第十四章基因重组和基因工程.pptx
目录目录生物化学考试前答疑生物化学考试前答疑时间：本周四、周五进行。时间：本周四、周五进行。地点：生化楼地点：生化楼具体安排请到生化楼看通知。具体安排请到生化楼看通知。目录目录 DNA重组和重组重组和重组DNA技术技术DNARecombinationandRecombinantDNATechnology第第2121章章目录目录第一节第一节自然界自然界DNA重组和基因转移重组和基因转移是经常发生的是经常发生的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature目录目录nDNA的特性：保守性，变异性，流动性的特性：保守性，变异性，流动性nDNA重组是指不同的重组是指不同的DNA分子断裂并连接，从分子断裂并连接，从而产生而产生DNA片段的交换并构成新的片段的交换并构成新的DNA分子的分子的过程。过程。目录目录DNA重组重组接合作用接合作用(conjugation)转化作用转化作用(transformation)转导作用转导作用(transduction)转转 座座(transposition)同源重组同源重组(homologous recombination)位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination)目录目录发发生生在在同同源源序序列列间间的的重重组组称称为为同同源源重重组组(homologous recombination)，又又称称基基本本重重组组（general recombination）。是是最最基基本本的的DNA重重组组方方式式，通通过过链链的的断断裂裂和和再再连连接接，在在两两个个DNA分分子子同同源源序序列列间间进进行行单单链链或或双双链片段的交换。链片段的交换。以以E.coli的的同同源源重重组组为为例例，了了解解同同源源重重组组机机制的制的Holliday模型。模型。一、同源重组是最基本的一、同源重组是最基本的DNA重组方式重组方式目录目录nHolliday模型的模型的4个关键步骤：个关键步骤：两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐；排列整齐；一个一个DNA的一条链断裂；的一条链断裂；53535353 内切酶内切酶(recBCD)5353535353目录目录3553535353535353分支迁移分支迁移 (recA)通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNA；目录目录53335353 内切酶内切酶(recBCD)DNA 连接酶连接酶53535353Holiday中间体中间体Holliday中间体切开并修复，形成两个双链中间体切开并修复，形成两个双链重组体重组体DNA，分别为：，分别为：片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant)目录目录 内切酶内切酶(recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA)内切酶内切酶(recBCD)DNA 连接酶连接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday中间体中间体53535353目录目录片段重组体片段重组体：重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本一亲本DNA。拼接重组体拼接重组体：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本链区的两侧来自不同亲本DNA。Holiday中间体中间体535353535535533335555333355553335555333355553333内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC)DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体目录目录二、细菌的基因转移与重组有四种方式二、细菌的基因转移与重组有四种方式（一）接合作用（一）接合作用当当细细胞胞与与细细胞胞、或或细细菌菌通通过过菌菌毛毛相相互互接接触触时时，质质粒粒DNA从从一一个个细细胞胞（细细菌菌）转转移移至至另另一一细细胞胞（细细菌菌）的的DNA转转移移称称为为接接合作用合作用(conjugation)。目录目录可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F factor)细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。分子。质粒质粒目录目录（二）转化作用（二）转化作用通通过过自自动动获获取取或或人人为为地地供供给给外外源源DNA，使使细细胞胞或或培培养养的的受受体体细细胞胞获获得得新新的的遗遗传传表表型型，称称为为转转化化作作用用(transformation)。目录目录例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。目录目录（三）转导作用（三）转导作用当当病病毒毒从从被被感感染染的的（供供体体）细细胞胞释释放放出出来来、再再次次感感染染另另一一（供供体体）细细胞胞时时，发发生生在在供供体体细细胞胞与与受受体体细细胞胞之之间间的的DNA转转移移及基因重组即为及基因重组即为转导作用转导作用(transduction)。目录目录噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)目录目录三、位点特异重组，即特异位点间三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合发生的整合位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination)是由整合酶催化，在两个是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异序列的特异位点间发生的整合。位点间发生的整合。目录目录噬噬菌菌体体的的整整合合酶酶识识别别噬噬菌菌体体和和宿宿主主染染色体的特异靶位点发生选择性整合；色体的特异靶位点发生选择性整合；细细菌菌附附着着位位点点(attB)和和噬噬菌菌体体附附着着位位点点(attP)都都含含有有相相同同的的核核心心序序列列，称称为为O区区，该区由该区由15bp组成：组成：5GCTTTTTTATACTAA3 3CGAAAAAATATGATT5（一）（一）噬菌体噬菌体DNA的整合的整合目录目录目录目录反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒录病毒cDNA的的长末端重复序列长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)。目录目录（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组沙门菌沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。片段倒位决定鞭毛相转变。目录目录hix为为反反向向重重复复序序列列，它它们们之之间间的的H片片段段可可在在Hin控控制制下下进进行行特特异异位位点点重重组组(倒倒位位)。H片片段段上上有有两两个个启启动动子子P，其其一一驱驱动动hin基基因因表表达达，另另一一正正向向时时驱驱动动H2和和rH1基基因因表表达达，反反向向(倒倒位位)时时H2和和rH1不不表表达达。rH1为为H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。目录目录 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重组酶重组酶转位片段转位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA启动序列启动序列H1启动序列启动序列沙门菌沙门菌H H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变目录目录（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排免免疫疫球球蛋蛋白白(Ig)，由由两两条条轻轻链链(L链链)和和两两条条重重链链(H链链)组组成成，分分别别由由三三个个独独立立的的基基因因族族编编码码，其中两个编码轻链其中两个编码轻链(和和)，一个编码重链。，一个编码重链。轻链的基因片段：轻链的基因片段：重链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V D J C 重重链链(IgH)基基因因的的V-D-J重重排排和和轻轻链链(IgL)基基因因的的V-J重重排排均均发发生生在在特特异异位位点点上上。在在V片片段段的的下下游游，J片片段段的的上上游游以以及及D片片段段的的两两侧侧均均存存在在保保守守的的重重组组信信号号序序列列(recombination signal sequence,RSS)。此此重重排排的的重重组组酶酶基基因因rag(recombination activating gene)共共有有两个，分别产生蛋白质两个，分别产生蛋白质RAG1和和RAG2。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段V片段片段J片段片段RSSRSS间插间插DNAOHOHVJ单链切开单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应分子内转酯反应单链切开单链切开转移核苷酸转移核苷酸修复、连接修复、连接免疫球蛋白基因重排过程免疫球蛋白基因重排过程目录目录四、转座重组四、转座重组由由插插入入序序列列和和转转座座子子介介导导的的基基因因移移位位或或重重排称为排称为转座转座(transposition)。大多数基因在基因组内的位置是固定的，大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的置。这些可移动的DNA序列包括插入序序列包括插入序列和转座子。列和转座子。目录目录插入序列插入序列(IS)(IS)是从细菌的乳糖操纵子中是从细菌的乳糖操纵子中发现了一段自发的插入序列，阻止了被发现了一段自发的插入序列，阻止了被插入的基因的转录，所以称为插入序列插入的基因的转录，所以称为插入序列(IS)(IS)。转座是罕见事件，与自发突变率处于同转座是罕见事件，与自发突变率处于同一数量级，约为每代一数量级，约为每代1010-6-6一一1010-7-7。目录目录 插入序列插入序列(insertion sequences,IS)组成：组成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列转座（一）插入序列转座二个分离的反向重复二个分离的反向重复(inverted repeats,IR)序列序列特有的正向重复序列特有的正向重复序列一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因目录目录插入序列发生转座的形式：插入序列发生转座的形式：保守性转座保守性转座(conservative transposition)复制性转座复制性转座(duplicative transposition)插入序列的复制性转座插入序列的复制性转座目录目录转座子转座子(transposons)可从一个染色体可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposase Gene有用基因有用基因（二）转座子转座（二）转座子转座转座子组成：转座子组成：反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因目录目录 细菌的可流动性元件细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示箭头所示)B转座子转座子Tn3：含有转座酶、：含有转座酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L目录目录由转座子介导的转座由转座子介导的转座目录目录第二节第二节重组重组DNA技术技术又称又称DNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 目录目录技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）克隆克隆(clone):源于希腊文源于希腊文klone，原意是指以，原意是指以无性繁殖无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物。或营养繁殖的方式培育植物。一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念（一）（一）DNA克隆克隆目录目录应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将目目的的片片段段与与载载体体DNA连连接接，形形成成成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的重重组组DNA分分子子，继继而而在在宿宿主主细细胞胞进进行行复复制制、扩扩增增，从从而而获获得得大大量量同同一一DNA分分子子，也也称称基基因因克克隆隆或或重组重组DNA(recombinant DNA)。DNA克隆克隆 目的：目的：分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）目录目录 工具酶工具酶目的目的DNA片段片段载体载体DNA宿主细胞宿主细胞DNA克隆的基本要素克隆的基本要素重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基目录目录限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)限限 制制 性性 核核 酸酸 内内 切切 酶酶(restriction endonuclease,RE)是是识识别别DNA的的特特异异序序列列,并并在在识识别别位位点点或或其其周周围围切切割割双双链链DNA的的一一类类DNA内内切酶。切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+Bam H定义：定义：目录目录型限制酶同时具有修饰及认知切割的作型限制酶同时具有修饰及认知切割的作用；通常其切割位距离认知位可达数千个用；通常其切割位距离认知位可达数千个碱基之远。碱基之远。、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）分类：分类：作用：作用：目录目录型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列，饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距切割位与认知序列约距24-26个碱基对。个碱基对。型限制酶只具有认知切割的作用。所认型限制酶只具有认知切割的作用。所认知的位置多为短的回文序列；所剪切的碱知的位置多为短的回文序列；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。基序列通常即为所认知的序列。目录目录生理意义：生理意义：与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。目录目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶目录目录类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG目录目录Bam HGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口目录目录来来源源不不同同的的限限制制酶酶，但但能能识识别别和和切切割割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+Bst同功异源酶：同功异源酶：目录目录有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍未端伍未端(compatible end)。Bam Bam HHBg Bg llGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG+ATCTAGGATCTA同尾酶同尾酶名称名称 识别识别序列及切割位点序列及切割位点名称名称识别识别序列及切割点序列及切割点切割后切割后产产生生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后切割后产产生生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后切割后产产生平末端生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶目录目录（三）目的基因（三）目的基因(target gene)cDNA(complementary DNA)指经反转录合成的、与指经反转录合成的、与RNA(通常指通常指mRNA或病毒或病毒RNA)互补的单链互补的单链DNA。以。以单链单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双为模板、经聚合反应可合成双链链cDNA。基因组基因组DNA(genomic DNA)指代表一个细胞或生物体整套遗传信息指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体染色体及线粒体)的所有的所有DNA序列。序列。目录目录 化学合成化学合成从基因组从基因组DNA文库或文库或cDNA文库中获得文库中获得PCR或或RT-PCR获得目的基因的策略获得目的基因的策略目录目录（四）基因载体（四）基因载体 定义定义为携带目的基因进入宿主细胞，实现为携带目的基因进入宿主细胞，实现其在宿主细胞中无性繁殖或表达有意义其在宿主细胞中无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA目录目录克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。目录目录n载体的选择标准：载体的选择标准：能自主复制；能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点。多个单一酶切位点，称为多克隆位点。目录目录1.1.质粒质粒(plasmid)特特点点:能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些些遗遗传信息传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。目录目录 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.2.噬菌体噬菌体(phage)目录目录n噬菌体的基因组噬菌体的基因组目录目录gt系列载体将外来序列插中段，可插入系列载体将外来序列插中段，可插入5-7kb外来外来DNA。EMBL系列载体用外来系列载体用外来DNA替代中段，可插入替代中段，可插入5-20kb外来外来DNA。噬菌体载体可插入的噬菌体载体可插入的DNA长；长；转染大肠杆菌的效率；转染大肠杆菌的效率；可用于构建可用于构建cDNA文库或基因组文库。文库或基因组文库。n噬菌体载体的容量噬菌体载体的容量n噬菌体载体的优点噬菌体载体的优点目录目录 M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列 pUC系列系列目录目录粘性质粒粘性质粒(cosmid)cos序列，再加上质粒序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构多克隆位点等，就可构成粘性质粒载体。粘性成粘性质粒载体。粘性质粒可插入质粒可插入45kb长的长的外源外源DNA目录目录 酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）4.其他其他目录目录二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目录目录（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1.化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列物的氨基酸序列。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3.cDNA文库文库(cDNA library)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)(见第见第22章章)目录目录化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。目录目录基因组基因组DNA文库是指生物的基因组文库是指生物的基因组DNA的的信息（包括所有的编码区和非编码区）以信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。片段形式贮存的克隆群体。从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目录目录（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建目的不同，操作基因的性质不同，目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。载体的选择和改建方法也不同。目录目录（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接1.粘性末端连接粘性末端连接Bam H切割反应切割反应GGATCCCCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCCGGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。目录目录2.平端连接平端连接 限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：适用于：目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目录目录在在末末端端转转移移酶酶(terminal transferase)的的作作用用下下，在在DNA片片段段末末端端加加上上同同聚聚物物序序列列、制制造出粘性末端，再进行粘端连接。造出粘性末端，再进行粘端连接。3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 353 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体5目录目录由平端加上新的酶切位点，再用限制由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。4.人工接头人工接头(linker)连接连接人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目录目录TT+AATaq酶在酶在PCR扩增产物的扩增产物的3末端会多加一个末端会多加一个A，形成仅一个突出形成仅一个突出A的粘性末端。的粘性末端。T 载体有一个载体有一个T核苷酸突出性末端，这样单个核苷酸突出性末端，这样单个T和单个和单个A 通过粘末端连接在一起。通过粘末端连接在一起。拓扑异构酶拓扑异构酶连接酶连接酶T载载体体连连接接目录目录受体菌条件：受体菌条件：安全宿主菌安全宿主菌 DNA、蛋白降解系统缺陷、蛋白降解系统缺陷重组酶缺陷重组酶缺陷导入方式：导入方式：转化转化(transformation)转染转染(transfection)感染感染(infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌目录目录转化：转化：zh.wikipedia.org/wiki/%E7%B4%B0%E8%83%9E细胞细胞通过摄取外源通过摄取外源DNA而发生遗传学改变的过而发生遗传学改变的过程。程。转染：转染：真核细胞由于外源真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的掺入而获得新的遗传标志遗传标志的过程的过程。感染：感染：以病毒颗粒感染方式将外源以病毒颗粒感染方式将外源DNA导入宿主细胞的导入宿主细胞的过程过程。目录目录1.借助遗传标志筛选借助遗传标志筛选(1)抗药性标记选择抗药性标记选择(2)标志补救标志补救(marker rescue)2.序列特异性筛选序列特异性筛选(1)RE酶切法酶切法(2)PCR法法(3)核酸杂交法核酸杂交法(4)测序法测序法3.亲和筛选法亲和筛选法如免疫印迹法如免疫印迹法（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选(插入失活法插入失活法)抗药性标记选择抗药性标记选择互补互补利用利用互补原理筛选重组体互补原理筛选重组体pUC18 原位杂交原位杂交 Southern印迹印迹鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法免疫学方法 目录目录重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为：小结小结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细胞转入受体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体 目录目录重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目录目录表达体系的建立：表达体系的建立：表达载体的构建表达载体的构建 受体细胞的建立受体细胞的建立 表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达目录目录 标准：标准：选择标志选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足表达体系的不足：不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body)；很难表达大量可溶性蛋白。很难表达大量可溶性蛋白。1.原核表达体系原核表达体系(E.coli表达体系最为常用表达体系最为常用)大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌目录目录 优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累表达产物分区域积累 缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济 转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染 电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2.2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱表达载体表达载体YEpI PT的物理图谱的物理图谱目录目录第三节第三节 重组重组DNA技术与医学技术与医学的关系非常密切并前景远大的关系非常密切并前景远大DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective目录目录一、人类基因组计划一、人类基因组计划人类基因组计划是一项规模宏大，跨国跨学科人类基因组计划是一项规模宏大，跨国跨学科的科学探索工程。其宗旨在于测定组成人类的科学探索工程。其宗旨在于测定组成人类染染色体色体的的核苷酸核苷酸序列，从而绘制序列，从而绘制人类基因组人类基因组图谱，图谱，并且辨识其载有的并且辨识其载有的基因基因及其序列，达到破译人及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。基因组计划是是继类遗传信息的最终目的。基因组计划是是继曼曼哈顿计划哈顿计划和和阿波罗登月计划阿波罗登月计划之后，人类科学史之后，人类科学史上的又一个伟大工程。上的又一个伟大工程。目录目录二、生二、生物制药物制药利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为有望成为2121世纪的支柱产业。世纪的支柱产业。美国美国Eli Lilly公司于公司于19821982年首先利用重组年首先利用重组DNADNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有5050多种基因工程药物上市，近千种处于研发多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。了不可估量的社会效益和经济效益。目录目录 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO,酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱
