氢氧化钠溶液(0.1m o l/L):称取4g氢氧化钠,加水溶解并稀释至10 0 0m L,混匀。3.2.7 T r i s缓冲液:称取1 2 1.0g三羟甲基氨基甲烷溶于5 0 0m L水中,用冰乙酸调p H至8.10.1,加水至10 0 0m L,混匀。贮存于24冰箱中,可保存2周。3.2.8 生理盐水:称取9g氯化钠,加水溶解并稀释至10 0 0m L,混匀。临用前预先灭菌,于1 2 1高压灭菌1 0m i n后备用。3.2.9 乙醇溶液(2 0%):量取2 0 0m L无水乙醇与8 0 0m L水混匀。3.2.1 0 碳酸钠溶液(0.0 8m o l/L):称取8.5g碳酸钠,加水溶解并稀释至10 0 0m L,混匀。3.2.1 1 碳酸氢钾溶液(0.0 2m o l/L):称取2g碳酸氢钾,加水溶解并稀释至10 0 0m L。混匀。3.2.1 2 碱性磷酸酶溶液:称取2g碱性磷酸酶,加水溶解并稀释至1 0 0m L。临用现配,24冰箱预冷。3.2.1 3 鸽子肝脏提取液3.2.1 3.1 活化D o w e x18:称取1 0 0gD o w e x18于锥形瓶中,加入1L盐酸溶液,置于振荡器上充分振摇1 0m i n,用铺有滤纸的布氏漏斗过滤。D o w e x18转回锥形瓶,再加入1L盐酸溶液重复振摇、过滤。D o w e x18加入1L水振摇1 0m i n,过滤,重复用水洗涤1 0次。逐滴加入T r i s缓冲液调节D o w e x18p H至8.00.1。24冰箱保存,2天内用完。3.2.1 3.2 鸽子肝脏提取液:配制此试剂前一天将所用容器放入24冰箱中冷藏过夜。称取3 0g鸽子肝脏丙酮提取物干粉,放入研钵中,冰浴条件下分两次加入3 0 0m L碳酸氢钾溶液研磨至匀浆,转入具塞离心管中,盖好塞后充分振摇,-2 0冷冻1 0m i n后以30 0 0r/m i n离心5m i n,将上清液转至5 0 0m L广口瓶中。加1 5 0g活化D o w e x18,放入冰浴中混匀5 m i n,将混合液倒入离心管中,30 0 0r/m i n离心5m i n。将上清液移入另一5 0 0m L预冷的广口瓶中,-2 0冷冻1 0m i n,再加1 5 0g活化D o w e x18,放入冰浴中混匀5m i n,将混合液倒入离心管中,30 0 0r/m i n离心,将上清液分装于具塞试管中(每管大约3m L),-2 0冷冻保存。用前于24冰箱内化冻并保存至用时。3.3 培养基3.3.1 甲盐溶液:分别称取2 5g磷酸氢二钾和2 5g三水合磷酸二氢钾,加水溶解并稀释至5 0 0m L,混匀。加入1m L甲苯,24冰箱可保存1年。3.3.2 乙盐溶液:分别称取1 0g七水合硫酸镁、0.5g氯化钠、0.5g七水合硫酸亚铁和0.5g一水合硫酸锰,加水溶解并稀释至5 0 0m L。加5滴盐酸,24冰箱可保存1年。3.3.3 琼脂培养基:按表1称取或吸取各试剂,加水至1 0 0m L,混合,沸水浴加热至琼脂完全溶化。趁热用1m o l/L盐酸溶液和/或1m o l/L氢氧化钠溶液调节p H至6.80.1。尽快分装,根据试管内径粗细加入3m L5m L,液面高度不得低于2c m。塞上棉塞,1 2 1高压灭菌1 5m i n。取出后试管直立放G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 63 置,待冷却后于冰箱内保存,备用。表1 菌种储备用琼脂培养基配制一览表试剂用量葡萄糖1.0g蛋白胨0.8g酵母提取物干粉0.2g三水合乙酸钠1.7g甲盐溶液0.2m L乙盐溶液0.2m L琼脂1.2g3.3.4 泛酸测定用培养液:可按附录A配制泛酸测定用培养液。也可直接由试剂公司购买效力相当的泛酸测定用培养基,用前按说明书配制。3.4 标准品D-泛酸钙(C1 8H3 2C a N2O1 0):纯度9 9%。3.5 标准溶液的配制3.5.1 泛酸标准储备溶液(4 0.0g/m L):精确称取4 3.5m g预干燥至恒重的D-泛酸钙,加水溶解并转移至10 0 0m L容量瓶中,加1 0m L乙酸溶液,1 0 0m L乙酸钠溶液,用水定容至刻度。储存于棕色瓶中,加入3滴5滴甲苯,于24冰箱中可保存2年。3.5.2 泛酸标准中间液(1.0 0g/m L):准确吸取2 5.0m L泛酸标准储备溶液置于10 0 0m L容量瓶中,加入1 0m L乙酸溶液,1 0 0m L乙酸钠溶液,用水定容至刻度。加入3滴5滴甲苯于24冰箱中可保存1年。3.5.3 泛酸标准工作溶液(2 0n g/m L):准确吸取2.0 0m L泛酸标准中间溶液置于1 0 0m L容量瓶中,用水定容至刻度,混匀。临用前现配。4 仪器和设备4.1 天平:感量0.1m g。4.2 恒温培养箱:3 71。4.3 压力蒸汽消毒器:1 2 1。4.4 漩涡振荡器。4.5 离心机:转速30 0 0r/m i n。4.6 接种针和接种环。4.7 p H计:精度0.0 1。4.8 紫外-分光光度计。4.9 超净工作台。4.1 0 超声振荡器。G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 64 5 菌种的制备与保存5.1 菌种植物乳杆菌L a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m(AT C C8 0 1 4)。5.2 储备菌种的制备将菌种植物乳杆菌L a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m(AT C C8 0 1 4)转接至琼脂培养基中,在3 71恒温箱中培养2 0h2 4h,连续传种2次3次。取出后放入24冰箱作为储备菌株保存。每月至少传代一次,不宜超过2 5代。试验前将储备菌株接种至琼脂培养基中,3 71恒温培养箱中培养2 0h2 4h以活化菌株,用于接种液的制备。注:保存数周以上的储备菌株,不能立即用作接种液制备,试验前宜连续传种2代3代以保证细菌活力。5.3 接种液的制备试验前一天,取2m L泛酸标准工作溶液和4m L泛酸测定用培养液混匀,分装于2支5m L离心管中,塞好棉塞,于1 2 1高压灭菌1 5m i n后即为种子培养液。冷却后用接种环将活化的菌株转种至2支种子培养液中,于3 71恒温培养箱中培养2 0h2 4h。取出后30 0 0r/m i n离心1 0m i n,弃上清液,无菌操作下用已预先灭菌的生理盐水淋洗2次,30 0 0r/m i n离心1 0m i n,弃上清液。再加入3m L灭菌生理盐水,振荡混匀,制成接种液,立即使用。6 分析步骤注:所有操作均需避光进行6.1 试样制备谷薯类、豆类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛(筛板孔径0.3mm0.5mm);肉、蛋、坚果等用匀质器制成食糜;果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀;液体试样用前振摇混合。4冰箱可保存1周。6.2 试样提取6.2.1 直接提取法形态为颗粒、粉末、片剂、液体的营养素补充剂或强化剂、预混料,添加了泛酸钙的配方食品或保健食品可采用直接提取法。准确称取适量试样(m),固体试样0.2g 2g;液态试样5g 1 0g,精确至0.0 0 1g,转入1 0 0m L锥形瓶中,加入8 0m L乙醇溶液,具塞,超声振摇提取4h以上至试样完全溶解,用水定容至1 0 0m L(V1)。6.2.2 酶解法一般谷薯类、肉蛋乳类、果蔬菌藻类、豆及坚果类等食品试样宜采用酶解提取法。6.2.2.1 水解:准确称取适量试样(m,约含0.0 2m g0.2m g泛酸),精确至0.0 0 1g。一般谷薯类、肉类、蛋类、豆类及其制品称取1g5g;新鲜果蔬、乳及其制品称取5g1 0g。转入至1 0 0m L锥形瓶中,加1 0m LT r i s缓冲液、4 0m L水,振荡混匀。于1 2 1高压条件下水解1 5m i n。冷却至室温,转移G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 65 至1 0 0m L容量瓶中,用水定容至刻度(V1),过滤。6.2.2.2 酶解:准确吸取适量试样滤液(1.0m L1 0.0m L,V2)至2 5m L具塞刻度试管底部,补水至1 0m L,加5m LT r i s缓冲液。在冰浴条件下,依次小心加入预冷的0.1m L碳酸氢钠溶液、0.4m L碱性磷酸酶溶液、0.2m L鸽子肝脏提取液和0.4m L水。小心混匀试管,避免混合物黏附于试管壁,加1滴甲苯,3 71温箱中温育过夜(8h以上)。加水至2 0m L,用冰乙酸调节p H至4.50.1,加水定容至2 5.0m L(V3),过滤。调节p H:吸取适量的试样酶解液(2.0m L2 0.0m L,V4)于2 5m L具塞刻度试管中,加水至2 0m L,用0.1m o l/L氢氧化钠溶液调节p H至6.80.1,用水定容至2 5.0m L(V5)。另取一试管加入5m LT r i s缓冲液和1 0m L水,同法加入碳酸氢钠溶液、碱性磷酸酶溶液、鸽子肝脏提取液酶液及温育过夜,并调节p H至6.80.1,用水定容至2 5.0m L作为酶空白液。注:以谷物、乳粉等为基质的配方食品如需计量基质本底泛酸含量,可采用酶解法提取。6.3 稀释根据试样中泛酸含量用水对试样提取液进行适当稀释(F),使稀释后试样提取液中泛酸浓度约为2 0n g/m L。6.4 测定系列管制备所用试管使用前洗刷干净,用水煮沸3 0m i n,沥干后放入盐酸浸泡液中浸泡2h,经1 7 0烘3h后使用。6.4.1 试样和酶空白系列管取4支试管,分别加入1.0m L、2.0m L、3.0m L、4.0m L试样提取液(Vx),补水至5.0m L,加入5.0m L泛酸测定用培养液,混匀。另取4支试管分别加入1.0m L、2.0m L、3.0m L、4.0m L酶空白液。6.4.2 标准系列管取试管分别加入泛酸标准工作溶液0.0 0m L、0.5 0m L、1.0 0m L、1.5 0 m L、2.0 0m L、2.5 0 m L、3.0 0m L、3.5 0m L、4.0 0m L、4.5 0m L、5.0 0m L于试管中,补水至5.0m L,相当于标准系列管中泛酸含量为0n g、1 0n g、2 0n g、3 0n g、4 0n g、5 0n g、6 0n g、7 0n g、8 0n g、9 0n g、1 0 0n g泛酸,再加入5.0m L泛酸测定用培养液,混匀。为保证标准曲线的线性关系,应制备2套3套标准系列管,绘制标准曲线时,以每个标准点的均值计算。6.5 灭菌将所有测定管塞好棉塞,于1 2 1高压灭菌1 5m i n。6.6 接种和培养待测定系列管冷却至室温后,在无菌操作条件下向每支测定管滴加接种液5 0L。塞好棉塞,置于3 71恒温培养箱中培养1 6h2 0h,直至达到最大混浊度,即再培养2h后透光率(或吸光度值)无明显变化。另准备一支标准0管(含0n g泛酸)不接种作为0对照管。6.7 测定将培养好的标准系列管、试样和酶空白系列管用漩涡混匀器混匀。用厚度为1c m比色杯,于5 5 0n m处,以未接种的0对照管调节透光率为1 0 0%(或吸光度值为0),依次测定标准系列管、试样和酶空白系列管的透光率(或吸光度值)。如果0对照管有明显的细菌增长,或者与0对照管相比,标准0管透光率在9 0%以下(或吸光度值在0.2以上);或标准系列管透光率最大变化量4 0%(或吸光度值变G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 66 化量0.4),说明可能有杂菌或不明来源的泛酸混入,需重做试验。注:泛酸测定适宜的光谱范围5 4 0n m6 6 0n m。6.8 分析结果表述6.8.1 标准曲线:以标准系列管泛酸含量为横坐标,每个标准点透光率(或吸光度值)均值为纵坐标,绘制标准曲线。6.8.2 试样结果计算:从标准曲线查得试样和酶空白系列管中泛酸的相应含量(x),如果每个试样的4支试样系列管中有3支以上泛酸含量在1 0n g 8 0n g范围内,且按照式(1)计算每毫升试样稀释液中泛酸浓度(),各管之间相对偏差小于1 5%,则可继续按式(2)或式(3)式(5)进行结果计算,否则需重新取样测定。试样稀释液中泛酸浓度按式(1)计算:=xVx(1)式中:试样稀释液中泛酸浓度,单位为纳克每毫升(n g/m L);x 从标准曲线上查得测定系列管中泛酸含量,单位为纳克(n g);Vx 制备试样系列管时吸取的试样稀释液体积,单位为毫升(m L)。采用直接提取法的试样中泛酸含量按式(2)计算:X=V1Fm1 0 01 06(2)式中:X 试样中泛酸含量,固态试样单位为毫克每百克(m g/1 0 0g),液态试样为毫克每百毫升(m g/1 0 0m L);试样稀释液泛酸浓度平均值,单位为纳克每毫升(n g/m L);V1 试样提取液的定容体积,单位为毫升(m L);F 试样提取液稀释倍数;m 试样质量,单位为克(g);1 0 01 06 换算系数。采用酶解法的试样中泛酸含量按式(3)式(5)计算:m0=02 5(3)mx=V5V3FV4(4)X=(mx-m0)V1mV21 0 01 06(5)式中:m0 酶空白液中泛酸含量,单位为纳克(n g);0 酶空白液中泛酸浓度平均值,单位为纳克每毫升(n g/m L);2 5 酶空白液总体积,单位为毫升(m L);mx 试样酶解液中泛酸含量,单位为纳克(n g);试样稀释液泛酸浓度平均值,单位为纳克每毫升(n g/m L);V5 试样调p H后的定容体积,单位为毫升(m L);V3 试样酶解液的定容体积,单位为毫升(m L);G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 67 F 试样提取液稀释倍数;V4 试样调p H时吸取的酶解液体积,单位为毫升(m L);X 试样中泛酸含量,固态试样单位为毫克每百克(m g/1 0 0g),液态试样为毫克每百毫升(m g/1 0 0m L);V1 试样水解液的定容体积,单位为毫升(m L);m 试样质量,单位为克(g);V2 试样酶解时吸取的水解液体积,单位为毫升(m L);1 0 01 06 换算系数。结果如以泛酸钙计量,应乘以1.0 8 7。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。7 精密度一般食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1 5%;营养素补充剂和强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。8 其他一般食品称样量为5g时,检出限为0.0 3m g/1 0 0g,定量限为0.0 6m g/1 0 0g。营养强化剂类保健食品和配方食品称样量为2g时,检出限为0.0 2 5m g/1 0 0g,定量限0.0 5m g/1 0 0g。第二法 高效液相色谱法9 原理利用泛酸易溶于水,在弱酸性至中性条件下(p H5.07.0)稳定的理化性质,试样用热水在超声波振荡下提取,经C1 8反相色谱柱分离,在紫外检测器检测2 0 0n m波长处检测,根据色谱峰的保留时间及紫外光谱图定性,外标法定量,计算试样中泛酸含量。1 0 试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。1 0.1 试剂1 0.1.1 盐酸(HC l)。1 0.1.2 磷酸(H3P O4)。1 0.1.3 磷酸二氢钾(KH2P O4):色谱纯。1 0.1.4 七水合硫酸锌(Z n S O47 H2O)。1 0.1.5 乙腈(CH3C N):色谱纯。1 0.1.6 淀粉酶:酶活力1.5U/m g。G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 68 1 0.2 试剂配制1 0.2.1 盐酸(0.1m o l/L):吸取8.3m L盐酸至10 0 0m L容量瓶中,加水稀释定容至刻度,混匀。1 0.2.2 硫酸锌溶液(0.5m o l/L):称取1 4.4g七水合硫酸锌,加水溶解并定容至1 0 0m L。1 0.2.3 磷酸二氢钾溶液(0.0 2m o l/L):称取2.7 2 2g磷酸二氢钾,加5 0 0m L水溶解,用磷酸调节p H至3.0,用水定容至10 0 0m L,用0.4 5m滤膜过滤。1 0.3 泛酸标准溶液注:D-泛酸钙(C1 8H3 2C a N2O1 0):纯度9 9%。1 0.3.1 泛酸标准储备溶液(1.0 0 0m g/m L):准确称取泛酸钙1.0 8 7g,加水溶解并转入10 0 0m L容量瓶中,定容至刻度,混匀(4冰箱中可保存5d)。1 0.3.2 泛酸标准中间溶液(1 0 0.0g/m L):准确吸取标准储备溶液1 0.0m L于1 0 0m L容量瓶中,加水定容至刻度。临用前配制。1 0.3.3 泛酸标准工作溶液:分别准确吸取泛酸标准中间液1.0m L,2.0m L,4.0m L,8.0m L,1 6.0m L,3 2.0m L于1 0 0m L容量瓶中,加水定容至刻度,得到浓度分别为1.0g/m L,2.0g/m L,4.0g/m L,8.0g/m L,1 6.0g/m L,3 2.0g/m L的泛酸标准工作溶液,临用前配制。1 1 仪器和设备1 1.1 天平:感量0.1m g。1 1.2 恒箱培养箱:5 55。1 1.3 超声波振荡器。1 1.4 p H计:精度0.0 1。1 1.5 高效液相色谱仪:带紫外检测器或二极管阵列检测器。1 2 分析步骤1 2.1 试样制备固态试样粉碎并混合均匀;碳酸饮料需超声波去除二氧化碳,其他液态试样摇匀。1 2.2 试样测定液的制备1 2.2.1 营养素补充剂类保健食品准确称取或量取适量试样(m),精确至0.0 0 1g,一般固体试样0.2g 2g,液态试样1 0g 2 0g,置于5 0m L锥形瓶中,加入约3 0m L4 05 0温水超声提取2 0m i n,用水定容至刻度(V)。转入离心管30 0 0r/m i n离心5m i n 1 0m i n,取上清液过0.4 5m滤膜,滤液待上机测定。1 2.2.2 配方食品准确称取适量试样(m),精确至0.0 0 1g,一般固态试样约5g,液态试样约2 0g。置于1 0 0m L锥形瓶中,加入4 05 0温水至3 0m L。如果试样中含有淀粉,加入淀粉酶0.2g,振摇混匀,盖上瓶塞,在5 55水浴条件下,振摇酶解1 2 0m i n 2 4 0m i n。如果试样不含淀粉,直接超声提取2 0m i n。取出试样液,冷却至室温,用0.1m o l/L盐酸调节p H至5.00.1,加入5m L0.5m o l/L硫酸锌溶液,充分混合。转入5 0m L容量瓶中,用水定容至刻度并充分混匀后,转入离心管30 0 0r/m i n离心G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 69 5m i n 1 0m i n,取上清液过0.4 5m滤膜,滤液待上机测定。1 2.3 稀释必要时,试样测定液用水进行适当的稀释(F),使试样测定液中泛酸浓度在1g/m L3 2g/m L范围内。1 2.4 参考液相色谱条件1 2.4.1 色谱柱:O D S-C1 8(粒径5m,2 5 0mm4.6mm)或具有同等性能的色谱柱。1 2.4.2 柱温:2 80.5。1 2.4.3 紫外检测器:检测波长:2 1 0n m。1 2.4.4 流动相:0.0 2m o l/L磷酸二氢钾溶液+乙腈=9 5+5。1 2.4.5 流速:1.0m L/m i n。1 2.4.6 进样量:1 0L或2 0L。1 2.5 测定1 2.5.1 标准曲线测定按照已经确立的色谱条件,将泛酸标准工作液依次进行色谱分析(标准色谱图见附录B),记录标准出峰时间、色谱峰高(或峰面积)。以标准工作液浓度为横坐标,峰高(或峰面积)为纵坐标,绘制标准曲线。1 2.5.2 试样溶液的测定取试样测定液按照色谱条件进行色谱分析,根据试样峰高(或峰面积)从标准曲线中查得相应的泛酸浓度()。1 3 分析结果的表述试样中泛酸的含量按式(6)计算:X=VFm1 0 010 0 0(6)式中:X 试样中泛酸含量,固态试样单位为毫克每百克(m g/1 0 0g),液态试样为毫克每百毫升(m g/1 0 0 m L);从标准曲线上查得试样测定液中泛酸的浓度,单位为微克每毫升(g/m L);V 试样测定液总体积,单位为毫升(m L);F 试样测定液稀释倍数;m 试样质量,单位为克(g);1 0 010 0 0 换算系数。结果如以泛酸钙计量,应乘以1.0 8 7。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 61 0 1 4 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。1 5 其他当称样量为5g时,检出限为0.0 2 5m g/1 0 0g,定量限为0.0 8m g/1 0 0g。G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 61 1 附 录 A泛酸测定用培养液的配制方法A.1 试剂A.1.1 盐酸(HC l)。A.1.2 氢氧化钠(N a OH)。A.1.3 活性炭:粒度为0.0 5mm 0.0 7 4mm。A.1.4 甲苯(C7H8)。A.1.5 硫酸腺嘌呤(C1 0H1 0N1 0H2S O4)。A.1.6 盐酸鸟嘌呤(C5H5N5O5HC l)A.1.7 尿嘧啶(C4H4N2O2)。A.1.8 L-胱氨酸(C6H1 2N2O4S2)。A.1.9 L-色氨酸或D L-色氨酸(C1 1H1 2N2O2)。A.1.1 0 核黄素(C1 7H2 0N4O6)。A.1.1 1 盐酸硫胺素(C1 2H1 7C l N4O SHC l)。A.1.1 2 生物素(C1 0H1 6N2O3S)。A.1.1 3 乙酸(C2H4O2)溶液:0.0 2m o l/L。A.1.1 4 对氨基苯甲酸(C7H7NO2)。A.1.1 5 尼克酸(C6H5NO2)。A.1.1 6 盐酸吡哆醇(C8H1 1NO3HC l)。A.1.1 7 无水乙醇(C2H5OH)。A.1.1 8 乙醇溶液(1+3)。A.1.1 9 聚山梨酯-8 0(吐温-8 0)。A.1.2 0 无水葡萄糖(C6H1 2O6)。A.1.2 1 三水合乙酸钠(C2H3O2N a3 H2O)。A.1.2 2 无维生素酪蛋白(v i t a m i nf r e ec a s e i n)。A.2 试剂配制A.2.1 氢氧化钠溶液(1 0m o l/L):称取4 0g氢氧化钠,用1 0 0m L水溶解。A.2.2 氢氧化钠溶液(1m o l/L):称取4g氢氧化钠,用1 0 0m L水溶解。A.2.3 盐酸溶液(3m o l/L):吸取2 5 0m L盐酸,用水稀释至10 0 0m L,混匀。A.2.4 盐酸溶液(1m o l/L):按3.2.3配制。A.2.5 酪蛋白液:称取5 0g无维生素酪蛋白于5 0 0m L烧杯中,加2 0 0m L盐酸溶液(3m o l/L),于1 2 1高压水解6h。将水解物转移至蒸发皿内,在沸水浴上蒸发至膏状。加2 0 0m L水使之溶解后再蒸发至膏状,如此反复3次,以除去盐酸。用1 0m o l/L氢氧化钠溶液调节p H至3.50.1。加2 0g活性炭,振摇约2 0m i n,过滤。重复活性炭处理2次4次,直至滤液呈淡黄色或无色。滤液加水稀释至10 0 0m L,加3m L甲苯,置24冰箱中可保存1年。注:每次蒸发时不可蒸干或焦糊,以避免所含营养素破坏。可直接由试剂公司购买效力相当的酸水解无维生素酪蛋白。G B5 0 0 9.2 1 02 0 1 61 2 A.2.6 腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶溶液:分别称取硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤和尿嘧啶各0.1g于2 5 0m L烧杯中,加7 5m L水和2m L盐酸,加热使其完全溶解后冷却。若有沉淀产生,再加盐酸数滴,加热,如此反复直至冷却后无沉淀产生为止。用水稀释至1 0 0m L,加3滴5滴甲苯,贮存于棕色试剂瓶中,置24冰箱中可保存1年。A.2.7 胱氨酸-色氨酸溶液:分别称取4gL-胱氨酸和1gL-色氨酸或2gD L-色氨酸于8 0 0m L水中,加热至7 08 0,逐滴加入3m o l/L盐酸溶液,不断搅拌,直至完全溶解为止。冷却至室温后加水稀释至10 0 0m L。加3滴5滴甲苯,贮存于棕色试剂瓶中,于24冰箱中可保存1年。A.2.8 维 生 素 液:分 别 称 取2 0 m g核 黄 素 和1 0 m g盐 酸 硫 胺 素,加 入1.0 m L生 物 素 溶 液(4 0g/m L),用0.0 2m o l/L乙酸溶液溶解并定容至10 0 0m L。加入3滴5滴甲苯,贮存于棕色试剂瓶中,24冰箱可保存1年。A.2.9 维生素液:分别称取1 0m g对氨基苯甲酸、5 0m g尼克酸和4 0m g盐酸吡哆醇,溶于10 0 0m L乙醇溶液中。加入3滴5滴甲苯,贮存于棕色试剂瓶中,24冰箱可保存1年。A.2.1 0 聚山梨酯-8 0溶液:将2 5g聚山梨酯-8 0用乙醇溶解并稀释至2 5 0m L。24冰箱可保存1年。A.2.1 1 泛酸测定用培养液:配制10 0 0m L培养液,按表A.1吸取液体试剂,混合后加水3 0 0m L,依次加入固体试剂,煮沸搅拌2m i n。用1m o l/L氢氧化钠溶液、1m o l/L盐酸溶液调节基础培养液p H至6.80.1。加入乙盐溶液2 0m L,用水补至10 0 0m L。配制时可根据培养液用量按比例增减。临用现配。表A.1 泛酸测定用培养液配制一览表试剂用量液体试剂酪蛋白液腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶溶液维生素溶液维生素溶液胱氨酸-色氨酸溶液聚山梨酯-8 0溶液甲盐溶液1 0 0m L2 0m L2 0m L2 0m L1 0 0m L1m L2 0m L固体试剂无水葡萄糖三水合乙酸钠4 0g3 3gG B5 0 0 9.2 1 02 0 1 61 3 附 录 B泛酸标准溶液的液相色谱图泛酸标准溶液的液相色谱图见图B.1。图B.1 泛酸标准溶液的液相色谱图