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其次章其次章 分子克隆的工具酶分子克隆的工具酶 工具酶：进行工具酶：进行DNADNA操作常常要用到的操作常常要用到的“工具工具”酶酶工具酶工具酶（四大类）（四大类）核酸酶核酸酶 nucleases脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶 deoxyribonuclease 核糖核酸酶核糖核酸酶ribonuclease 外切酶外切酶exonuclease 单单链链外外切切酶酶 双双链链外外切切酶酶内切酶内切酶 endomuclease 限限制制性性内内切切酶酶 非非限限制制性性内内切切酶酶 连接酶连接酶ligase 聚合酶聚合酶polymerasepolymerase修饰酶修饰酶 modificationenzyme 有人也简洁的将它分为两类：限制酶和其他酶类：连接酶，聚合酶，核酸酶，激酶，磷酸酶。上述酶的分类不是确定的，因有的酶兼有数种功能，如：聚合酶有外切酶功能；内切酶有甲基化酶功能等。四大酶类大都是从细菌和phage中纯化出来的，它们原本参与细菌/phage自身DNA的复制、转录、降解外源入侵DNA分子、修复突变、重组等一系列生命活动，被纯化后用来在人工条件下进行体内类似的反应。第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶（restriction enzyme restriction enzyme）一、限制性内切核酸酶的发觉一、限制性内切核酸酶的发觉 1952 1952年年LuriaLuria、HumanHuman在在T T偶数噬菌体、偶数噬菌体、19531953年年weigleweigle、BertaniBertani在在 噬菌体对大肠杆菌的感染试验中发觉了细菌的噬菌体对大肠杆菌的感染试验中发觉了细菌的限制和修饰现象。正是对限制和修饰现象的深化探讨，导致限制和修饰现象。正是对限制和修饰现象的深化探讨，导致限制性内切核酸酶的发觉。限制性内切核酸酶的发觉。限制性内切酶：指能识别特定的限制性内切酶：指能识别特定的DNADNA序列，在确定的条件下，序列，在确定的条件下，可在识别位置上或旁边对可在识别位置上或旁边对DNADNA进行切割的酶。进行切割的酶。噬菌体在某一特定细菌宿主中生长的实力，取决于它最终噬菌体在某一特定细菌宿主中生长的实力，取决于它最终在其中繁殖的细菌是什么菌株。在其中繁殖的细菌是什么菌株。例如，将例如，将A噬菌体从一株大肠噬菌体从一株大肠杆菌转移到另外一株，其生长效率往往会减弱，对这两个菌株杆菌转移到另外一株，其生长效率往往会减弱，对这两个菌株的滴的滴定度可差好几个数量级。其次个菌株释放的噬菌体能百分定度可差好几个数量级。其次个菌株释放的噬菌体能百分之百再感染同类菌株，但是若先将它们感染原来的宿主菌，再之百再感染同类菌株，但是若先将它们感染原来的宿主菌，再将释放的子代噬菌体重新感染其次个菌株时，感染率要大大下将释放的子代噬菌体重新感染其次个菌株时，感染率要大大下降。此种现象即为宿主限制的限制作用降。此种现象即为宿主限制的限制作用(hostControlledrestriction)。用放射性同位素标记的噬菌体进行的试验结果表明，在受感染的宿主细胞中，噬菌体生长的限制伴有噬菌体DNA的快速降解，然而，用作繁殖噬菌体的感染宿主菌株并不导致类似的噬菌体DNA的降解。假如某一细菌细胞具有一种能选择性降解来自侵染病毒(或其他来源)的核酸酶，那么，它必需能将这种外来DNA同它自己的DNA区分开来，之所以能够如此，乃是通过宿主限制的修饰作用(host-controlled modification)。限制限制(restriction)作用是指细菌的限制性核酸酶对作用是指细菌的限制性核酸酶对DNA的的分解作用，限制一般是指对外源分解作用，限制一般是指对外源DNA侵入的限制。修饰侵入的限制。修饰(modification)作用是指细菌的修饰酶对于作用是指细菌的修饰酶对于DNA碱基结构变更碱基结构变更的作用的作用(如甲基化如甲基化)，经修饰酶作用后的，经修饰酶作用后的DNA可免遭其自身所具可免遭其自身所具有的限制酶的分解。有的限制酶的分解。到到20世纪世纪60年头中期，科学家推想细菌中有限制修饰系统年头中期，科学家推想细菌中有限制修饰系统(restrictionmodificationsystemR-Msystem)。该系统中。该系统中有作用于同一有作用于同一DNA的两种酶，即分解的两种酶，即分解DNA的限制酶和变更的限制酶和变更DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶，而且，这两种酶作用碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶，而且，这两种酶作用于同一于同一DNA的相同部位。一般说来，不同种的细菌或不同种的的相同部位。一般说来，不同种的细菌或不同种的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制-修饰系统。修饰系统。1968年，年，Meselson从从EcoliK株中分别出了第一个限制酶株中分别出了第一个限制酶EcoK，同年，同年Linn和和Aeber从从EcoliB株中分别到限制酶株中分别到限制酶EcoB。缺憾的是，由于缺憾的是，由于EcoK和和EcoB这两种酶的识别和切割位点不够这两种酶的识别和切割位点不够专一，在基因工程中意义不大。专一，在基因工程中意义不大。1970年，年，Smith和和Wilcox从流感嗜血杆菌中分别到一种限制从流感嗜血杆菌中分别到一种限制性酶，能够特异性地切割性酶，能够特异性地切割DNA，这个酶后来命名为，这个酶后来命名为Hind，这是第一个分别到的这是第一个分别到的类限制性内切核酸酶。由于这类酶的识类限制性内切核酸酶。由于这类酶的识别序列和切割位点特异性很强，对于分别特定的别序列和切割位点特异性很强，对于分别特定的DNA片段就具片段就具有特殊的意义。有特殊的意义。二二.限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名 与种类与种类 依据国际命名法，限制性内切核酸酶属于水解酶类。依据国际命名法，限制性内切核酸酶属于水解酶类。由于限制性酶的数量众多，而且越来越多，并且在同一种菌中由于限制性酶的数量众多，而且越来越多，并且在同一种菌中发觉几种酶。为了避开混淆，发觉几种酶。为了避开混淆，19731973年年Smith Smith 和和NathansNathans对内切对内切酶的命名提出建议，酶的命名提出建议，19801980年，年，RobertsRoberts对限制性酶的命名进行对限制性酶的命名进行分类和系统化。分类和系统化。限制性酶接受三字母的命名原则，即属名限制性酶接受三字母的命名原则，即属名+种名种名+株名的个一个首字母，再加上序号，株名的个一个首字母，再加上序号，A A、第一个字母大写，表示该酶来源的细菌属名的第一个字母第一个字母大写，表示该酶来源的细菌属名的第一个字母B B、其次、三个字母小写，表示该酶来源的细菌的种名的前其次、三个字母小写，表示该酶来源的细菌的种名的前2 2个字母个字母C C、第四个字母、第四个字母 大写大写 代表不同的变种代表不同的变种/品系品系 小写小写 代表不同的菌株和型代表不同的菌株和型 D D、最终罗马字母，代表同一菌株中不同的限制性内切酶、最终罗马字母，代表同一菌株中不同的限制性内切酶 属名属名属名属名种名种名种名种名株名株名株名株名HindIIIHindIIIH i nH i ndIIIdIIIHHaemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae d d嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d d株株株株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶留意限制性内切酶的正确写法：留意限制性内切酶的正确写法：1、前、前3个字母确定斜体个字母确定斜体2、字母与罗马数字间空格、字母与罗马数字间空格如：EcoR I Pst I特性特性I型型II型型III型型限制酶活性限制酶活性甲基化酶活性甲基化酶活性DNA的识别的识别切割特异性切割特异性随机，切割位随机，切割位点距识别序列点距识别序列1kb以上以上专一（特异位专一（特异位点上点上/附近）附近）距寄主特异性距寄主特异性位点位点3，端端2426bp处处对对ATP的依赖的依赖Mg2+S-腺苷腺苷产物产物异质，不均一异质，不均一专一片段，大专一片段，大小一致小一致异质，不均一异质，不均一三种类型限制性内切酶的特性比较三种类型限制性内切酶的特性比较 I类限制性内切核酸酶类限制性内切核酸酶I类限制性内切核酸酶的分子量较大类限制性内切核酸酶的分子量较大,一般在一般在30万道尔顿以万道尔顿以上上,通常由三个不同的亚基所组成。例如限制性酶通常由三个不同的亚基所组成。例如限制性酶EcoB是由是由R(135kD)，M(62kD)和和S(55kD)三种亚基组成的复合酶，这三个三种亚基组成的复合酶，这三个亚基分别由不同的基因编码。全酶的总分子量为亚基分别由不同的基因编码。全酶的总分子量为449kD,共共5个亚个亚基，其中基，其中R亚基和亚基和M亚基各两分子。亚基各两分子。类酶不仅是一种核酸内类酶不仅是一种核酸内切酶切酶,同时在酶分子上还具有甲基化酶和同时在酶分子上还具有甲基化酶和ATPase的活性，所以的活性，所以是具有多种酶活性的复合酶类。作用时除了须要是具有多种酶活性的复合酶类。作用时除了须要Mg2+作协助因作协助因子外子外,还要求还要求ATP和和S腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸(SAM)的存在。的存在。类酶具有类酶具有特异的识别序列，大约特异的识别序列，大约15个碱基对。个碱基对。类酶虽然能够在确定序列上识别类酶虽然能够在确定序列上识别DNA分子分子,并能同并能同DNA分子作用分子作用,因其识别因其识别DNA后后,要朝一个方向或两个方向移动一段要朝一个方向或两个方向移动一段距离距离(通常为通常为1000个碱基左右个碱基左右)，并且要形成一个环才能切割，并且要形成一个环才能切割DNA(图图),所以识别位点和切割位点不一样，产生的片段较大。所以识别位点和切割位点不一样，产生的片段较大。III类限制性内切核酸酶类限制性内切核酸酶III类限制性内切核酸酶也是基因工程中不常用的酶，分子量类限制性内切核酸酶也是基因工程中不常用的酶，分子量和亚基组成类似于和亚基组成类似于类酶类酶,作用方式基本同作用方式基本同类酶。如类酶。如EcoP1是由两个亚基组成，一个亚基是由两个亚基组成，一个亚基(M亚基亚基)负责位点识别和修饰。负责位点识别和修饰。另一个亚基另一个亚基(R亚基亚基)具有核酸酶的活性具有核酸酶的活性(图图3-5)。切割。切割DNA时须时须要要ATP,Mg2+,也能被也能被SAM激活，但并非必需。激活，但并非必需。类限制性内切核酸酶类限制性内切核酸酶这类酶的分子量较小这类酶的分子量较小.一般在一般在2-4万道尔顿万道尔顿,通常由通常由2-4个相同的亚基所个相同的亚基所组成。它们的作用底物为双链组成。它们的作用底物为双链DNA,极少数极少数类酶也可作用于单链类酶也可作用于单链DNA,或或DNA/RNA杂种双链。这类酶的专一性强杂种双链。这类酶的专一性强,它不仅对酶切点邻近的两个它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求碱基有严格要求,而且对更远的碱基也有要求而且对更远的碱基也有要求,因此因此,类酶既具有切割位类酶既具有切割位点的专一性点的专一性,也具有识别位点的专一性也具有识别位点的专一性,一般在识别序列内切割。切割的一般在识别序列内切割。切割的方式有平切和交织切方式有平切和交织切,产生平末端的产生平末端的DNA片段或具有突出粘性末端的片段或具有突出粘性末端的DNA片段片段(5或或3粘性末端粘性末端)。作用时须要。作用时须要Mg2+作协助因子作协助因子,但不须要但不须要ATP和和SAM。类酶与对应的甲基化酶在蛋白亚基上尚未发觉有什么关系类酶与对应的甲基化酶在蛋白亚基上尚未发觉有什么关系,第一第一个被分别的个被分别的类酶是类酶是Hind。三三.型核酸限制性内切酶的基本特性型核酸限制性内切酶的基本特性 与与I I型及型及IIIIII型核酸内切限制酶不同，型核酸内切限制酶不同，IIII型核酸内切酶只有一种型核酸内切酶只有一种多肽，并通常以同源二聚体形式存在。多肽，并通常以同源二聚体形式存在。1 1、基本特性、基本特性它具有三个基本特性：它具有三个基本特性：a.a.在在DNADNA分子双链的特异性识别序列部位，切割分子双链的特异性识别序列部位，切割DNADNA分子产生分子产生链的断裂；链的断裂；b.2b.2个单链断裂部位在个单链断裂部位在DNADNA分子上的分布，通常不是彼此干脆分子上的分布，通常不是彼此干脆相对的；相对的；c.c.因此，断裂的结果形成的因此，断裂的结果形成的DNADNA片段，也往往具有互补的片段，也往往具有互补的单链延长末端。单链延长末端。a.a.识别位点：识别位点：绝大多数的绝大多数的IIII型核酸内切限制酶，都能够识别由型核酸内切限制酶，都能够识别由4 48 8个核个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。而限制酶的识别序列。而IIII型限制酶就是从其识别序列内切割型限制酶就是从其识别序列内切割DNADNA分子的，因此识别序列又称为核酸内切限制酶的切割位点分子的，因此识别序列又称为核酸内切限制酶的切割位点或靶序列。或靶序列。有些识别序列是连续的有些识别序列是连续的(如如GATC)GATC)，有些识别序列则是间断的有些识别序列则是间断的(如如GANTC)GANTC)，N N是代表随意一种核苷酸是代表随意一种核苷酸碱基碱基切割位点的一个共同特点是，它们具有双重旋转对称的结构形切割位点的一个共同特点是，它们具有双重旋转对称的结构形式，换言之，这些核苷酸对的依次是呈回文结构。式，换言之，这些核苷酸对的依次是呈回文结构。这段序列有两个基本的特征，第一是能够在中间划一个对称轴，这段序列有两个基本的特征，第一是能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对，其次个特点是两条互补链的两侧的序列两两对称互补配对，其次个特点是两条互补链的55到到33的序列组成相同，即将一条链旋转的序列组成相同，即将一条链旋转180180度，则两条链度，则两条链重叠。重叠。b.切割类型切割类型检验了特别大量的试验事例之后发觉，由核酸内切限制酶的检验了特别大量的试验事例之后发觉，由核酸内切限制酶的作用所造成的作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是属于下述两种独特分子的切割类型，通常是属于下述两种独特的排列方式之一：的排列方式之一：（1）两条链上的断裂位置是交织地、但又是对称地围围着一个）两条链上的断裂位置是交织地、但又是对称地围围着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片片段；段；（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。片段。c.产生的末端特征：产生的末端特征：类限制性内切酶的切割产物有平末端和粘性末端类限制性内切酶的切割产物有平末端和粘性末端(cohesiveend)。粘性末端是指粘性末端是指DNA分子的两端具有彼此互补的一段突出的单分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分链部分,这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分假如互补的话，则能通过互补碱基之间的配对的单链部分假如互补的话，则能通过互补碱基之间的配对,形成形成双链。并在双链。并在DNA连接酶的作用下连接酶的作用下,使同一使同一DNA分子的两端连接成分子的两端连接成环状环状,或使两个分子连成一大的线状分子。或使两个分子连成一大的线状分子。已知有两种不同类型的限制酶都可以产生粘性末端，但一种是形已知有两种不同类型的限制酶都可以产生粘性末端，但一种是形成具有成具有3粘性末端，例如粘性末端，例如PstI酶就是属于这种类型；另一种则是酶就是属于这种类型；另一种则是形成具有形成具有5粘性末端，例如粘性末端，例如EcoRI酶便是此种类型的一个代表。酶便是此种类型的一个代表。粘性末端能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来，粘性末端能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来，平末端的平末端的DNA片段则不易于重新环化。片段则不易于重新环化。EcoEcoRIRI等产生的等产生的等产生的等产生的55粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端5G-C-T-5G-C-T-G-A-A-T-T-CG-A-A-T-T-C-G-A-G3-G-A-G33C-G-A-3C-G-A-C-T-T-A-A-GC-T-T-A-A-G-C-T-C5-C-T-C5EcoEcoRIRI37375G-C-T-5G-C-T-GG-OHOHPP-A-A-T-T-CA-A-T-T-C-G-A-G-G-A-G3 33C-G-A-3C-G-A-C-T-T-A-AC-T-T-A-A-PPOHOH-GG-C-T-C5-C-T-C5 退火退火退火退火4-74-75G-C-T-5G-C-T-GA-A-T-T-C-GA-A-T-T-C-G-A-G3G-A-G33C-G-A-3C-G-A-C-T-T-A-AGC-T-T-A-AG-C-T-C5-C-T-C5OHOHPPOHOHPPPst I等产生的3粘性末端5G-C-T-5G-C-T-C-T-G-C-A-GC-T-G-C-A-G-G-A-G3-G-A-G33C-G-A-3C-G-A-G-A-C-G-T-CG-A-C-G-T-C-C-T-C5-C-T-C5PstPstI37I37 5G-C-T-5G-C-T-C-T-G-C-AC-T-G-C-A-OHOHPP-G-G-G-A-G3-G-A-G33C-G-A-3C-G-A-G-G-PPOHOH-A-C-G-T-C-A-C-G-T-C-C-T-C5-C-T-C5退火退火退火退火4-74-75G-C-T-5G-C-T-C-T-G-C-AGC-T-G-C-AG-G-A-G3-G-A-G33C-G-A-3C-G-A-GA-C-G-T-CGA-C-G-T-C-C-T-C5-C-T-C5OHOHPPOHOHPPPvu II等产生的平头末端5G-C-T-5G-C-T-C-A-G-C-T-GC-A-G-C-T-G-G-A-G3-G-A-G33C-G-A-3C-G-A-G-T-C-G-A-CG-T-C-G-A-C-C-T-C5-C-T-C5Pvu Pvu IIII 37375G-C-T-5G-C-T-C-A-GC-A-G-OHOHPP-C-T-GC-T-G-G-A-G3-G-A-G33 3 C-G-A-C-G-A-G-T-CG-T-C-PP OHOH-G-A-CG-A-C-C-T-C 5 -C-T-C 5 2、限制性内切核酸酶的切割频率、限制性内切核酸酶的切割频率 切割频率是指限制性内切核酸酶在某切割频率是指限制性内切核酸酶在某DNADNA分子中预料的切点分子中预料的切点数。由于数。由于DNADNA是由四种类型的单核苷酸组成，假定是由四种类型的单核苷酸组成，假定DNADNA的碱基组的碱基组成是均以的，而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的，成是均以的，而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的，那么对于任何一种限制性内切核酸酶的切割频率，理论上应为那么对于任何一种限制性内切核酸酶的切割频率，理论上应为1/4n1/4n，n n表示该限制性内切核酸酶识别的碱基数。如识别表示该限制性内切核酸酶识别的碱基数。如识别4 4个碱个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每256256个碱基有一个识个碱基有一个识别序列和切点别序列和切点(1/44=1/256)(1/44=1/256)，识别，识别5 5个碱基的限制性内切核酸酶，个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每其切割频率应为每10241024个碱基有一个识别序列和切点，余下类个碱基有一个识别序列和切点，余下类推。推。事实上因事实上因DNADNA的分布是不均一的的分布是不均一的,且有大量的重复序列且有大量的重复序列,加上加上内切酶的切点具有内切酶的切点具有GCGC倾向倾向,所以实际的频率偏低。犹如是识别所以实际的频率偏低。犹如是识别6 6个碱基的限制性内切核酸酶，切割的频率相差很大个碱基的限制性内切核酸酶，切割的频率相差很大EcoRI EcoRI 4000;BamHI:6000;SalI:8000;HpaII:2004000;BamHI:6000;SalI:8000;HpaII:2003、同裂酶同裂酶(isoschizomers)来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为特称为同裂酶同裂酶(isoschizomers)(isoschizomers)。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。例如，限制酶同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。例如，限制酶HpaHpa和和Msp Msp I I是一对同裂酶，共同的靶子序列是是一对同裂酶，共同的靶子序列是CCGGCCGG。但是也有产生不同的切割但是也有产生不同的切割4、同尾酶同尾酶(isocaudamer)与同裂酶对应的一类限制性内切酶与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾特称为同尾酶。酶。常用的常用的BamHI,BclI,BglII,XhoI就是一组同尾酶。它们切割就是一组同尾酶。它们切割DNA之后都形成由之后都形成由-GATC-4个核苷酸组成的粘性末端，很明显，个核苷酸组成的粘性末端，很明显，由同尾酶所产生的由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆试验中很有用处。补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆试验中很有用处。由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”(hybrid site)。但必需指出，这类杂种位点的结构，一般是不再被原来的任何一种同尾酶所识别的。例如：Sal I（5-G TCGAC-3）和Xho I(5-C TCGAG-3)的消化片段相连，但所形成的重组片段（5-GTCGAG-3）则不能被上述2种酶的任一种酶识别和切割。但也有例外，可以被识别序列为4碱基的酶切。5 5、酶活性单位：、酶活性单位：1 1单位限制性内切酶（单位限制性内切酶（1 U1 U）通常定义：在建议运用的）通常定义：在建议运用的BufferBuffer及温度下，在及温度下，在20 20 l l（50 50 l l）反应体系中反应）反应体系中反应1 1小时，使小时，使1 1 g g入入DNADNA完全消化所需的酶量完全消化所需的酶量.6 6、星活性（、星活性（star ctivitystar ctivity）：在非最适的反应条件下，酶的识别特异性降低，产生非在非最适的反应条件下，酶的识别特异性降低，产生非特异性带，这种酶切特异性降低的现象，称为星活性。所谓特异性带，这种酶切特异性降低的现象，称为星活性。所谓非最适的反应条件：过量酶、低盐浓度、过量甘油、高非最适的反应条件：过量酶、低盐浓度、过量甘油、高pHpH（8.08.0以上）、有机溶剂以上）、有机溶剂exex：酒精（：酒精（EcoR IEcoR I对酒精敏感）、对酒精敏感）、SDSSDS、苯酚、氯仿等。、苯酚、氯仿等。四四.运用内切酶时应留意的事项运用内切酶时应留意的事项1、依据试验目的、片段长度（识别序列长，产生片段、依据试验目的、片段长度（识别序列长，产生片段长，基因的完整性好）、便利连接（粘性末端连接效长，基因的完整性好）、便利连接（粘性末端连接效益高、不同酶产生的粘性末端连接效率不同）来选择益高、不同酶产生的粘性末端连接效率不同）来选择正确的酶。正确的酶。2、酶的保存：、酶的保存：一般保存一般保存50%甘油，甘油，-20有霜冰箱有霜冰箱长期保存长期保存50%甘油，甘油，-70有霜冰箱有霜冰箱3 3、酶的运用：、酶的运用：A A、反应体积尽量保持最小（一般、反应体积尽量保持最小（一般20-5020-50l l），酶液的体积不超），酶液的体积不超过反应总体积的过反应总体积的10%10%，使甘油浓度小于，使甘油浓度小于5%5%，防止产生星活性；，防止产生星活性；B B、反应体系的成分中，酶最终加；、反应体系的成分中，酶最终加；C C、取出访用应放在冰上，用完后马上放回冰箱，尽量避开反复、取出访用应放在冰上，用完后马上放回冰箱，尽量避开反复冻融；冻融；D D、多样品酶切时，先计算总量，取出酶稀释后再分别加至各管；、多样品酶切时，先计算总量，取出酶稀释后再分别加至各管；F F、每次取酶必需运用新的无菌吸头。、每次取酶必需运用新的无菌吸头。G G、多种酶同时酶解时：可共用一种、多种酶同时酶解时：可共用一种bufferbuffer时，则两种酶的酶切时，则两种酶的酶切反应可同时进行；但如需不同的反应可同时进行；但如需不同的bufferbuffer时，则先低盐后高盐，时，则先低盐后高盐，假如对酶切效率影响不大，也可运用通用假如对酶切效率影响不大，也可运用通用bufferbuffer；假如难以同；假如难以同时进行，一般接受一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再时进行，一般接受一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。切。H H、酶切反应的终止：一般、酶切反应的终止：一般6565，1515后电泳，但是有些酶后电泳，但是有些酶6565不失活。如不失活。如EcoRVEcoRV，则要用酚氯仿抽提。，则要用酚氯仿抽提。I I、酶解后电泳分析体积过大时，可以用、酶解后电泳分析体积过大时，可以用2.52.5倍体积冷乙醇，在倍体积冷乙醇，在液氮中放置液氮中放置1515，如低盐，如低盐bufferbuffer，则还须补加，则还须补加3 mol/L NaAc3 mol/L NaAc至至1/101/10体积；也可用体积；也可用0.60.6体积的体积的5 mol/L 5 mol/L 乙酸胺和乙酸胺和2 2倍体积的乙醇，倍体积的乙醇，在冰上放置在冰上放置5 5分钟，然后于分钟，然后于44、12000g12000g，离心，离心5 5分钟；或分钟；或 0.1 0.1倍倍体积的体积的 5 M NaAc pH 5.4 5 M NaAc pH 5.4，2.52.5倍体积的冰冷乙醇，冰浴倍体积的冰冷乙醇，冰浴 5 5 分分钟、高速冷冻离心钟、高速冷冻离心1010分钟、风干。分钟、风干。五五.影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素1、DNA样品的纯度：样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等将影响等将影响DNA样品的纯度。样品的纯度。假如假如DNA样品难以纯化时，可以实行下列方法进行样品难以纯化时，可以实行下列方法进行酶切：酶切：加大酶的用量，加大酶的用量，1mgDNA用用10U酶酶(但是不但是不能超总体积能超总体积1/10加大反应总体积加大反应总体积延长反应时间延长反应时间 在有些在有些DNADNA制剂中，尤其是按微量碱法制备的，会含有少量制剂中，尤其是按微量碱法制备的，会含有少量的的DNaseDNase的污染。由于的污染。由于DNaseDNase的活性须要有的活性须要有Mg2+Mg2+的存在，而在的存在，而在DNADNA的贮存缓冲液中含有二价金属离子螯合剂的贮存缓冲液中含有二价金属离子螯合剂EDTAEDTA，因此在这种制，因此在这种制剂中的剂中的DNADNA仍旧是稳定的。然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液仍旧是稳定的。然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液之后，之后，DNADNA则会被则会被DNaseDNase快速地降解掉。要避开发生这种状况，快速地降解掉。要避开发生这种状况，唯一的方法就是运用高纯度的唯一的方法就是运用高纯度的DNADNA。2、DNA样品的甲基化程度：样品的甲基化程度：核酸内切限制酶是原核生物限制核酸内切限制酶是原核生物限制修饰体系的组成部分，修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会猛烈地影响因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会猛烈地影响酶的活性。酶的活性。为避开产生这样的问题，在基因克隆中运用的是失去甲基为避开产生这样的问题，在基因克隆中运用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。可以利用不同的限制性内切酶对甲基化敏感程度不同，探可以利用不同的限制性内切酶对甲基化敏感程度不同，探讨不同条件下讨不同条件下DNA的甲基化程度。的甲基化程度。3 3、缓冲液性质：、缓冲液性质：标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-Tris-HCl,-HCl,-巯基乙醇或二硫苏糖醇巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)(DTT)以及牛血清白蛋白（以及牛血清白蛋白（BSABSA）等。酶活性的正常发挥，是确定地须要二价的阳离子，通常是等。酶活性的正常发挥，是确定地须要二价的阳离子，通常是Mg2+Mg2+。不正确的。不正确的NaClNaCl或或Mg2+Mg2+浓度，不仅会降低限制酶的活性，浓度，不仅会降低限制酶的活性，而且还可能导致识别序列特异性的变更。而且还可能导致识别序列特异性的变更。缓冲液缓冲液TrisHClTrisHCl的作用在于使反应混合物的的作用在于使反应混合物的pHpH恒定在酶活恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。对绝大多数限制酶来说，性所要求的最佳数值的范围之内。对绝大多数限制酶来说，在在pH=7pH=74 4的条件下，其功能最佳。的条件下，其功能最佳。巯基试剂对于保持某些核酸内切限制酶的稳定性是有用的，巯基试剂对于保持某些核酸内切限制酶的稳定性是有用的，而且还可爱护其免于失活。但它同样也可能有利于潜在污染而且还可爱护其免于失活。但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。杂质的稳定性。有一部分核酸内切限制酶对于钠离子或钾离子浓度变更反有一部分核酸内切限制酶对于钠离子或钾离子浓度变更反应特别敏感，而另一部分核酸内切限制酶则可适应较广的离应特别敏感，而另一部分核酸内切限制酶则可适应较广的离子强度的变更幅度。子强度的变更幅度。高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的谓的Staractivity现象。现象。如如EcoRI在正常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但序列，但在甘油浓度超过在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割）时，也可切割5PuPuATPyPy3或或者者5AATT3。4 4、酶切反应的温度、酶切反应的温度 DNA DNA酶切反应的温度，是影响核酸内切限制酶活性的另酶切反应的温度，是影响核酸内切限制酶活性的另一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适反应一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数核酸内切限温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是制酶的标准反应温度都是3737。但也有很多例外的状况，它们要求但也有很多例外的状况，它们要求3737以外的其它反应以外的其它反应温度。其中有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的温度。其中有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的3737，例如，例如Sma ISma I是是3030。有些核酸内切限制酶的最适反应温度则高于标准的有些核酸内切限制酶的最适反应温度则高于标准的37，例如例如Mae I是是45、BclI是是50、MaelII是是55；还有些核酸内；还有些核酸内切限制酶的最适反应温度可高达切限制酶的最适反应温度可高达60以上。以上。消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。六六.酶切的方式：酶切的方式：1、完全酶切：内切酶在、完全酶切：内切酶在DNA上的全部识别位点都被切开。上的全部识别位点都被切开。2、不完全酶切：只有有限数量的酶切位点被切开，可以通过缩、不完全酶切：只有有限数量的酶切位点被切开，可以通过缩短保温时间、降低反应温度或削减酶的用量可达到局部消化的短保温时间、降低反应温度或削减酶的用量可达到局部消化的目的。目的。其次节其次节 连接酶（连接酶（ligase)ligase)一、连接酶的功能：一、连接酶的功能：1 1、间断修复功能、间断修复功能 概念概念 ：间断（间断（discontinuitydiscontinuity）：指）：指DNADNA的一条链上某一位置两个相的一条链上某一位置两个相邻的核苷酸之间的磷酸二脂键发生断裂。邻的核苷酸之间的磷酸二脂键发生断裂。缺口（缺口（nicknick）：指某一位置上丢失了一个或几个核苷酸。）：指某一位置上丢失了一个或几个核苷酸。2 2、连接功能、连接功能 ：将两个双链：将两个双链DNADNA连接在一起连接在一起 二、连接酶的作用机理与反应条件：二、连接酶的作用机理与反应条件：1 1、作用机理：、作用机理：（1 1）ATPATP（NAD+)NAD+)供应激活的供应激活的AMPAMP（2 2）ATPATP与连接酶形成共价与连接酶形成共价“连接酶连接酶-AMP”-AMP”复合物，并释放复合物，并释放出焦磷酸出焦磷酸PPiPPi。（3 3）AMPAMP与连接酶的赖氨酸与连接酶的赖氨酸e-e-氨基相连。氨基相连。（4）AMPAMP随后从连接酶的赖氨酸随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到氨基转移到DNADNA一一条链的条链的55端端P P上，形成上，形成“DNA-DNA-腺苷酸腺苷酸”复合物。复合物。（5 5）3-OH 3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMPAMP。2 2、反应条件、反应条件（1 1）必需是两条双链）必需是两条双链DNADNA，假如为粘性末端，末端必需配对。，假如为粘性末端，末端必需配对。（2 2）DNADNA的的33端有游离的端有游离的-OH-OH，55端有一个磷酸基团（端有一个磷酸基团（P P）。）。（3 3）须要能量：）须要能量：动物或噬菌体中：动物或噬菌体中：ATP ATP 大肠杆菌中：大肠杆菌中：NAD+NAD+三、连接酶的种类和特点三、连接酶的种类和特点 ：1 1、T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶 能够催化平末端和粘性末端的双链能够催化平末端和粘性末端的双链DNADNA分子间相互连接，加分子间相互连接，加入低浓度入低浓度PEGPEG（体积排阻剂）可提高溶液中大分子间的相互作用，（体积排阻剂）可提高溶液中大分子间的相互作用，促进连接。还可作用于促进连接。还可作用于RNARNA，但效率很低。，但效率很低。dNTP dNTP存在不抑制存在不抑制T4DNAT4DNA连接酶活性，该酶在全部连接酶活性，该酶在全部DNADNA限制酶限制酶bufferbuffer中均能很好起作用。中均能很好起作用。须要须要ATPATP。2 2、E.coli DNAE.coli DNA连接酶连接酶 ：作用于带上作用于带上55或或33突出末端的双链突出末端的双链DNADNA分子的连接（粘分子的连接（粘性末端连接）不能作用于平端（但现发觉在性末端连接）不能作用于平端（但现发觉在PEGPEG或或FicollFicoll等体等体积排阻剂存在下，由于排阻剂提高了积排阻剂存在下，由于排阻剂提高了DNADNA末端和酶的浓度，在末端和酶的浓度，在排阻剂存在下也可以连接平端排阻剂存在下也可以连接平端DNADNA，但效率较低），不能连接，但效率较低），不能连接RNARNA。须要须要