化工工业微生物.ppt

生物化学工程王雪青王雪青2004-9-141一些与化学和生物技术相关的网络资源索引一些与化学和生物技术相关的网络资源索引http:/hackberry.chem.niu.edu:20/Webpage,htmlhttp:/BicMedNet,comhttp:/web2生物化学工程第一章：绪论第一章：绪论第二章：工业微生物概论第二章：工业微生物概论第三章：灭菌技术第三章：灭菌技术第四章：氧的供需与传递第四章：氧的供需与传递第五章：生物反应器第五章：生物反应器第六章：微生物培养技术与动力学第六章：微生物培养技术与动力学第七章：动物细胞大规模培养技术第七章：动物细胞大规模培养技术第八章：植物细胞大规模培养技术第八章：植物细胞大规模培养技术第九章：生物物质分离与纯化第九章：生物物质分离与纯化第十章：生化生产工艺实例第十章：生化生产工艺实例3第一章第一章绪绪论论1.1生化工程的定义及其与生物工程的关系生化工程的定义及其与生物工程的关系生物化学工程简称生化工程（生物化学工程简称生化工程（biochemicalengineering)，是应用化学工程的原理和方法将生物工程的实验室成，是应用化学工程的原理和方法将生物工程的实验室成果进行工业开发的学科果进行工业开发的学科。它即可视为化学工厂的一个分。它即可视为化学工厂的一个分之，又可认为是生物工程的一个组成部分。是以应用基之，又可认为是生物工程的一个组成部分。是以应用基础研究为主，是走向产业化的必由之路。础研究为主，是走向产业化的必由之路。生物工程则是（生物工程则是（biotechnology，又称生物技术）是应用又称生物技术）是应用生物体（包括微生物，动物细胞，植物细胞）或其组成生物体（包括微生物，动物细胞，植物细胞）或其组成部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价值的产部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价值的产物，或进行有益的过程技术。以生命科学为基础。物，或进行有益的过程技术。以生命科学为基础。现代生物技术包括基因工程，细胞工程，酶工程，蛋白现代生物技术包括基因工程，细胞工程，酶工程，蛋白质工程和发酵工程质工程和发酵工程4生物反应器生物反应器检测控制系统检测控制系统细胞细胞酶酶（游游离离或或固固定定化）化）空气空气生生物物催催化化剂剂除菌除菌空气空气 能量能量提取精提取精制制产品产品副产品副产品废物废物原料原料基基质质或或培培养养基基营养物营养物灭菌灭菌生物反应过程示意图生物反应过程示意图下游过程生物反应过程(中游过程)上游过程5671.2生化工程发展简史生化工程发展简史传统的生物技术制品：传统的生物技术制品：如传统的发酵制品如传统的发酵制品,生产技术生产技术带有浓郁的地方性和经验性的特点带有浓郁的地方性和经验性的特点,设备简单设备简单.20世纪初世纪初,微生物产品有所发展微生物产品有所发展,但主要属于初级代谢但主要属于初级代谢产物产物,厌气发酵厌气发酵,设备也相对简单（乳酸，乙醇，丙酮）设备也相对简单（乳酸，乙醇，丙酮）。20世纪世纪40年代年代,抗生素的发展抗生素的发展,使生化工程诞生使生化工程诞生.特点特点是好气发酵是好气发酵,产物结构复杂产物结构复杂,次级代谢物次级代谢物,培养液含量培养液含量低低,无菌条件高无菌条件高.20世纪世纪50年代年代,氨基酸工业氨基酸工业,60年代年代:酶制剂酶制剂.70年代年代:干扰素干扰素,胰岛素胰岛素,生长激素生长激素,乙肝疫苗乙肝疫苗,单克隆抗体单克隆抗体.8我国现代生物技术产品年销售情况我国现代生物技术产品年销售情况我国现代生物技术产品年销售情况我国现代生物技术产品年销售情况910生物化工产品的特定产物和反应条件，决定了常规工业生物化工产品的特定产物和反应条件，决定了常规工业反应装置和分离纯化设备必须经过专门的设计和改进后反应装置和分离纯化设备必须经过专门的设计和改进后才能得以应用，新型高性能的生化反应器和高效分离纯才能得以应用，新型高性能的生化反应器和高效分离纯化设备、分离介质以及反应工艺及分离工艺的研制开发化设备、分离介质以及反应工艺及分离工艺的研制开发是生物化工产业开发的重点领域。生物化工是化学工业是生物化工产业开发的重点领域。生物化工是化学工业的前沿领域之一，在生物技术转化为生产力的过程中起的前沿领域之一，在生物技术转化为生产力的过程中起决定性的作用。在生物技术发展初期，生物化工的重要决定性的作用。在生物技术发展初期，生物化工的重要作用并没有得到足够的重视，随着生物技术产业的发展作用并没有得到足够的重视，随着生物技术产业的发展和化学工业结构和产品结构的调整，越来越多的生物技和化学工业结构和产品结构的调整，越来越多的生物技术产品极大地依赖生物化工技术才能实现规模化生产，术产品极大地依赖生物化工技术才能实现规模化生产，而且许多化学品的生产工艺有生物法取代，显示了很大而且许多化学品的生产工艺有生物法取代，显示了很大的优势。据美国和欧盟预测生物技术产业在未来的优势。据美国和欧盟预测生物技术产业在未来1010年内年内将增长将增长10-2010-20倍，生物化工产品在化学工业中的比重也倍，生物化工产品在化学工业中的比重也将提高一倍。将提高一倍。11目前生物化工的发展速度显然不能适应生物技术产目前生物化工的发展速度显然不能适应生物技术产业化的飞速发展。生物化工面临着改造传统产业和业化的飞速发展。生物化工面临着改造传统产业和发展生物高技术产业的双重任务。加强生物技术的发展生物高技术产业的双重任务。加强生物技术的研究开发，大力发展生物化工不仅是化学工业自身研究开发，大力发展生物化工不仅是化学工业自身发展的需要，也是生物技术产业化的保证。发展的需要，也是生物技术产业化的保证。121.3生化工程的基本内容生化工程的基本内容新型生物反应器的研究开发，特别是针对基因工程产新型生物反应器的研究开发，特别是针对基因工程产品和动、植物细胞培养的产品的投产研制新型生物反应品和动、植物细胞培养的产品的投产研制新型生物反应器。重点在于生物安全。植物细胞对剪切力和环境敏感器。重点在于生物安全。植物细胞对剪切力和环境敏感以及培养周期长而防止污染的问题。动物细胞的附壁生以及培养周期长而防止污染的问题。动物细胞的附壁生长的特点。长的特点。新新型型分分离离方方法法和和设设备备的的研研发发，特特别别是是针针对对蛋蛋白白质质、多多肽产品的分离。肽产品的分离。各各种种描描述述生生物物反反应应过过程程的的数数学学模模型型的的建建立立，将将有有利利于于过程的控制和优化以及计算机的应用。过程的控制和优化以及计算机的应用。生生物物反反应应器器内内重重要要参参数数的的传传感感器器的的研研制制和和有有关关计计算算机机控制系统硬件及软件的建立和完善。控制系统硬件及软件的建立和完善。13第二章第二章工业微生物学概论工业微生物学概论2.1工业生产中常见的微生物工业生产中常见的微生物细菌（细菌（bacteriabacteria）分布广，数量多，与人的关系密切。分布广，数量多，与人的关系密切。按其形态分为球菌、杆菌和螺旋菌按其形态分为球菌、杆菌和螺旋菌其其中中发发酵酵工工业业中中常常用用的的为为杆杆菌菌。包包括括醋醋酸酸杆杆菌菌属属（AcetobacterAcetobacter）,乳乳酸酸杆杆菌菌属属（LactobacillusLactobacillus）,芽芽孢孢杆杆菌菌属属（BacillusBacillus）,如如枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌（Bacillus Bacillus subtilissubtilis）可可生生产产-淀淀粉粉酶酶和和蛋蛋白白酶酶和和5-5-核核苷苷酸酸酶酶等等。梭梭菌菌属属（ClostridiumClostridium）如如丙丙酮酮丁丁醇醇的的梭梭状状芽芽孢孢杆杆菌菌（Clostridium Clostridium acetobutyliumacetobutylium）。大大肠肠杆杆菌菌（Escherichia Escherichia colicoli）：判判断断食食品品被被动动物物排排泄泄物物污污染染的的可可能能，公公共共卫卫生生的的重重要要指指标标。，在在工工业业上上利利用用大大肠肠杆杆菌菌的的谷谷氨氨酸酸脱脱羧羧酶酶进进行行谷谷氨氨酸酸定定量量分分析析。利利用用大大肠肠杆杆菌菌制制取取天天冬冬氨氨酸酸、苏苏氨氨酸酸和和缬缬氨氨酸酸。医医药药方方面面用用大大肠肠杆杆菌菌制制造造治治疗疗白白血血病病的的天天冬冬酰酰氨氨酶酶，基基因因工工程程菌菌。产产氨氨短短杆杆菌菌（BrevibacteriumBrevibacterium ammoniagenesammoniagenes）：短短杆杆菌菌属属，为为氨氨基酸、核苷酸和酶法生产辅酶基酸、核苷酸和酶法生产辅酶A A的菌种。的菌种。14Staphylococcus aureus152.1.2放线菌（放线菌（Actinomyces）因因菌落呈放射状而得名，大多数是腐生菌。介于细菌和霉菌呈长菌落呈放射状而得名，大多数是腐生菌。介于细菌和霉菌呈长的细丝，与霉菌相似，但宽度与细菌相似，无横隔，为单细胞，的细丝，与霉菌相似，但宽度与细菌相似，无横隔，为单细胞，菌丝无完整的核，为原核生物。土壤中含有菌丝无完整的核，为原核生物。土壤中含有104-106/g，有特有的有特有的土腥味。它的一大贡献是产生抗生素。不完全统计，目前，自然土腥味。它的一大贡献是产生抗生素。不完全统计，目前，自然界发现和分离了界发现和分离了5500种以上的抗生素，其中放线菌产生的有种以上的抗生素，其中放线菌产生的有4400多种。其中链霉菌属（多种。其中链霉菌属（Streptomyces）自自1942年，年，Waksman发现发现灰色链霉菌（产链霉素）相继发现了发酵工业中常用的有龟裂链灰色链霉菌（产链霉素）相继发现了发酵工业中常用的有龟裂链霉菌（生产土霉素），红链霉菌（产红霉素），金黄色链霉菌霉菌（生产土霉素），红链霉菌（产红霉素），金黄色链霉菌（产金霉素），委内瑞拉链霉菌（产氯霉素），卡那链霉菌（产（产金霉素），委内瑞拉链霉菌（产氯霉素），卡那链霉菌（产卡那霉素）。小单孢菌属（卡那霉素）。小单孢菌属（Micromonospora）不形成气生菌丝体，不形成气生菌丝体，在基内菌丝体上长出孢子梗，顶端着生一个球形、椭圆、或长形在基内菌丝体上长出孢子梗，顶端着生一个球形、椭圆、或长形的孢子。菌落常带有颜色。此属产抗生素的菌种有的孢子。菌落常带有颜色。此属产抗生素的菌种有30多种。如绛多种。如绛红小单胞菌和棘孢小单孢菌属都产（产庆大霉素）红小单胞菌和棘孢小单孢菌属都产（产庆大霉素）16单单细细胞胞，卵卵圆圆形形，圆圆形形或或圆圆柱柱形形。酵酵母母对对发发酵酵生生产产特特别别有有利利，自自古古酿酿制制含含酒酒饮饮料料，而而后后做做面面包包，发发馒馒头头，进进行行酒酒精精、甘甘油油的的生生产产，近近年年又又用用酵酵母母进进行行石石油油发发酵酵脱脱腊腊、生生产产各各种种有有机机酸酸。又又因因酵酵母母内内含含有有丰丰富富的的蛋蛋白白质质、维维生生素素和和各各种种酶酶，所所以以酵酵母母本本身身又又是是医医药药、化化工工和和食食品品工工业业中中的的重重要要原原料料。如如单单细细胞胞蛋蛋白白质质、酵酵母母片片、核核糖糖核核酸酸、核核苷苷酸酸、辅辅酶酶A、脂脂肪肪酸酸及及乳乳糖糖酶酶等等。酵酵母母的的繁繁殖殖通通常常以以芽芽殖殖为为主主。工工业业中中常常用用的的菌菌主主要要有有酿酿酒酒酵酵母母菌菌属属和和假假丝丝酵酵母母菌菌属属，前前者者用用于于酿酒，后者用于其他的发酵生产。酿酒，后者用于其他的发酵生产。2.1.3酵母菌酵母菌（yeast）17霉菌（霉菌（molds）凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌为霉菌。凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌为霉菌。在自然界中分布广，存在土壤、空气、水和生物体内外等处，喜在自然界中分布广，存在土壤、空气、水和生物体内外等处，喜偏酸性环境，多数为好氧性、多腐性，少数寄生。其繁殖能力强，偏酸性环境，多数为好氧性、多腐性，少数寄生。其繁殖能力强，以无性和有性孢子繁殖，生长方式以菌丝末端伸长和顶端分支。以无性和有性孢子繁殖，生长方式以菌丝末端伸长和顶端分支。霉菌是菌丝体结构，呈分支状，它既可以引起食品、衣服、粮食霉菌是菌丝体结构，呈分支状，它既可以引起食品、衣服、粮食及生活用品的霉烂，又可以用于发酵生产。例如远古时代，用霉及生活用品的霉烂，又可以用于发酵生产。例如远古时代，用霉菌作曲制酱；近代利用霉菌生产酒精、有机酸、抗生素、酶制剂、菌作曲制酱；近代利用霉菌生产酒精、有机酸、抗生素、酶制剂、维生素及激素等多种制品。发酵工业中常用的霉菌有曲霉属维生素及激素等多种制品。发酵工业中常用的霉菌有曲霉属（Aspergillus）如黑曲霉（生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、葡如黑曲霉（生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶）它的变异株可生产柠檬酸、葡萄糖酸、草酸和抗坏萄糖氧化酶）它的变异株可生产柠檬酸、葡萄糖酸、草酸和抗坏血酸），米曲霉含有多种酶类，糖化型淀粉酶和蛋白酶都较强主血酸），米曲霉含有多种酶类，糖化型淀粉酶和蛋白酶都较强主要用在酿酒的糖化曲和制酱油的酱油曲。黄曲霉，产生液化型的要用在酿酒的糖化曲和制酱油的酱油曲。黄曲霉，产生液化型的淀粉酶。但某些菌种产生黄曲霉毒素，特别在花生和花生饼粕上淀粉酶。但某些菌种产生黄曲霉毒素，特别在花生和花生饼粕上易形成，导致人蓄中毒或致癌。青霉属易形成，导致人蓄中毒或致癌。青霉属1929年年Fleming首先发现首先发现青霉素以来，一些典型的青霉菌如产黄青霉（产青霉素），展开青霉素以来，一些典型的青霉菌如产黄青霉（产青霉素），展开青霉（产灰黄霉素），根霉属（用于制曲和生产乳酸等）。青霉（产灰黄霉素），根霉属（用于制曲和生产乳酸等）。18SomefungiproduceantibioticsPenicillinwasthefirstantibiotictobediscovered19Aspergillus202.1.5其他微生物其他微生物：担担子子菌菌，即即菇菇类类微微生生物物，其其资资源源利利用用越越来来越越受受人人们们的的重重视视。如如多多糖糖，橡橡胶胶物物质质，抗抗癌癌药药物物的的开开发发“1，2-葡葡萄萄糖糖苷苷酶酶及及某某些些多多糖糖物物质质具具有有抗抗癌癌作作用用。：藻藻类类，是是分分布布最最广广的的自自养养微微生生物物。可可作作为为人人类类保保健健品品和和饲饲料料。培培养养螺螺旋旋藻藻60吨吨（GW）/公顷，大豆公顷，大豆4吨吨/公顷，是大豆的公顷，是大豆的28倍。倍。2.1.6噬菌体噬菌体凡凡用用细细菌菌和和放放线线菌菌为为生生长长菌菌株株的的发发酵酵工工业业，均均存存在在噬噬菌菌体体的的问题。问题。2122巨大螺旋蛋白质含量6570；含有多种维生素，VB12最丰富，富含八种必须氨基酸；螺旋藻多糖，多种微量元素，如铁、钾、钠、镁和钙等；含高量胡萝卜素，七是含高含量的gamma-linoleicacid(gamma-亚麻油酸)，可降低人体血脂；另外还含有大量的藻胆蛋白，这是一种能促进机体免疫系统功能增强的生物活性物质。由此可见，螺旋藻是一种高级营养食品，同时还是多种药品特别是保健药品的重要原料。23小球藻：繁殖能力强，利用太阳能生产蛋白质，占其胞重的50%，超过牛肉和大豆，另外还含有糖类、脂肪、维生素和矿物质以及一种生长因子，可促进儿童的生长发育和增强体质，用于食品或是食品添加剂。杜氏藻（盐藻)光能转化率高，生长繁殖快的单细胞藻。在条件适当的情况下，这种藻可大量合成胡萝卜素，从10公斤鲜藻内可获得1公斤-胡萝卜素，这比胡萝卜高出了500倍左右。由于-胡萝卜素抗氧化能力强，又是人体必需的最重要的活性物质，加上其资源极其丰富和易加工等特点，24PhagereproductivecycleFigure10.1CPhage attaches to bacterial cell.Phage injects DNA.Phage DNA directs host cell to make more phage DNA and protein parts.New phages assemble.Cell lyses and releases new phages.25目前在国际下备受关注，如澳大利亚、以色列和日本等国每年都生产出大量的杜氏藻粉，除进行深加工外还出口到世界种地。当前这种海洋生物技术也是许多国家竞争的热点。我国是海洋大国，海洋生物资源十分丰富，在即新的世纪，利用我们自身的这种优越的自然条件发展海洋生物技术，开发海洋生物新产品已刻不容缓。2627InternationalCultureCollectionsDomestically,strainscanbepurchasedfrom:CGMCCorChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京中关村28第三章第三章:灭菌技术灭菌技术3.1.灭菌的原理和方法灭菌的原理和方法3.2.培养基灭菌培养基灭菌3.3.空气灭菌空气灭菌生物生产过程是一个纯培养过程，必须保证在生产生物生产过程是一个纯培养过程，必须保证在生产的各个环节是无菌的的各个环节是无菌的(空气、培养基、管路和设备空气、培养基、管路和设备)293.1.灭菌的方法和原理灭菌的方法和原理.化学试剂灭菌法化学试剂灭菌法.电磁波、射线灭菌法电磁波、射线灭菌法.热灭菌法热灭菌法(干热、湿热和火焰灭菌法干热、湿热和火焰灭菌法).过滤除菌法过滤除菌法(阻留微生物，达到除菌的目的阻留微生物，达到除菌的目的)30常用化学消毒剂及其使用方法常用化学消毒剂及其使用方法消毒剂消毒剂用途用途常用浓度常用浓度使用方法使用方法1氧化剂：氧化剂：高锰酸钾高锰酸钾漂白粉漂白粉皮肤消毒皮肤消毒发酵工厂环境消毒发酵工厂环境消毒0.1-0.25%2-5%环环境境消消毒毒可可直直接用于粉体接用于粉体2醇类：醇类：乙醇乙醇皮肤及器物的消毒皮肤及器物的消毒70-75%器器物物消消毒毒浸浸泡泡30min3酚类：酚类：石碳酸石碳酸来苏尔来苏尔浸浸泡泡衣衣物物、擦擦拭拭房房间间桌桌面、喷雾消毒面、喷雾消毒皮肤、桌面、器械消毒皮肤、桌面、器械消毒1-5%3-5%4甲醛甲醛空气消毒空气消毒1-2%（10-15ml/m3）加热熏蒸加热熏蒸4h5铵盐铵盐新洁而灭新洁而灭皮肤、器械、环境消毒皮肤、器械、环境消毒0.1-0.25%浸泡浸泡30min常用化学消毒剂及其使用方法常用化学消毒剂及其使用方法31由于该方法灭菌与培养基中的一些成分发生反应，由于该方法灭菌与培养基中的一些成分发生反应，由于该方法灭菌与培养基中的一些成分发生反应，由于该方法灭菌与培养基中的一些成分发生反应，并且会残留在培养基中，所以只适合一些环境及器皿并且会残留在培养基中，所以只适合一些环境及器皿并且会残留在培养基中，所以只适合一些环境及器皿并且会残留在培养基中，所以只适合一些环境及器皿表面的消毒而不适合于培养基的灭菌。表面的消毒而不适合于培养基的灭菌。表面的消毒而不适合于培养基的灭菌。表面的消毒而不适合于培养基的灭菌。化学消毒剂方法的局限性化学消毒剂方法的局限性32.电磁波、射线灭菌法电磁波、射线灭菌法.1：原理：利用高能电磁波、紫外线或放射性物质产生原理：利用高能电磁波、紫外线或放射性物质产生的高能粒子可以起到灭菌的作用。的高能粒子可以起到灭菌的作用。波长在波长在(2.1-3.1)10(2.1-3.1)10-7-7 m m的紫外线的紫外线 表面或空表面或空气灭菌。气灭菌。波长在波长在(0.06-1.4)10(0.06-1.4)10-7-7 m m的的 X X 射线射线/射线射线(Co60)Co60)在在 工业上还少采用。工业上还少采用。穿透力差穿透力差设备投资高设备投资高33.热灭菌法热灭菌法.干热灭菌法：干热灭菌法：干热灭菌法：干热灭菌法：160160，1 1h h。使微生物体内的蛋使微生物体内的蛋使微生物体内的蛋使微生物体内的蛋白质发生氧化作用而死亡。用于实验器具和材白质发生氧化作用而死亡。用于实验器具和材白质发生氧化作用而死亡。用于实验器具和材白质发生氧化作用而死亡。用于实验器具和材料的灭菌。料的灭菌。料的灭菌。料的灭菌。湿热灭菌法：利用饱和蒸汽灭菌。使微生物体湿热灭菌法：利用饱和蒸汽灭菌。使微生物体湿热灭菌法：利用饱和蒸汽灭菌。使微生物体湿热灭菌法：利用饱和蒸汽灭菌。使微生物体内的蛋白质发生凝固作用而致死。内的蛋白质发生凝固作用而致死。内的蛋白质发生凝固作用而致死。内的蛋白质发生凝固作用而致死。由于蒸汽有很强的穿透力，冷凝时放出大量的由于蒸汽有很强的穿透力，冷凝时放出大量的由于蒸汽有很强的穿透力，冷凝时放出大量的由于蒸汽有很强的穿透力，冷凝时放出大量的潜热，来源方便，价格低廉，灭菌效果好，是潜热，来源方便，价格低廉，灭菌效果好，是潜热，来源方便，价格低廉，灭菌效果好，是潜热，来源方便，价格低廉，灭菌效果好，是目前最基本的适合培养基和设备的灭菌方法。目前最基本的适合培养基和设备的灭菌方法。目前最基本的适合培养基和设备的灭菌方法。目前最基本的适合培养基和设备的灭菌方法。一般条件为：一般条件为：一般条件为：一般条件为：121121，3030minmin。34利用过滤的方法截留微生物的方法。适合于澄利用过滤的方法截留微生物的方法。适合于澄利用过滤的方法截留微生物的方法。适合于澄利用过滤的方法截留微生物的方法。适合于澄清的液体和气体的除菌。工业上常用此法制备清的液体和气体的除菌。工业上常用此法制备清的液体和气体的除菌。工业上常用此法制备清的液体和气体的除菌。工业上常用此法制备大量的无菌空气，供好气性微生物的培养使用。大量的无菌空气，供好气性微生物的培养使用。大量的无菌空气，供好气性微生物的培养使用。大量的无菌空气，供好气性微生物的培养使用。火焰灭菌法：火焰灭菌法：火焰灭菌法：火焰灭菌法：利用火焰直接把微生物杀死。方法简单、灭菌利用火焰直接把微生物杀死。方法简单、灭菌利用火焰直接把微生物杀死。方法简单、灭菌利用火焰直接把微生物杀死。方法简单、灭菌彻底，但适用范围有限彻底，但适用范围有限彻底，但适用范围有限彻底，但适用范围有限.过滤除菌法：过滤除菌法：过滤除菌法：过滤除菌法：35363.2.培养基灭菌培养基灭菌培养基中含有丰富的营养，工业化生产中，体积大，生产的时间长，很易受到杂菌的污染。工业上常采用湿热灭菌的方法。灭菌的要求：工业上无菌（灭菌度为1000）。即尽可能的出去杂菌的同时，还要尽可能的减收营养物的损失。常采用的条件为：121，20-30min。3.2.1：灭菌的基本理论灭菌的基本理论（一）微生物的死亡动力学一）微生物的死亡动力学A:对数残存定律：微生物受热死亡的主要原因是高热能使蛋白质变性，这种反应可认为是单分子反应，死亡速率可视为一级反应，即与残存的微生物数量成正比，37式中式中N经时间经时间t后残存的活菌浓度（个后残存的活菌浓度（个/L)，N0开始灭菌时原有活菌浓度（个开始灭菌时原有活菌浓度（个/L)；t灭菌时间（灭菌时间（s,min）K灭菌速率常数或比死亡速率常数（灭菌速率常数或比死亡速率常数（s-1,min-1）它的大小与微生物的它的大小与微生物的种类种类和加热和加热温温度度有关。在同等温度下，其值小，微生物的有关。在同等温度下，其值小，微生物的耐热性强。耐热性强。从上式得出：从上式得出：t,N之间的关系为对数之间的关系为对数t=（2.303/K）(N0/N)38式中N/N0,菌体存活率，而N0/N，为灭菌度。B:非对数死亡规律非对数死亡规律：对于耐热性的微生物芽孢，其死亡不符合对数规律。具有代表性的模型为Prpkop&Humphey提出的“菌体循序死亡模型”。认为：芽孢的死亡是渐进的。有耐热的芽孢（R型）转变为死亡的芽孢(D型），需经过敏感的中间过程（S型）。NRNSNDKRKS39dNs/dt=KRNRKSNSdNR/dt=KRNR解为：解为：N/N0=KR/(KRKS)exp(KSt)KS/KRexp(KRt)当温度在当温度在120时，接近一级反应规律时，接近一级反应规律从以上可以看出：达到彻底的无菌，灭菌的时从以上可以看出：达到彻底的无菌，灭菌的时间为无限长。因此，工程设计以工业无菌为准。间为无限长。因此，工程设计以工业无菌为准。（二）温度对死亡速率常数（二）温度对死亡速率常数K值的影响值的影响：温度可以影响反应速度常数。其关系用温度可以影响反应速度常数。其关系用Arrhenius方程表示方程表示:K=Aexp(E/RT)4041式中：式中：A常数（常数（s-1ormin-1)；R气体常数，气体常数，8.314J/molK;T绝对温度，绝对温度，K;E微生微生物死亡活化能，物死亡活化能，J/mol.K=A(E/RT).dK/dT=E/RT2.从（从（2）式看出：）式看出：E大，大，K对对T的变化率越的变化率越大，即对温度变化敏感。大，即对温度变化敏感。培养基中的热灭菌既要杀死杂菌，又要保存其培养基中的热灭菌既要杀死杂菌，又要保存其中的有效成分，因而研究热对营养物质的影响中的有效成分，因而研究热对营养物质的影响是十分必要的是十分必要的42（三）温度对营养物质分解破坏速率常数（三）温度对营养物质分解破坏速率常数K的影的影响响同样是为一级反应：同样是为一级反应：dC/dt=KC其中：其中：C培养基内易被破坏成分的浓度培养基内易被破坏成分的浓度mol/L;t灭菌时间（灭菌时间（min,s);K分解速度常数。分解速度常数。而且而且K同样受到温度的影响，同样受到温度的影响，符合符合Arrhenius方方程，即有：程，即有：K=A(E/RT).dK/dT=E/RT2.43当培养基温度从当培养基温度从T1升至升至T2时：时：对微生物其死亡速度常数的得比值对微生物其死亡速度常数的得比值K2/K1=exp(E/R)(1/T21/T1)(K2/K1)=(E/R)(1/T21/T1).(3)同理：对培养基中的营养物质同理：对培养基中的营养物质(K2/K1)=(E/R）(1/T2-1/T1)(4)(3)/(4)得：得：(K2/K1)/(K2/K1)=E/E(5)从从(5)中看出，活化能大，反应速度常数变化程度中看出，活化能大，反应速度常数变化程度也大。也大。44细胞芽孢和热敏性营养物的活化能细胞芽孢和热敏性营养物的活化能细细菌菌芽芽孢孢和和营养物营养物E(J/mol)细菌芽孢和营养物细菌芽孢和营养物E(J/mol)叶酸叶酸维生素维生素B12维生素维生素B1维生素维生素B270340963009211498813葡萄糖葡萄糖嗜热脂肪芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌肉毒梭菌肉毒梭菌100488283460318210343300判断采用高温或是在低温条件下杀菌是由该反应的判断采用高温或是在低温条件下杀菌是由该反应的活化能的大小决定。灭菌温度升高时，微生物杀死活化能的大小决定。灭菌温度升高时，微生物杀死速率的提高要超过营养成分破坏的速率。在灭菌度速率的提高要超过营养成分破坏的速率。在灭菌度相同的条件下，相同的条件下，Kt=常数，因而高温常数，因而高温K值增大，时值增大，时间必定大大缩短，营养物质总的损失可以减少，因间必定大大缩短，营养物质总的损失可以减少，因此高温短时灭菌比低温长时要好。此为灭菌动力学此高温短时灭菌比低温长时要好。此为灭菌动力学得出的最重要的结论之一。得出的最重要的结论之一。45例例1：当杀菌温度从：当杀菌温度从120升至升至150，试计算维生素，试计算维生素B1的分解速率常数的分解速率常数KB和嗜热脂肪芽孢杆菌的死亡速和嗜热脂肪芽孢杆菌的死亡速率常数率常数KS。已知已知ES=283460J/mol,As=1.061036(min-1)；EB=92114J/mol,AB=1.061010(min-1)解：解：由（由（1）式，即）式，即K=A(E/RT)得得Ks=AsES/(2.303RT)Ks在在120时为时为0.024(min-1)150时为时为11.12(min-1)灭菌速率常数提高灭菌速率常数提高463倍。倍。同样地：同样地：KB在在120时为时为0.055(min-1)，150时为时为0.404(min-1)，同样的温度变化仅提高同样的温度变化仅提高7.3倍倍46解：因营养物质的损失为一级反应；解：因营养物质的损失为一级反应；固有固有C/C0=Kt=0.418C/C0=0.658B1的损失（的损失（C00.658C0)/C0=0.342例例2：在：在120时灭菌时灭菌7.6min,计算维生素计算维生素B1的的损失度。已知损失度。已知K=0.055(1/min)。47483.2.2：影响灭菌的因素：影响灭菌的因素培养基成分：影响微生物的耐热性。培养基成分：影响微生物的耐热性。培养基的物理状态：导热方式培养基的物理状态：导热方式培养基的培养基的pH培养基中的微生物量。培养基中的微生物量。N正比于正比于N0微生物细胞中的水含量。水微生物细胞中的水含量。水微生物细胞菌龄微生物细胞菌龄微生物的耐热性，细菌芽孢最耐热微生物的耐热性，细菌芽孢最耐热空气排出情况空气排出情况泡沫：热量传递难泡沫：热量传递难避免突然进汽或加大避免突然进汽或加大排气。排气。搅拌搅拌M失活易493.2.3灭菌操作灭菌操作一、间歇灭菌一、间歇灭菌（一）、间歇灭菌（一）、间歇灭菌又称实罐灭菌，将配置好的培养基放在发酵罐又称实罐灭菌，将配置好的培养基放在发酵罐中或其它装置中，通入蒸汽将培养基和所用的中或其它装置中，通入蒸汽将培养基和所用的设备一起进行灭菌的过程。此法对设备要求简设备一起进行灭菌的过程。此法对设备要求简单，灭菌可靠，无需专门的灭菌设备，投资少，单，灭菌可靠，无需专门的灭菌设备，投资少，是中小型工厂厂采用的一种方法。是中小型工厂厂采用的一种方法。分为三个阶段：升温、保温和冷却。分为三个阶段：升温、保温和冷却。50培培养养基基间间歇歇灭灭菌菌过过程程中中的温度变化的温度变化加热加热保温保温冷却冷却（二）间歇灭菌的计算（二）间歇灭菌的计算升温阶段：采用间接加升温阶段：采用间接加热（夹套、蛇管）；直热（夹套、蛇管）；直接加热（在培养基中直接加热（在培养基中直接通入蒸汽）；或二者接通入蒸汽）；或二者同时进行的加热方式。同时进行的加热方式。51由微生物死亡动力学公式由微生物死亡动力学公式dN/dt=KNK=Aexp(E/RT)总总=N0/N=0tAexp(E/RT)dtN0/N=(N0/N1)(N1/N2)(N2/N)=(N0/N1)+(N1/N2)+(N2/N)=加加+保保+冷冷52在加热或冷却工程中在加热或冷却工程中,温度随时间而发生改变，温度随时间而发生改变，加加=Aexp(E/RT)dt关系式复杂，积分困难，关系式复杂，积分困难，目前可用目前可用Richards简易算法算出。其认为当温度简易算法算出。其认为当温度超过超过100后，才能具有杀灭微生物的作用，并后，才能具有杀灭微生物的作用，并且随着温度的升高，该作用也随之增大。据此他且随着温度的升高，该作用也随之增大。据此他以嗜热脂肪芽孢杆菌为指示菌，在每分钟升高以嗜热脂肪芽孢杆菌为指示菌，在每分钟升高1的条件下，在不同温度下的的条件下，在不同温度下的(N0/N1)，并汇并汇总于表（总于表（p84)加加=查表查表升至恒温的时间升至恒温的时间/(恒温温度恒温温度-100)冷冷=查表查表降温的时间降温的时间/(开始降温温度开始降温温度-100)53例例3:培养基在培养基在30min内从内从100升至升至121，或，或在在17min内从内从121冷却至冷却至100，Richards简简便方法计算便方法计算加加和和冷冷?解：解：在在1/min条件下，培养基从条件下，培养基从120121，加加为为12.549，加加=查表查表升至恒温的时间升至恒温的时间/(恒温温度恒温温度-100)加加=12.54930/21=17.93冷冷=查表查表降温的时间降温的时间/(开始降温温度开始降温温度-100)同理同理:冷冷=12.54917/21=10.1654例例4:若某发酵液中原含活菌若某发酵液中原含活菌1011个个,灭菌后的活灭菌后的活菌数为菌数为10-3个个,且发酵液在且发酵液在16min内从内从100被加被加热到热到121，之后，在此温度下保温，之后，在此温度下保温tmin，接接着，发酵液再在着，发酵液再在17min内从内从121冷却到冷却到100，求所需保温时间，求所需保温时间t。已知已知121的的K=2.54min-1解：发酵液在杀菌前后体积不变总总=N0/N=1011/10-3=1014=32.2加加=12.54916/21=9.56冷冷=12.54917/21=10.16又又总总=加加+保保+冷冷保保=32.2-9.56-10.16=12.4855保保=0tAexp(E/RT)dt=Ktt=保保/K=12.48/2.54=4.91(min)升温阶段对灭菌的贡献升温阶段对灭菌的贡献加加/总总=9.56/32.2=0.29降温阶段对灭菌的贡献降温阶段对灭菌的贡献冷冷/总总=10.16/32.2=0.31从上例说明升温和冷却阶段对整个灭菌过程来从上例说明升温和冷却阶段对整个灭菌过程来说，效果十分可观。说，效果十分可观。一般地加加/总总占0.2，而冷冷/总总占0.05，保温阶段保保/总总占0.7556二、培养基的连续灭菌将配置好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温、和冷却而进行灭菌。连续灭菌可在短时间内加热到保温的温度，并且能很快地冷却，因此可在比间歇灭菌更高的温度下进行灭菌，有利于减少营养物质的损失。培养基连续灭菌过程中的温度的变化1、基本流程57配料罐将培养基预热60-70，防止培养基在杀菌时料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。连消塔（加热塔）使培养基迅速（20 s)升温（126-132）。维持罐：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。2-7min.冷却管：将培养基迅速冷却到40-50，输送到灭菌后的发酵罐内582、喷射加热连续灭菌流程593、薄板换热器连续灭菌流程作业：P90;1;3;6603.3.空气灭菌空气灭菌好氧微生物在发酵过程中需氧。而空气中夹带有大量的各类杂菌，因而在培养系统通入空气之前须除菌。生产中应用的无菌空气认为10-3。一般空气中的含量103-104个/m3,菌体的平均尺寸为0.6m。3.3.1空气灭菌的方法空气灭菌的方法空气中微生物种类：包括细菌、细菌和霉菌孢子，酵母菌和病毒。研究其分布情况有利于选取良好的取风位置和提高空气除菌效率。数量与环境温度和湿度有关。城市中空气微生物的含量大于农村和山区的地面空气微生物的含量大于高空中的。潮湿温暖的南方地区微生物的含量大于干燥寒冷的北方地区。尘埃数量与微生物量呈线性关系（y=0.003x-2.6)61热灭菌法热灭菌法Decker等发现悬浮于空气中的细菌孢子在218，24 24 s s内内可被杀死。利用空气压缩时温度升高来杀死微生物热灭菌方法（属于干热灭菌)。压力与温度的关系为T2=T1(P2/P1)(m-1)/m式中,T1,T2分别是空气压缩前后的温度,K;P1,P2分别是压缩前后的的空气压力，Pa;m多变指数，1.25。实际工艺所采用进口空气温度T1=60-70,P2/P1=6,则出口温度达到200以上（203-217），即可达到灭菌的目的。该方法已成功地应用在丙酮、丁醇、淀粉酶和2，3 丁二醇的发酵生产。其工艺流程为6263辐射灭菌和化学灭菌法在发酵工业上大规模辐射灭菌和化学灭菌法在发酵工业上大规模的制备无菌空气尚待经一步研究的制备无菌空气尚待经一步研究.静电除菌法静电除菌法使空气中的微粒（水雾、油雾、尘埃和微生物）使空气中的微粒（水雾、油雾、尘埃和微生物）在静电场的作用下会被电离成带电微粒，然后将在静电场的作用下会被电离成带电微粒，然后将其铺集在电极上。对其铺集在电极上。对1的微粒去除率高达的微粒去除率高达99%，耗电量小，