基因定位与基因克隆.ppt

基因定位与基因克隆基因定位与基因克隆中山大学中山医学院 医学遗传教研室 陈争 常用基因定位的方法常用基因定位的方法 体细胞杂交体细胞杂交 功能克隆和位置克隆功能克隆和位置克隆 连锁分析连锁分析 家系收集家系收集 单倍型分析的用途单倍型分析的用途本节重点本节重点 基因定位基因定位（gene mapping）用不同方法，用不同方法，将基因定位于一特定染色体的将基因定位于一特定染色体的实际位置，并确定基因在染色体上线性排列实际位置，并确定基因在染色体上线性排列的顺序和距离的顺序和距离 基因克隆基因克隆(gene cloning)用一定的方法把不同位点上的基因分离出来用一定的方法把不同位点上的基因分离出来基因克隆基因克隆(gene cloning)功能克隆功能克隆 位置克隆位置克隆 候选克隆候选克隆 功能功能候选候选克隆克隆 位置位置候选候选克隆克隆功功能能克克隆隆(functional(functional cloning)cloning)是是先先研研究究相相关关基基因因的的功功能能，再再定定位位克克隆该基因隆该基因位位置置克克隆隆（positional positional cloning)cloning)是是先先进进行行基基因因定定位位作作图图，然然后后找找到到来来自该定位区的基因并进行克隆自该定位区的基因并进行克隆功能功能制图制图 疾病疾病 基因基因疾病疾病制图制图 基因基因功能功能功能克隆功能克隆位置克隆位置克隆功能克隆功能克隆功能克隆功能克隆定位克隆定位克隆(positional cloning)A AT TGGGGT TC CT TC CA AC CT TGGC CA AA AC CC CGGA AT TGGGGT TC CT TC CA AC CT TGGT TA AA AC CC CGGMetMetValValSerSerLeuLeuGlnGlnProProMetMetValValSerSerLeuLeuStop年代年代 疾病疾病年代年代 疾病疾病 1986慢性肉芽肿瘤慢性肉芽肿瘤Duchenne 肌营养不良肌营养不良视网膜母细胞瘤视网膜母细胞瘤 1993Menkes病病 X连锁无丙种球蛋白血症连锁无丙种球蛋白血症 肾上腺白质营养不良肾上腺白质营养不良1989囊性纤维变性囊性纤维变性 神经纤维瘤神经纤维瘤型型 1990 Wilms瘤瘤神经纤维瘤神经纤维瘤型型 睾丸决定因子睾丸决定因子(TDF)无脉胳膜症无脉胳膜症 Huntington病病 Von Hippel-Lindou病病 脊髓小脑性共济失调脊髓小脑性共济失调型型 Wilson病病 1991脆性脆性X综合征综合征 家族性结肠息肉症家族性结肠息肉症 Kallmann综合征综合征 无虹膜症无虹膜症 1994结节硬化症结节硬化症 多囊肾病多囊肾病1型型 Wiscott-Aldrich综合征综合征 早早 发发 性性 乳乳 腺腺 癌癌/卵卵 巢巢 癌癌(BRCA1)1992肌强直性肌营养不良肌强直性肌营养不良 Lowe综合征综合征 先天性肾上腺发育不良先天性肾上腺发育不良 用定位克隆法鉴定的致病基因用定位克隆法鉴定的致病基因用定位克隆法鉴定的致病基因用定位克隆法鉴定的致病基因年代年代 疾病疾病年代年代 疾病疾病 1995点状软骨发育不全点状软骨发育不全肢带肌营养不良肢带肌营养不良 眼白化病眼白化病 毛细血管扩张性共济失调毛细血管扩张性共济失调 Alzheimer病病(14号染色体号染色体)Alzheimer病病(1号染色体号染色体)低磷酸盐血性佝偻病低磷酸盐血性佝偻病 遗传性多发性外生骨疣遗传性多发性外生骨疣 Bloom综合征综合征 1996Friedreich共济失调共济失调 进行性肌阵挛癫痫进行性肌阵挛癫痫长长QT综合征综合征(11号染色体号染色体)Werner综合征综合征X连锁视网膜色素变性连锁视网膜色素变性(RP3)多囊肾病多囊肾病2型型基底细胞痣综合征基底细胞痣综合征无汗型外胚层发育异常无汗型外胚层发育异常血色病血色病Chediak-Higashi综合征综合征青年的成年期发病型糖尿病青年的成年期发病型糖尿病(MODY)(12号染色体号染色体)定位候选克隆定位候选克隆GDB或或GenBank已知的基因或已知的基因或EST与疾病关系与疾病关系确定致病基因确定致病基因候选克隆候选克隆(candidate cloning)GDB或或GenBank已知基因已知基因已定位的疾病已定位的疾病与该基因关系与该基因关系确定致病基因确定致病基因功能候选克隆功能候选克隆候选克隆候选克隆(candidate cloning)常用基因定位和克隆的方法常用基因定位和克隆的方法染色体多态法染色体多态法比较制图法比较制图法测序法测序法体细胞杂交法体细胞杂交法原位杂交与荧光原位杂交原位杂交与荧光原位杂交连锁分析法连锁分析法染色体畸变法染色体畸变法全基因组外显子测序全基因组外显子测序体体细细胞胞杂杂交交(somatic cell hybridization)又又称称细细胞胞融融合合(cell fusion)，是是将将两两个个同同种种和和/或或不不同同种种的的细细胞胞融融合合成成一一个个新新细细胞胞，即即杂杂种细胞种细胞(hybrid cell)。病毒诱导的细胞融合病毒诱导的细胞融合病毒诱导的细胞融合病毒诱导的细胞融合仙台病毒仙台病毒仙台病毒仙台病毒 化学融合技术化学融合技术化学融合技术化学融合技术聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)电融合技术电融合技术电融合技术电融合技术电穿孔法电穿孔法电穿孔法电穿孔法体细胞杂交体细胞杂交体细胞杂交体细胞杂交体细胞杂交体细胞杂交异双核细胞异双核细胞同双核细胞同双核细胞合核细胞合核细胞杂种细胞杂种细胞 两两个个同同种种的的动动物物细细胞胞融融合合后后形形成成的的杂杂种种细细胞胞，细细胞胞核核一一般般保保留留双双核核的的染染色色体体；不不同同种种动动物物的的细细胞胞融融合合后后，细细胞胞核核含含有有双双核核的的的的染染色色体体，但但随随着着增增殖殖传传代代的的过过程程，会会出出现现保保留留一一方方染染色色体体，另另一方染色体逐渐丢失的现象。一方染色体逐渐丢失的现象。HAT选择系统选择系统1962,人类人类HGPRT-1964,小鼠小鼠TK-H：次黄嘌呤：次黄嘌呤(hypoxanthine)T：胸腺嘧啶：胸腺嘧啶(Thymidine)A：氨基喋呤：氨基喋呤(Aminopterin)HPRTTKHAT选择系统选择系统异双核细胞异双核细胞同双核细胞同双核细胞TKHPRTHAT选择系统选择系统体细胞杂交体细胞杂交TK:chromosome 17原位杂交技术原位杂交技术原位杂交：原位杂交：利用同位素标记的利用同位素标记的DNA探针，探针，与玻片上的中期染色体进行杂交。是一种与玻片上的中期染色体进行杂交。是一种直接进行基因定位的方法。直接进行基因定位的方法。荧荧光光原原位位杂杂交交(FISH)：用用特特殊殊的的荧荧光光素素标标记记DNA探探针针，与与玻玻片片上上的的染染色色体体或或细细胞胞组组织标本进行杂交。织标本进行杂交。1313号染色体号染色体号染色体号染色体2121号染色体号染色体号染色体号染色体荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术12p部分三体部分三体 患者患者FISH结果结果患者母亲患者母亲FISH结果结果连锁分析连锁分析(linkage analysis)：利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。染色体或染色体某一区带上。连锁连锁 交换与重组交换与重组 减数分裂时，同源染色体会发生交换和重组减数分裂时，同源染色体会发生交换和重组,两个基因（标记）之间距离越远，出现交换和两个基因（标记）之间距离越远，出现交换和重组的机会越多；距离越近，机会越少。重组的机会越多；距离越近，机会越少。重组值重组值(recombination fraction)：是基因定：是基因定位时两个基因位时两个基因(遗传标记遗传标记)间遗传图距的量度，间遗传图距的量度，即基因即基因(遗传标记遗传标记)间的遗传距离。间的遗传距离。根据基因的重组根据基因的重组值值(H)来计算两位点之间的遗来计算两位点之间的遗传图距，以传图距，以厘摩厘摩(centimorgan，cM)表示表示 两个遗传座位间有两个遗传座位间有1%1%的重组率即为的重组率即为1cM，1cM约为约为1000kb1000kb A1A2 A2A3 A3A4 A1A2 A1A3 A2A2 A2A3 A4A5 A1A3 A5A6 A2A3 A4A6 A2A4 A1A4 A1A2 A2A3 A3A4 A3A5 A1A5 A1A6 A3A4 A2A4A1=256bp;A2=258;A3=260 A4=264;A5=266;A6=270 常染色体显性遗传病常染色体显性遗传病STR连锁分析连锁分析多点连锁定位多点连锁定位(multipoint linkage mapping)利利用用三三点点交交叉叉法法(three point crosses)，可可将将某某一一致致病病基基因因定定位位于于遗遗传传标标记记的的框框架内，更精确地进行基因定位。架内，更精确地进行基因定位。其其优优点点是是有有助助于于克克服服遗遗传传标标记记的的信信息息有有限限性性，在在不不同同家家系系，不不同同的的遗遗传传标标记记提提供有用信息。供有用信息。ABCabc多点连锁定位多点连锁定位子代类型子代类型 重组位置重组位置数数 目目 853 5 47 95 非重组体非重组体(A，B)-X-CA X (B，C)B X (A，C)ABC/abcABc/abcabC/abcaBC/abcAbc/abcAbC/abcaBc/abc三个基因的排列次序：三个基因的排列次序：ACB遗传距离大约为：遗传距离大约为：A-5.2cM5.2cM-C-9cM9cM-B 大规模全基因组扫描和大规模全基因组扫描和 分型的连锁分析分型的连锁分析 连锁分析与全基因组扫描连锁分析与全基因组扫描(genome-wide search)”策略策略 有表型有表型(遗传性状或疾病遗传性状或疾病)就可以肯定在基因就可以肯定在基因组中有它的基因组中有它的基因 有基因则在基因组中必有其位置有基因则在基因组中必有其位置(位点位点)该位点与基因组中的另一位点该位点与基因组中的另一位点(如多态性的如多态性的遗传标志遗传标志)之间必有某种联系之间必有某种联系 连锁分析的基本原理：连锁分析的基本原理：基因在染色体上呈直线排列，同一染色体基因在染色体上呈直线排列，同一染色体上的基因和上的基因和/或遗传标记形成连锁或遗传标记形成连锁 位于同一条染色体上的两个位点在减数分位于同一条染色体上的两个位点在减数分裂过程中会发生交换与重组裂过程中会发生交换与重组 两个位点之间相距越远两个位点之间相距越远,则发则发 生重组的机率就越高生重组的机率就越高,它们一起它们一起 传给后代的机会就越小传给后代的机会就越小 遗传图谱上基因或遗传标记位点之间的距离遗传图谱上基因或遗传标记位点之间的距离称为图距称为图距(map distance),通常用摩尔通常用摩尔(M)或厘摩尔或厘摩尔(cM)表示表示,它们之间的关系为它们之间的关系为1 摩摩尔等于尔等于100厘摩尔。连锁分析是根据家系中厘摩尔。连锁分析是根据家系中亲代与后代不同基因位点间的基因型估计出亲代与后代不同基因位点间的基因型估计出它们之间的重组率它们之间的重组率,然后利用定位函数将重然后利用定位函数将重组率转换成以组率转换成以M或或cM为单位的图距为单位的图距DNA 遗传多态性标志遗传多态性标志RFLP：分布不均匀：分布不均匀，信息量低，信息量低VNTR：信息量高，用：信息量高，用Southern印迹分析印迹分析STR：信息量高，：信息量高，6-10Kb一个，可用多重一个，可用多重PCR分析分析SNP：信息量低，但分布广，平均：信息量低，但分布广，平均1Kb一个，一个，可用自动化分析，现已有可用自动化分析，现已有1；5；10；50万万密度全基因组扫描芯片密度全基因组扫描芯片 当发现家系中疾病位点与某个遗传标志之当发现家系中疾病位点与某个遗传标志之间毫无连锁间毫无连锁(重组率重组率=50%)的证据时的证据时,则可则可将其从该遗传标志附近将其从该遗传标志附近“排除排除”;如果发现如果发现它与某个遗传标志之间有一定程度的连锁它与某个遗传标志之间有一定程度的连锁(0 重组率重组率 50%),则知道疾病位点已在该则知道疾病位点已在该遗传标志附近遗传标志附近;如果它与某个遗传标志之间如果它与某个遗传标志之间没有重组没有重组(重组率重组率=0),而个体数而个体数(即减数分即减数分裂事件裂事件)又达到统计学要求又达到统计学要求,这时便可知道这时便可知道该遗传标志已经非常靠近疾病位点该遗传标志已经非常靠近疾病位点一一、家系的收集与处理家系的收集与处理用于连锁分析的理想家系用于连锁分析的理想家系:诊断准确诊断准确,且为迁移较小、相对封闭的人群且为迁移较小、相对封闭的人群家系的数目及大小需达到一定要求家系的数目及大小需达到一定要求有明确的遗传相关数据有明确的遗传相关数据,如遗传方式、遗传如遗传方式、遗传度、外显率等度、外显率等 疾病家系的选择与评估疾病家系的选择与评估:疾病家系越大越好。据一般的经验公式疾病家系越大越好。据一般的经验公式,一一个有个有40 多个能提供信息多个能提供信息减数分裂事件减数分裂事件的三的三代以上的家系，基本上可得到代以上的家系，基本上可得到“肯定连锁肯定连锁”的证据的证据 不管是大家系还是小家系不管是大家系还是小家系,对每一个体的诊对每一个体的诊断是至关重要的断是至关重要的 注意发病的时间性、治疗效应和发病年龄注意发病的时间性、治疗效应和发病年龄 、发病史、发病史 家系材料的收集与保存：家系材料的收集与保存：组织样本：包括血液及血液滤纸片、活检组织样本：包括血液及血液滤纸片、活检组织及切片、分离的细胞株、毛发、唾液组织及切片、分离的细胞株、毛发、唾液滤纸片等，可在滤纸片等，可在-70或或液氮中保存液氮中保存DNA标本：收集到的血液样本应按严格的标本：收集到的血液样本应按严格的方法进行方法进行DNA 抽提和纯化，抽提和纯化，-20-70中中保存保存临床资料：临床症状、发病情况、家族史临床资料：临床症状、发病情况、家族史临床检验结果和家系图临床检验结果和家系图家系分析应注意点：家系分析应注意点：临床资料完整准确临床资料完整准确注意注意外显不全外显不全和迟发显性现象和迟发显性现象遗传异质性遗传异质性基因多效性基因多效性非孟德尔遗传现象非孟德尔遗传现象X X染色体失活染色体失活现象现象 STR 的选择与制备的选择与制备 选择选择STR 一般应达到在染色体上平均覆盖一般应达到在染色体上平均覆盖5 10 cM 左右。随后合成扩增这些左右。随后合成扩增这些STR 的的PCR引物引物,并分别于其中的每一条引物并分别于其中的每一条引物5 端端引入几种不同的荧光染料引入几种不同的荧光染料(如如6-FAM、HEX、TET)进行标记。目前商品化的进行标记。目前商品化的ABI PRISM TM Linkage Mapping Set(PE公司出品公司出品)共包含共包含400 个个STR,分辨率分辨率 10 cM,覆盖覆盖人类整个基因组，而且杂合度高人类整个基因组，而且杂合度高 PCR 反应反应 PCR 反应于反应于96 孔板中进行孔板中进行(现多采用在同现多采用在同一反应管中进行多重一反应管中进行多重PCR 反应反应,使使PCR 扩扩增过程更加迅速和方便增过程更加迅速和方便,而且而且 PCR 反应液反应液的制备可由与其它设备配套的机器手完成的制备可由与其它设备配套的机器手完成取样和加样等过程取样和加样等过程),反应终止后的反应终止后的PCR 产产物经物经95 热变性后即可用于电泳检测热变性后即可用于电泳检测 电泳检测电泳检测 PCR 产物的检测过程是在自动激发荧光产物的检测过程是在自动激发荧光DNA 测序仪上进行的。当产物在测序胶中测序仪上进行的。当产物在测序胶中进行电泳时进行电泳时,测序仪上的特殊激光探头可激测序仪上的特殊激光探头可激发荧光发荧光,并扫描每一泳道的并扫描每一泳道的PCR产物分子量产物分子量大小。同时大小。同时,与测序仪联接的计算机可直观与测序仪联接的计算机可直观地将每一产物的产量及分子量大小用曲线地将每一产物的产量及分子量大小用曲线峰谱表示出来峰谱表示出来,再用相应的软件系统将电泳再用相应的软件系统将电泳检测到的数据进行处理检测到的数据进行处理 自动基因分型自动基因分型 主要是应用主要是应用GENSCAN 和和Genotyper 软件软件完成完成 分型步骤分型步骤:准确测量每一泳道内的分子量内标准确测量每一泳道内的分子量内标,然后然后依靠内标绘出分子量的回归曲线依靠内标绘出分子量的回归曲线 进一步确定每个峰的真实性进一步确定每个峰的真实性对各产物做深入的检测从而根据回归曲线对各产物做深入的检测从而根据回归曲线确定每一产物的分子量大小确定每一产物的分子量大小,并由此转化为并由此转化为片段长度大小片段长度大小对产物进行孟德尔遗传模式的校对与检查对产物进行孟德尔遗传模式的校对与检查确定每一产物的基因型并储存起来确定每一产物的基因型并储存起来,以进行以进行下一步的分析下一步的分析 基因组扫描综合分析基因组扫描综合分析 经上述处理后的数据输入相应的软件经上述处理后的数据输入相应的软件(如如LINKAGE等等)进行进行Lod 值的计算值的计算,并与家并与家系分析得出的数据进行综合处理系分析得出的数据进行综合处理,从而得从而得出每一个微卫星遗传标志的两点连锁分析出每一个微卫星遗传标志的两点连锁分析Lod 值和多点连锁分析值和多点连锁分析Lod 值值 LOD 值值(LOD-score)法法 又称优势对数法，最初由又称优势对数法，最初由Haldane 和和Smith(1947)在分析人类控制色盲和血友病的性连锁基因在分析人类控制色盲和血友病的性连锁基因的重组率时提出。现在广泛应用于遗传标记之间或的重组率时提出。现在广泛应用于遗传标记之间或遗传标记和单基因控制的质量性状之间连锁分析。遗传标记和单基因控制的质量性状之间连锁分析。LOD 值法实际上是一种最大似然分析方法值法实际上是一种最大似然分析方法,只是只是在求解重组率的最大似然值时不用常规的数值迭代在求解重组率的最大似然值时不用常规的数值迭代法法,而是采用一种变形的格点搜索法而是采用一种变形的格点搜索法 对对于于单单基基因因病病，若若某某一一遗遗传传标标志志的的Lod值值大大于于3,则则可可认认为为该该遗遗传传标标志志与与致致病病基基因因连连锁锁。这这样样即即可可将将致致病病基基因因定定位位于于这这一一染染色色体体的的这这一一区区域域内内；-2 Lod 3,不不肯肯定定连连锁锁；Lod G(Y460C),酪氨酸被半胱氨酸替代；酪氨酸被半胱氨酸替代；c.3640CG(P1195A),脯氨酸被丙氨酸替代。脯氨酸被丙氨酸替代。200例正常对照及突变患者双亲未发现例正常对照及突变患者双亲未发现ZNF407基基因的错义突变。因的错义突变。保守性分析保守性分析 460位点高度保守，位点高度保守，1195位点中度保位点中度保守，在守，在Gallus由由P变为变为A。c.1436AGp.Tyr460Cysc.3640CGp.Pro 1195AlaHomo sapiensBos TaurusMus musculusCanis lupus familiarisEquus caballusGallus gallusMonodelphisNomascus leucogenysSus scrofaHomo sapiensBos TaurusMus musculusCanis lupus familiarisEquus caballusGallus gallusMonodelphisNomascus leucogenysSus scrofa 经经PloyPhen与与PloyPhen-2的预测这两个突变为的预测这两个突变为有害突变。有害突变。JPRED3对蛋白质二级结构的预测发现这两个位对蛋白质二级结构的预测发现这两个位点的突变对该段多肽链所形成的扩展链点的突变对该段多肽链所形成的扩展链(E)，螺螺旋旋(H)的数量及分布一定的影响。的数量及分布一定的影响。这两个点突变均导致了锌指蛋白指样结构间连接这两个点突变均导致了锌指蛋白指样结构间连接区氨基酸的改变，而连接区对于锌指蛋白结构的区氨基酸的改变，而连接区对于锌指蛋白结构的完整性及粘合性完整性及粘合性(binding properties)至关重要。至关重要。谢谢！