细胞基本培养技术优秀PPT.ppt

内内容容第一节第一节玻璃器皿及塑料制品的清玻璃器皿及塑料制品的清洗与消毒洗与消毒其次节其次节培育操作的基本要领和要培育操作的基本要领和要求求第三节第三节细胞培育的基本技术细胞培育的基本技术第一第一节细胞培育所用玻璃及塑料胞培育所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒制品的清洗与消毒一、清洗一、清洗vv目的：目的：vv 在在组织细胞培育中，体外胞培育中，体外细胞胞对任何有害任何有害物物质都特都特别敏感敏感,均能影响培育均能影响培育细胞的生胞的生长vv有害物有害物质包括：微生物包括：微生物产品附品附带杂物物vv 上次上次细胞残留物胞残留物vv 非养分成分的化学物非养分成分的化学物质vv须要清洗的培育用品要清洗的培育用品vv玻璃器皿、胶塞、塑料制品玻璃器皿、胶塞、塑料制品1 1、玻璃器皿的清洗、玻璃器皿的清洗vv包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤vv清洗后的玻璃器皿要求：清洗后的玻璃器皿要求：vv干干净透亮无油迹透亮无油迹vv不能残留任何物不能残留任何物质v清洗：自来水洗，烘干清洗：自来水洗，烘干泡酸泡酸自来水洗自来水洗去离子水洗去离子水洗三蒸水洗三蒸水洗烘干烘干v新瓶子均按该程序清洗，培育材料染菌新瓶子均按该程序清洗，培育材料染菌的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。v酸液（洗液）：浓硫酸酸液（洗液）：浓硫酸+重铬酸钾重铬酸钾vv浸泡：浸泡：vv初次运用和培育运用后的玻璃器皿均需初次运用和培育运用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶化或被溶掉。掉。vv新的初次运用的玻璃器皿新的初次运用的玻璃器皿vv先用自来水先用自来水简洁刷洗，然后用刷洗，然后用5 5稀稀盐酸液浸泡酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物夜，以中和其中的碱性物质vv培育瓶浸泡后培育瓶浸泡后还须要装要装满蒸蒸馏水水后上高后上高压！再次运用的玻璃器皿：再次运用的玻璃器皿：用后用后马上浸入水中，要求完全浸入，上浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。不能留有气泡或浮在液面上。缘由：常附有大量由：常附有大量刚运用运用过的蛋白的蛋白质，干固后不易洗掉。，干固后不易洗掉。v刷洗：刷洗：用毛刷沾洗用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附刷洗，以除去器皿表面附着着较牢的牢的杂质。刷洗要适度，刷洗要适度，过度会度会损害器皿表面光害器皿表面光泽度度 浸酸：浸酸：浸酸：浸酸：玻璃器皿浸泡到清玻璃器皿浸泡到清玻璃器皿浸泡到清玻璃器皿浸泡到清洁洁液中的液中的液中的液中的过过程程程程留意：浸泡留意：浸泡留意：浸泡留意：浸泡时时器皿要充溢清器皿要充溢清器皿要充溢清器皿要充溢清洁洁液，勿留气泡或器皿露出清液，勿留气泡或器皿露出清液，勿留气泡或器皿露出清液，勿留气泡或器皿露出清洁洁液液液液面。面。面。面。浸泡浸泡浸泡浸泡时间时间：一般：一般：一般：一般为过为过夜，不夜，不夜，不夜，不应应少于少于少于少于6 6 6 6 小小小小时时配制、浸泡配制、浸泡配制、浸泡配制、浸泡时应时应留意平安，留意平安，留意平安，留意平安，须须穿戴耐酸手套和穿戴耐酸手套和穿戴耐酸手套和穿戴耐酸手套和围围裙，并要裙，并要裙，并要裙，并要爱护爱护好面部及身体袒露部分。好面部及身体袒露部分。好面部及身体袒露部分。好面部及身体袒露部分。vv冲洗冲洗vv在运用后，刷洗及浸泡后都必需用水在运用后，刷洗及浸泡后都必需用水充分冲洗。使之尽量不留充分冲洗。使之尽量不留污染或清染或清洁液的残迹。液的残迹。vv浸泡后的冲洗浸泡后的冲洗过程：程：需流水冲洗十次以上，每次水需流水冲洗十次以上，每次水需流水冲洗十次以上，每次水需流水冲洗十次以上，每次水须须灌灌灌灌满满及倒干及倒干及倒干及倒干净净，蒸蒸蒸蒸馏馏水浸泡水浸泡水浸泡水浸泡过过夜，自来水冲洗夜，自来水冲洗夜，自来水冲洗夜，自来水冲洗5 5 5 5遍，一蒸水遍，一蒸水遍，一蒸水遍，一蒸水5 5 5 5遍，遍，遍，遍，二蒸水二蒸水二蒸水二蒸水3 3 3 3遍，培育瓶要求二蒸水也用流水，烤干遍，培育瓶要求二蒸水也用流水，烤干遍，培育瓶要求二蒸水也用流水，烤干遍，培育瓶要求二蒸水也用流水，烤干备备用。用。用。用。2 2、胶塞的清洗、胶塞的清洗vv新新购置的瓶塞置的瓶塞带有大量滑石粉及有大量滑石粉及杂质，应先先用自来水冲洗，再做常用自来水冲洗，再做常规处理理.vv常规清洗方法常规清洗方法常规清洗方法常规清洗方法vv每次用后马上置入水中浸泡，用每次用后马上置入水中浸泡，用每次用后马上置入水中浸泡，用每次用后马上置入水中浸泡，用2%NaOH2%NaOH或洗衣或洗衣或洗衣或洗衣粉煮沸粉煮沸粉煮沸粉煮沸10-2010-20分钟（以除掉培育中的蛋白质），自来分钟（以除掉培育中的蛋白质），自来分钟（以除掉培育中的蛋白质），自来分钟（以除掉培育中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗水冲洗，蒸馏水冲洗水冲洗，蒸馏水冲洗水冲洗，蒸馏水冲洗2-32-3次，晾干备用。次，晾干备用。次，晾干备用。次，晾干备用。3 3、塑料制品的清洗、塑料制品的清洗vv塑料制品塑料制品现多是接受无毒并已多是接受无毒并已经特殊特殊处理的理的包装，打开包装即可用，多包装，打开包装即可用，多为一次性物品。一次性物品。vv必要必要时用用2%NaOH 2%NaOH 浸泡浸泡过夜，用自来水充分夜，用自来水充分冲洗，再用冲洗，再用5%5%盐酸溶液浸泡酸溶液浸泡30 30 分分钟，最，最终用自来水和蒸用自来水和蒸馏水冲洗干水冲洗干净，晾干，晾干备用。用。vv培育板、塑料离心管的清洗同玻璃器皿。但不能放在培育板、塑料离心管的清洗同玻璃器皿。但不能放在培育板、塑料离心管的清洗同玻璃器皿。但不能放在培育板、塑料离心管的清洗同玻璃器皿。但不能放在烤箱中干燥！烤箱中干燥！烤箱中干燥！烤箱中干燥！二、包装：二、包装：目的：以便消毒及储存，防止落人灰尘及消目的：以便消毒及储存，防止落人灰尘及消毒后再次被污染。毒后再次被污染。包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等！品名称、消毒日期等！各种用品的包装各种用品的包装器皿的包装分器皿的包装分为半包装和全包装半包装和全包装培育瓶培育瓶 两个一两个一组全包，包装前盖上螺旋盖子。全包，包装前盖上螺旋盖子。吸管吸管 在与胶在与胶头相接端塞上棉花装入吸管筒。相接端塞上棉花装入吸管筒。青霉素小瓶青霉素小瓶 倒扣在倒扣在饭盒中，全包。盒中，全包。滤器器 上下口半包装再用上下口半包装再用报纸包，最包，最终用布包好。用布包好。大的容器大的容器 如如锥形瓶，加上棉塞后半包装。形瓶，加上棉塞后半包装。枪头、EPEP管管 装在相装在相应的盒子中，全包。的盒子中，全包。手手术器械器械 放在放在饭盒中，全包。盒中，全包。离心管离心管 加盖子后全包加盖子后全包三、消毒、灭菌三、消毒、灭菌 防止培育物污染可通过消毒灭菌（将已存在的微防止培育物污染可通过消毒灭菌（将已存在的微生物去除）生物去除）灭菌灭菌sterilizationsterilization：应用理化方法杀死全部病原：应用理化方法杀死全部病原微生物、非病原微生物和芽胞。微生物、非病原微生物和芽胞。消毒消毒disinfectiondisinfection：应用理化方法杀死微生物，只：应用理化方法杀死微生物，只要求达到无传染性的目的，不要求全部杀死。要求达到无传染性的目的，不要求全部杀死。无菌无菌germfree：没有活菌。：没有活菌。防腐防腐antisepsis：应用理化方法防止和抑制微：应用理化方法防止和抑制微生物生长繁殖。生物生长繁殖。抑菌（抑菌（bacteriostasis）：）：抑制体内或体外细抑制体内或体外细菌生长繁殖。常用的抑菌剂为抗生素菌生长繁殖。常用的抑菌剂为抗生素1、消毒灭菌的方法消毒灭菌的方法 物理方法物理方法:湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线。射湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线。射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物。线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物。化学方法化学方法:运用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。运用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。2、消毒灭菌的留意事项、消毒灭菌的留意事项 干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到 160 160，保持，保持9090120 min120 min方能杀死芽孢。方能杀死芽孢。留意！留意！消毒完毕后不行立刻将烤箱门打开，以免冷空气突消毒完毕后不行立刻将烤箱门打开，以免冷空气突然进人，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外然进人，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。事故。湿热消毒：一般运用高压蒸汽灭菌器进行湿热消毒：一般运用高压蒸汽灭菌器进行消毒。消毒。留意：留意：1、不能装太满，保持消毒器内气体流通。、不能装太满，保持消毒器内气体流通。2、在加热升压之前，打开排气阀门，使加热、在加热升压之前，打开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷空气排出！后消毒器内的残留冷空气排出！关闭排气阀门，起先升压，待达到所须要的关闭排气阀门，起先升压，待达到所须要的压力时，起先记录时间，并限制压力恒定。压力时，起先记录时间，并限制压力恒定。3、一般物品：布类、金属器械、玻璃器皿等消毒、一般物品：布类、金属器械、玻璃器皿等消毒的要求是的要求是15磅磅20min；常规运用液体：消毒常规运用液体：消毒15磅磅15min。4、橡胶和塑料用品、橡胶和塑料用品：如滤器、如滤器、EP管、离心管等高压管、离心管等高压10磅磅15min。紫外线消毒：主要用于试验室房间里的空气、操作紫外线消毒：主要用于试验室房间里的空气、操作台表面及桌椅等消毒。时间为台表面及桌椅等消毒。时间为3030分钟分钟2 2小时左右。小时左右。过滤除菌消毒：过滤除菌消毒：适用于组织细胞培育运用的液体如血清、合成培育液、适用于组织细胞培育运用的液体如血清、合成培育液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。3、常用设施的消毒及灭菌、常用设施的消毒及灭菌v培育室：紫外线照射、乳酸熏蒸培育室：紫外线照射、乳酸熏蒸v台面：紫外线照射、台面：紫外线照射、70%乙醇擦拭乙醇擦拭v培育箱：新洁尔灭擦拭培育箱：新洁尔灭擦拭v培育瓶、培育皿等：用报纸包好高压蒸汽培育瓶、培育皿等：用报纸包好高压蒸汽灭菌灭菌v滴管、枪头等：装载相应的容器中用报纸滴管、枪头等：装载相应的容器中用报纸包好高包好高压蒸汽灭菌压蒸汽灭菌v培育板：紫外线照射培育板：紫外线照射12小时以上。小时以上。v培育基：过滤除菌培育基：过滤除菌、其次节其次节培育操作基本要领和要求培育操作基本要领和要求v防止污染是确定培育成功或失败的首要条件。由防止污染是确定培育成功或失败的首要条件。由于体外培育细胞缺乏抗感染实力，故在一切操作于体外培育细胞缺乏抗感染实力，故在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。中要努力做到最大限度的无菌。v一、培育前准备一、培育前准备v1、制定出分门别类的操作卡片。、制定出分门别类的操作卡片。v如如“分装血清分装血清”、“组织块贴壁初代培育组织块贴壁初代培育”、“传代培育传代培育”、等等。各卡片上记有需用器材和物、等等。各卡片上记有需用器材和物品名称、要求及数量等，好处是试验者可按卡片品名称、要求及数量等，好处是试验者可按卡片收集所用物品，清点无误后，把用品放置于操作收集所用物品，清点无误后，把用品放置于操作场地，然后进行消毒。场地，然后进行消毒。2、操作野消毒：现多用紫外线灯灭菌，效果、操作野消毒：现多用紫外线灯灭菌，效果很好。用很好。用30瓦紫外线管灯，操作箱消毒瓦紫外线管灯，操作箱消毒20一一30分钟即可；操作室空间大，需消毒分钟即可；操作室空间大，需消毒3050分钟。分钟。在用紫外线灯照射期间，在操作台面上勿置在用紫外线灯照射期间，在操作台面上勿置培育细胞和培育用液等物，以免受射线影响培育细胞和培育用液等物，以免受射线影响(必要时可用纸张覆盖必要时可用纸张覆盖)。紫外线只有干脆杀菌作用，工作野用品过多紫外线只有干脆杀菌作用，工作野用品过多或重叠放置，物品相互遮挡射线，会降低消或重叠放置，物品相互遮挡射线，会降低消毒效果毒效果3、洗手和着装：原则上和外科手术相同。在、洗手和着装：原则上和外科手术相同。在利用无菌箱工作时，因整个前臂要伸入箱利用无菌箱工作时，因整个前臂要伸入箱内，洗刷时确定要清洗到肘部。内，洗刷时确定要清洗到肘部。75酒精，酒精，进行擦洗消毒；必要时亦可用进行擦洗消毒；必要时亦可用0.2的新洁的新洁尔灭洗涤消毒。尔灭洗涤消毒。进行培育工作时，如利用净化台，仅戴口进行培育工作时，如利用净化台，仅戴口罩和工作帽，着一般工作服即可。在无菌罩和工作帽，着一般工作服即可。在无菌室内工作需着消毒衣帽。室内工作需着消毒衣帽。二、火焰消毒：二、火焰消毒：在无菌环境进行培育或做其它无菌操作时，首先要在无菌环境进行培育或做其它无菌操作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后操作，如安装吸管帽、点燃酒精灯或煤气灯。以后操作，如安装吸管帽、启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼进行。启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼进行。已吸取过养分液的吸管不能再用火焰烧灼！因吸管已吸取过养分液的吸管不能再用火焰烧灼！因吸管头中残留养分液能烧焦形成炭膜，再用时会把有头中残留养分液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入培育液中。害物带入培育液中。消毒火焰要求无色或微蓝色，而红黄色或发黑的火消毒火焰要求无色或微蓝色，而红黄色或发黑的火苗，表示燃烧不完全或含有杂质，有害物能混入苗，表示燃烧不完全或含有杂质，有害物能混入培育液内。因此酒精灯需用培育液内。因此酒精灯需用96的不含杂质的酒的不含杂质的酒精，绝不能运用含有二甲苯和甲醇的酒精。精，绝不能运用含有二甲苯和甲醇的酒精。三、培育操作留意事项三、培育操作留意事项1、进行培育操作时，动作要精确灵敏，但又、进行培育操作时，动作要精确灵敏，但又不必太快，以防空气流淌，增加污染机会。不必太快，以防空气流淌，增加污染机会。2、不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要、不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒触及部，如不便消毒时，应用火焰烧灼消毒触及部，如不便消毒时，应取备品更换。取备品更换。3、布局：、布局：原则上应是右手运用的东西放置在右侧，左手原则上应是右手运用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中心用品在左侧，酒精灯置于中心(图图4-1)。工作。工作由始至终要保持确定依次性。由始至终要保持确定依次性。4、组织或细胞在末做处理之前，勿过早暴露在空气中。、组织或细胞在末做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培育液在运用前，不要过早开瓶；用过之后如同样，培育液在运用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复运用，应马上封闭瓶口。不再重复运用，应马上封闭瓶口。5、培育用瓶开瓶以后，皆应保持、培育用瓶开瓶以后，皆应保持45度斜位或平放，度斜位或平放，吸取养分液吸取养分液BSS、细胞悬液及其它各种用液时，均应、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别运用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞分别运用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。交叉污染。6、工作中不能面对操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细、工作中不能面对操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。菌或支原体带入工作台面发生污染。第三节第三节基本培育操作技术基本培育操作技术一、传代培育法一、传代培育法v当时代培育成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，当时代培育成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，进而扩展汇合，占满一切空间，此时须要进行分别进而扩展汇合，占满一切空间，此时须要进行分别培育。这一操作称传代或再培育。培育。这一操作称传代或再培育。v80%汇合或刚汇合细胞是志向传代阶段。汇合或刚汇合细胞是志向传代阶段。v为什么要进行传代？为什么要进行传代？1、贴壁细胞传代、贴壁细胞传代贴壁细胞贴壁细胞贴附生长型细胞贴附生长型细胞细胞培育常用的培育瓶、细胞培育常用的培育瓶、培育皿、培育皿、6孔板、孔板、96孔板孔板成纤维细胞：梭形、三角形、成纤维细胞：梭形、三角形、2-3个突起个突起上皮细胞：扁平、多角形、园核上皮细胞：扁平、多角形、园核可连成单层可连成单层v材料和试剂材料和试剂vHela细胞细胞vRPMI1640生长液、碳酸氢钠、双抗生长液、碳酸氢钠、双抗vEDTA消化液（消化液（0.02%）v培育瓶、无菌吸液管（培育瓶、无菌吸液管（5ml、1ml）、弯）、弯头毛细滴管、废液缸头毛细滴管、废液缸图5-6 消化法传代培育步骤v【程序】【程序】v(1)吸除培育瓶内旧培育液；吸除培育瓶内旧培育液；v(2)向瓶内加入向瓶内加入EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限；混合液少许，以能覆满瓶底为限；v(3)置温箱中置温箱中25分钟分钟(或在室温中，把培育瓶放在倒立显微镜或在室温中，把培育瓶放在倒立显微镜台上镜下视察台上镜下视察)，当发觉细胞胞质回缩，细胞间隙增大后，马上，当发觉细胞胞质回缩，细胞间隙增大后，马上终止消化；终止消化；v(4)吸除消化液吸除消化液(5)用吸管吸取养分液（已经加入双抗并调用吸管吸取养分液（已经加入双抗并调好好pH值）加入培育瓶，轻轻反复吹打瓶值）加入培育瓶，轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液；壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液；吹打勿用力过猛，以免损害细胞；吹打勿用力过猛，以免损害细胞；(6)计数板计数后计数板计数后(如非试验用，不计数亦可如非试验用，不计数亦可)，把细胞悬液分成等份分装入数个培育，把细胞悬液分成等份分装入数个培育瓶中，置温箱中培育。瓶中，置温箱中培育。2、悬浮细胞的传代培育、悬浮细胞的传代培育悬浮生长型细胞悬浮生长型细胞v材料和试剂材料和试剂vHL-60细胞细胞vRPMI1640生长液、碳酸氢钠、双抗生长液、碳酸氢钠、双抗v培育瓶、无菌吸液管（培育瓶、无菌吸液管（5ml、1ml）、弯）、弯头毛细滴管、废液缸头毛细滴管、废液缸二、操作步骤二、操作步骤l、选生长良好的选生长良好的HL-60细胞一瓶细胞一瓶轻轻加入等量的生轻轻加入等量的生长液。长液。2、用无菌吸液管轻轻吹打，使、用无菌吸液管轻轻吹打，使HL-60细胞匀整悬浮细胞匀整悬浮然后吸出一半的细胞悬液加人另一个培育瓶中。然后吸出一半的细胞悬液加人另一个培育瓶中。3、假如细胞比较浓，可按、假如细胞比较浓，可按1:3安排传代培育。安排传代培育。二、初代培育法二、初代培育法v意义：意义：v初代培育或原代培育，是从供体获得组织后的首次培初代培育或原代培育，是从供体获得组织后的首次培育。其最大优点是：组织和细胞刚刚离体，生物性状育。其最大优点是：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大的变更，具有二倍体遗传性状，在供体尚未发生很大的变更，具有二倍体遗传性状，在供体来源充分、生物条件稳定的状况下来源充分、生物条件稳定的状况下(年龄、性别年龄、性别)，在，在确定程度上能反映体内状态。确定程度上能反映体内状态。v初代培育细胞是探讨基因表达的志向系统。接受初代初代培育细胞是探讨基因表达的志向系统。接受初代培育细胞做试验，如药物测试等效果也很好；培育细胞做试验，如药物测试等效果也很好；v初代培育也是建立各种细胞系初代培育也是建立各种细胞系(株株)必需经过的阶段。必需经过的阶段。1、原则：、原则：幼体组织尤其是胚胎组织比年老个体的组织简洁幼体组织尤其是胚胎组织比年老个体的组织简洁培育；培育；分化程度低的组织比分化程度高的简洁生长；分化程度低的组织比分化程度高的简洁生长；肿瘤组织比正常组织简洁培育。肿瘤组织比正常组织简洁培育。一般在无特定要求时，取易培育的组织进行培育，一般在无特定要求时，取易培育的组织进行培育，成功率高。成功率高。（一）取材（一）取材v留意事项：留意事项：v取材之后，最好马上培育，如因故不能培育时，应取材之后，最好马上培育，如因故不能培育时，应把组织切成把组织切成1立方厘米左右的小块，置于培育液中，立方厘米左右的小块，置于培育液中，4贮存；存放时间不宜超过贮存；存放时间不宜超过24小时。小时。v从体内取材时，应严格保持无菌，取肿瘤和其它病从体内取材时，应严格保持无菌，取肿瘤和其它病理组织时简洁带菌，为削减污染，可用含理组织时简洁带菌，为削减污染，可用含5001000单位毫升的青、链霉素单位毫升的青、链霉素BSS液，漂洗液，漂洗510分钟后再做培育处理。分钟后再做培育处理。1、鼠组、鼠组织取材织取材各种组织取材2取皮肤：取皮肤：人皮肤是常用的培育材料，对供体无特定要求时，人皮肤是常用的培育材料，对供体无特定要求时，可利用手术时取材：请术者手术时切取可利用手术时取材：请术者手术时切取l2cm2皮肤，即满皮肤，即满足培育要求。足培育要求。取皮肤时可在上臂和大腿内侧等处，先用肥皂洗净取材部位皮肤，取皮肤时可在上臂和大腿内侧等处，先用肥皂洗净取材部位皮肤，用用75酒精擦拭消毒酒精擦拭消毒23次次(勿用碘酒勿用碘酒)。取材方法可按如下两种方法：取材方法可按如下两种方法：一是用注射器针尖轻轻斜刺入表皮内一是用注射器针尖轻轻斜刺入表皮内2毫米左右，向上挑起一个毫米左右，向上挑起一个小的皮丘，然后用手术刀紧贴针尖下方，切下直径小的皮丘，然后用手术刀紧贴针尖下方，切下直径23毫米毫米小片，深度以创面微见血迹为度；小片，深度以创面微见血迹为度；二是用拇指和食指把取皮部皮肤紧捏起，在绷起的皮肤表面，用二是用拇指和食指把取皮部皮肤紧捏起，在绷起的皮肤表面，用手术刀轻轻片取一小片表皮，大小和深度同前。手术刀轻轻片取一小片表皮，大小和深度同前。3取体液：取体液：血液白细胞是常用的培育材料，一般多用静脉取血血液白细胞是常用的培育材料，一般多用静脉取血法。亦可从耳垂或指尖取血。从无名指肚取血很好，法。亦可从耳垂或指尖取血。从无名指肚取血很好，血多，消毒和取血都便利，刺口复原很快不易感染。血多，消毒和取血都便利，刺口复原很快不易感染。从手指取从手指取23滴血即够一次培育，血用量多时需滴血即够一次培育，血用量多时需从静脉实行。为防止凝血，常用肝素等抗凝剂；吸从静脉实行。为防止凝血，常用肝素等抗凝剂；吸出血后拔掉针，马上把血注入无菌容器中备用。出血后拔掉针，马上把血注入无菌容器中备用。取骨髓组织、羊水、胸水和腹水可托付临床有关科取骨髓组织、羊水、胸水和腹水可托付临床有关科室，按不同手术规程取材。室，按不同手术规程取材。（二）组织的分别（二）组织的分别v目的：为获得多量生长良好的细胞，必需目的：为获得多量生长良好的细胞，必需把组织细胞分散开，使细胞解离出来；能把组织细胞分散开，使细胞解离出来；能达到单细胞水平更好，同时并不使细胞受达到单细胞水平更好，同时并不使细胞受损害，细胞能很好生长。损害，细胞能很好生长。v分散组织的方法有离心法、机械法和化学分散组织的方法有离心法、机械法和化学法三种；法三种；1离心分别法离心分别法v培育物为血液、羊水、腹水和胸水等细胞培育物为血液、羊水、腹水和胸水等细胞悬液时，可接受离心法分别。一般用低速悬液时，可接受离心法分别。一般用低速5001000转分速度，离心转分速度，离心510分钟分钟即可。如悬液量大，离心时间可适当延长，即可。如悬液量大，离心时间可适当延长，但如离心速度过大和时间太长，易压挤细但如离心速度过大和时间太长，易压挤细胞使之受损或死亡。胞使之受损或死亡。淋巴细胞分别法淋巴细胞分别法v原理：淋巴细胞分层液原理：淋巴细胞分层液(LyphocyteSeparationMedium)效果效果很好。分层液是依据细胞比重不同，使各类细胞相互分开的。很好。分层液是依据细胞比重不同，使各类细胞相互分开的。红细胞比重红细胞比重1.092，淋巴细胞和大单核等白细胞比重为，淋巴细胞和大单核等白细胞比重为1.070；分层液适用于分别血中淋巴细胞。分层液适用于分别血中淋巴细胞。v(1)取抗凝血若干毫升；取抗凝血若干毫升；v(2)按按1:1加入无菌分层液加入无菌分层液(滤过除菌滤过除菌)后，后，8001000转离心；转离心；v(3)无菌分别出白细胞无菌分别出白细胞(白细胞位于红细胞上层，呈微白色白细胞位于红细胞上层，呈微白色)；v(4)BSS漂洗漂洗12次，可用于培育或其它试验。次，可用于培育或其它试验。v留意：如用动物血留意：如用动物血(如小鼠如小鼠)，白细胞的比重与人不同；小鼠白，白细胞的比重与人不同；小鼠白细胞比重为细胞比重为l.080左右，需用相应比重的分层液。左右，需用相应比重的分层液。2机械分散法：机械分散法：切割分别法：在进行组织块培育时，可接受剪切切割分别法：在进行组织块培育时，可接受剪切法，一般多剪切成法，一般多剪切成1mm3大小的块。具体操作大小的块。具体操作如下：如下：v无菌切取无菌切取1cm3组织一块，置入青霉素瓶组织一块，置入青霉素瓶或小烧杯中，左手斜持容器，右手持眼科或小烧杯中，左手斜持容器，右手持眼科尖剪或弯剪尖剪或弯剪(剪柄较长为好剪柄较长为好)伸入容器中，伸入容器中，反复剪切组织至反复剪切组织至1mm3大小为止大小为止(成糊状成糊状)。然后用吸管吸取然后用吸管吸取Hanks液把附着在剪刀上液把附着在剪刀上的组织小块冲下，并再补加的组织小块冲下，并再补加35毫升毫升Hanks液后，用吸管反复轻轻吸吹冲打片液后，用吸管反复轻轻吸吹冲打片刻，低速离心、去上清、余下组织块即可刻，低速离心、去上清、余下组织块即可用于培育。剪刀剪切法可能对组织有确定用于培育。剪刀剪切法可能对组织有确定损伤，但操作比较便利。损伤，但操作比较便利。压挤法压挤法3消化分别法：消化分别法：组织消化法是在把组织剪切成较小体积的基组织消化法是在把组织剪切成较小体积的基础上，应用生化和化学手段进一步分散组础上，应用生化和化学手段进一步分散组织的方法。最终成细胞团或单个细胞，然织的方法。最终成细胞团或单个细胞，然后加入培育液制成细胞悬液，接种入培育后加入培育液制成细胞悬液，接种入培育容器中后，细胞简洁生长增殖。各种消化容器中后，细胞简洁生长增殖。各种消化剂的作用机制各不相同，依据组织的不同，剂的作用机制各不相同，依据组织的不同，可选用特定的消化手段。可选用特定的消化手段。v1消化培育法消化培育法(单细胞培育）单细胞培育）(三三)原代细胞培育类型原代细胞培育类型(1)准备：取各种已消毒的培育用品置于净化准备：取各种已消毒的培育用品置于净化台面，紫外线消毒台面，紫外线消毒20分钟；留意：组织块、分钟；留意：组织块、胰蛋白酶、培育液等易受紫外线损害的物品，胰蛋白酶、培育液等易受紫外线损害的物品，最好在培育时再携入操作野；如预先置入，最好在培育时再携入操作野；如预先置入，需用纸张覆盖，以免受射线影响；需用纸张覆盖，以免受射线影响；(2)处理组织：把组织块置入烧杯中，用处理组织：把组织块置入烧杯中，用Hanks液漂洗液漂洗23次，去除血污；如怀疑次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中合液中3060分钟；分钟；(3)剪切：用眼科剪把组织块切成剪切：用眼科剪把组织块切成23毫米大毫米大小的块小的块(用手术刀切割亦可用手术刀切割亦可)，以便于消化；，以便于消化；(4)消化消化：加入比组织块总量多：加入比组织块总量多3050倍的倍的胰胰蛋白酶液蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞；或用恒温水浴，或置瓶口或塞以胶塞；或用恒温水浴，或置)37温箱消化均可，消化中每隔温箱消化均可，消化中每隔20分钟应分钟应摇动一次，消化时间依组织块的大小和组织摇动一次，消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。的硬度而定。(5)分别：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管分别：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下视察，如组织已分散成细胞吸出少许消化液在镜下视察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，马上终止消化，随即通过适宜不锈团或单个细胞，马上终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块(必要时可接着必要时可接着进行消化进行消化)；低速；低速(5001000转分转分)离心消化液离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培育液分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培育液(如用如用其它酶或其它酶或EDTA等消化，需用等消化，需用Hanks液洗脱一两次液洗脱一两次后，再加入培育液后，再加入培育液)；(7)计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培育液调整后，分装入培育瓶中；大，再补加培育液调整后，分装入培育瓶中；对大多数细胞来说，对大多数细胞来说，pH要求在要求在7.27.4范围，范围，培育液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，培育液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用可用NaHCO3调整；调整；(8)培育：置入培育：置入36.5度度温箱培育；如用温箱培育；如用CO2温箱温箱培育，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽培育，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽(松口松口)堵塞，堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需更换新塞。纱布塞易生霉菌，每次换液时需更换新塞。2、组织块培育法、组织块培育法:v【程序】【程序】v(1)剪切：把组织小块剪切：把组织小块(1cm3)置入小烧杯或青霉素小瓶置入小烧杯或青霉素小瓶中，用中，用Hanks液漂洗液漂洗23次以去掉表面血污，吸净次以去掉表面血污，吸净Hanks液，用眼科剪反复剪切成液，用眼科剪反复剪切成lmm3块为止；块为止；v(2)摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置入培育瓶中；摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置入培育瓶中；用吸管弯头把组织小块摆布在培育瓶底上，小块相互距用吸管弯头把组织小块摆布在培育瓶底上，小块相互距离为离为0.5cm为宜，每一为宜，每一25ml培育瓶底可摆布培育瓶底可摆布2030块；块；v(3)轻轻翻转培育瓶，令瓶底向上；留意翻瓶时勿令组轻轻翻转培育瓶，令瓶底向上；留意翻瓶时勿令组织小块流淌，塞好瓶塞，置织小块流淌，塞好瓶塞，置36.5温箱温箱2小时左右小时左右(勿勿超过超过4小时小时)，使小块微干枯；，使小块微干枯；(4)培育：从温箱中取出培育瓶，开塞，培育：从温箱中取出培育瓶，开塞，46度斜度斜持培育瓶持培育瓶(瓶底仍向上瓶底仍向上)，向瓶底角部轻轻注入，向瓶底角部轻轻注入培育液少许，然后缓缓再把培育瓶翻转过来，培育液少许，然后缓缓再把培育瓶翻转过来，让培育液渐渐覆盖附于瓶底上的组织小块让培育液渐渐覆盖附于瓶底上的组织小块(组组织小块附着尚不牢，留意不要把组织块冲走织小块附着尚不牢，留意不要把组织块冲走)；置温箱中静止培育。待细胞从组织块游出数；置温箱中静止培育。待细胞从组织块游出数量增多后，再补加培育液。量增多后，再补加培育液。三、三、细胞计数细胞计数 一、原理一、原理 细胞计数结果细胞计数结果以细胞数以细胞数/毫升表示。细胞计数毫升表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相的原理和方法与血细胞计数相同。在细胞群体中总有一些因同。在细胞群体中总有一些因各种缘由而死亡的细胞，总细各种缘由而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。细胞活力。用台酚兰染细胞，死细用台酚兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。相对数和相对活力。二、仪器、用品与试剂二、仪器、用品与试剂1 1、仪器与用品：一般显微镜、血球计数板、试管、吸管、仪器与用品：一般显微镜、血球计数板、试管、吸管2 2、试剂：、试剂：0.40.4台酚兰台酚兰(台酚兰台酚兰 0.4 0.4克克 加双蒸水至加双蒸水至100ml)100ml)3 3、材材料料：细细胞胞悬悬液液(细细胞胞悬悬液液的的制制备备：用用毛毛吸吸管管吸吸5 5滴滴细细胞胞悬悬液液到到一一小小试试管管中中，加加入入1 1滴滴台台盼盼蓝蓝染染液液（0.40.4）或或苯苯胺胺黑黑，混混匀匀，静静置置2 23min,3min,活活细细胞胞不不会会被被染染色色，而而死死细细胞胞着着蓝蓝色色，这这样样加加入入染染液液后后就就可可以以在在显显微微镜镜下下区区分分活活细细胞和死细胞。胞和死细胞。)三、操作步骤三、操作步骤 1 1、将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，并将盖片盖、将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，并将盖片盖在计数板上。在计数板上。2 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充溢、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充溢盖片和计数板之间。盖片和计数板之间。3 3、静置、静置3 3分钟。分钟。4 4、镜下视察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只、镜下视察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：计左侧和上方的。然后按下式计算：（细胞悬液的细胞数）（细胞悬液的细胞数）/ml/ml （四个大格子细胞数四个大格子细胞数/4)/4)稀稀释倍数释倍数104/ml104/ml说明：说明：公式中除以公式中除以4 4因为计数了因为计数了4 4个大格的细胞数。个大格的细胞数。公式中公式中乘以乘以2 2于染液是于染液是1 1：1 1稀释。稀释。公式中乘以公式中乘以104104因为计数板因为计数板每一个大格的体积为：每一个大格的体积为：1.0mm1.0mm（长）（长）1.0mm1.0mm（宽）（宽）0.1mm0.1mm（高）（高）0.1mm3 0.1mm3 而而 1ml1ml1000mm3 1000mm3。四、细胞计数要点四、细胞计数要点1.1.要求悬液中细胞数目不低于要求悬液中细胞数目不低于104104个个/ml/ml，假如细胞数目很，假如细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培育液中；少要进行离心再悬浮于少量培育液中；2.2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数精确性。要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数精确性。3.3.取取样样计计数数前前，应应充充分分混混匀匀细细胞胞悬悬液液，尤尤其其时时多多次次取取样计样计数数时时更意每次取更意每次取样样都要混匀，以求都要混匀，以求计计数精确；数精确；4.4.数数细细胞胞的的原原则则是是只只数数完完整整的的细细胞胞，若若细细胞胞聚聚集集成成团团时时只只依依据据一一个个细细胞胞计计算算。假假如如细细胞胞压压在在格格线线上上时时，则则只只计计上上线线，不，不计计下下线线，只，只计计左左线线，不，不计计右右线线。5.5.操操作作时时，留留意意盖盖片片下下不不能能有有气气泡泡，也也不不能能让让悬悬液流入旁液流入旁边边槽中，否槽中，否则则要重新要重新计计数。数。五、初学者易犯的错误：五、初学者易犯的错误：1.1.计数前未将待测悬液吹打匀整。计数前未将待测悬液吹打匀整。2.2.滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。3.3.滴滴入入悬悬液液时时的的量量太太多多，至至使使细细胞胞悬悬液液流流入入旁旁 边的槽中。边的槽中。细胞计数原理细胞计数原理四、四、细胞冻存细胞冻存1原理：在不附加任何条件下干脆冻存细胞时，细原理：在不附加任何条件下干脆冻存细胞时，细胞内外环境中的水会结成冰晶，能导致细胞发生一胞内外环境中的水会结成冰晶，能导致细胞发生一系列变更，最终导致细胞死亡。但如向细胞培育液系列变更，最终导致细胞死亡。但如向细胞培育液中加入爱护剂甘油或二甲基亚矾中加入爱护剂甘油或二甲基亚矾(DMSO)，可使冰点，可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，可避开上述现象的发生。结前透出细胞外，可避开上述现象的发生。当前最常用的爱护剂仍为甘油和当前最常用的爱护剂仍为甘油和DMSO，它们对细，它们对细胞无毒、分子量小、溶解度大、易穿透细胞，运用胞无毒、分子量小、溶解度大、易穿透细胞，运用范围在范围在515之间，常用之间，常用10。2要点要点:为保持细胞最大存活率，为保持细胞最大存活率，一般都接受慢冻快融的方法。一般都接受慢冻快融的方法。各种细胞